Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é uma pequena espécie de teleósteos originárias da Índia que é um organismo modelo útil para um comportamental e médica 2,3 pesquisa. Peixe-zebra também são vulgarmente usado nos testes de várias substâncias farmacológicas, a fim de caracterizar o seu impacto sobre o comportamento. Vários dosagens e horários de administração de medicamentos têm sido utilizados para investigar o comportamento do peixe-zebra, após a administração de compostos tais como estimulantes 4, 5 e ansiolíticos etanol 6-8.
Nosso laboratório tem investigado os efeitos de diferentes horários de administração de etanol sobre a ansiedade de peixe-zebra e locomoção no claro / escuro de ensaio bem validado 9, 20, também comumente referido como o ensaio scototaxic. Um novo método de administração de etanol foi desenvolvido para aumentar a eficiência de repetitivo, a administração diária ao longo de um longo período de tempo (21 dias) 6 10-12. Enquanto este método é amplamente aceite, a compensação de peixe-zebra pode aumentar a variabilidade no tempo necessário para introduzir e remover o peixe a partir da solução da droga. Portanto, a exposição exacto para o composto de interesse pode variar durante o curso de uma experiência que envolve a administração repetida. Um método que reduz as fontes de decorrentes da variabilidade nos tempos de transporte de erro é, portanto, desejável. Com o nosso método, somos capazes de mover todos os peixes ao mesmo tempo, resultando em um tempo de dosagem idêntica em cada peixe. Após a exposição ao etanol (descrito aqui), peixe-zebra pode ser testado em qualquer númer de ensaios comportamentais, incluindo aqueles que avaliam a ansiedade. Dosagem grupos de peixes usando o novo método tem usos práticos além da capacidade de reproduzir com exatidão e padronizar a dosagem entre sujeitos e entre grupos de peixes. O advento de um novo software que permite o rastreamento de peixes múltiplos de uma só vez pode ver os pesquisadores utilizam nossos métodos para garantir a replicabilidade e precisão em seus experimentos. Considerando-se a utilização generalizada de peixe-zebra como um organismo modelo para neurociência comportamental, este método vai aumentar a eficiência e viabilidade em futuros estudos farmacológicos.
No presente paradigma, um esquema de dosagem repetida foi empregado que aproximadamente espelha horários de consumo humano. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos: controle, diária moderada, ou semanal-compulsivos. O esquema de administração foi de 21 dias de duração, escolheu porque excedeu significativamente os tempos de exposição em estudos anteriores 7. Peixes controle recebeu a zero alcohol, peixe diariamente moderada receberam 0,2% de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu 1,4% de álcool, uma vez por semana. A tarefa de luz / escuro foi usado para avaliar a ansiedade após 2 dias de abstinência. Este é um teste relativamente simples de administrar, que utiliza uma arena rectangular em que as paredes de um lado, são de cor branca e no outro lado são escuros 9. Peixe-zebra adulto robustamente preferem o lado negro da arena em condições de controle 6,9,13. O aumento da ansiedade é operacionalmente definido como significativamente mais tempo gasto na zona escura, e diminuiu a ansiedade pode ser assumida quando o peixe passa relativamente mais tempo gasto na zona de luz. Com o software de rastreamento de movimento, outras variáveis informativos também podem ser quantificados, incluindo velocidade média, a imobilidade, serpenteando, e zona de transição 14.
O método de dosagem desenvolvido no nosso laboratório pode aplicar-se a qualquer pesquisa em que os compostos solúveis em água são administrados a um ou mais zebrafish. Muitos outros agentes farmacológicos que podem beneficiar desta metodologia estão sendo testadas em peixes-zebra. Comumente os compostos testados incluem a nicotina, clordiazepóxido, buspirona, e escopolamina, que são dissolvidos de um modo semelhante ao etanol; misturando a quantidade apropriada do produto químico em água. Portanto, o escopo geral deste procedimento é muito mais ampla e não limitada ao etanol. Além disso, após a dosagem com medicamentos para vários dias, a tarefa de luz / escuro é apenas um dos muitos testes comportamentais que podem ser empregadas. Após a administração de drogas ou durante a abstinência, outros ensaios populares que podem ser utilizados incluem o teste de mergulho novo tanque de 15 e testes de comportamento social, tais como empolamento 16. O procedimento a seguir irá delinear um método eficiente de repetidamente transferir grupos de peixes ou peixes individuais em soluções que contêm um composto farmacológico de interesse. Além disso, o processo de teste de ansiedade com o teste de luz / escuroem grupos de peixe que se encontram em retirada depois de ser exposto a longas listas da administração do álcool irá ser descrito.
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Protocol
Todos os procedimentos e testes comportamentais foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade MacEwan sob o protocolo número 06-11-12, que está em conformidade com o Conselho Canadense para as diretrizes do Animal Care para o cuidado e uso de animais de experimentação.
1. Prepare Tanques Dosagem, soluções e esquema de administração
- Preparar um esquema de administração de tal modo que os animais são doseados no mesmo ambiente e durante o mesmo tempo do dia a fim de evitar quaisquer confunde de tempo ou de polarização a estímulos visuais.
- Obter o maior número, 1,5 L, tanques de desova de polipropileno claras idênticos como necessárias para o número de tamanhos de grupo. Utilização grupos de 8 peixes por tanque, o que permite por 2 grupos de peixe a ser testado por dia mais tarde no procedimento (ver etapa 3). Use um tanque de retenção e um tanque de dosagem por grupo (2x número total de grupos).
- Coloque 400 mm em todas as inserções de desova tanques de retenção. Fmal os tanques com água habitat ou água de osmose reversa na temperatura correta (de peixe-zebra, 25-28 ° C), que é consistente com o peixe temperatura são normalmente alojados em.
NOTA: Não pode haver interações químicas indesejadas entre algumas drogas e os componentes químicos da água habitat tamponada. Nesta situação, usar água de osmose reversa tamponada com sais de aquário mínimo ou nenhum para a administração da droga, bem como para os grupos de controle. - Certifique-se de que os tanques estão em um ambiente neutro para evitar peixes condicionado a estímulos visuais externos durante a administração.
- Coloque 400 mm em todas as inserções de desova tanques de retenção. Fmal os tanques com água habitat ou água de osmose reversa na temperatura correta (de peixe-zebra, 25-28 ° C), que é consistente com o peixe temperatura são normalmente alojados em.
- Preparar a solução de fármaco. Misturar a quantidade apropriada de água com a droga habitat nos tanques de desova. Preparar a solução de etanol a 0,2% por combinação de 3 ml de um etanol de alto grau (95% de etanol não desnaturado) com 1,497 ml de água. Preparar a solução de etanol a 1,4% por combinação de 21 mL de etanol com 1479 ml de água.
2. A compensação Peixes e Ethanol Procedimento Administração
- Peixe cuidadosamente líquida de seus tanques de habitats e transferência para o tanque de retenção apropriado contendo a inserção de desova. Idealmente, abrigar o peixe na inserção de desova para eliminar compensação por completo.
- Com todos os peixes em seus respectivos tanques de retenção, levante com cuidado a desova inserir fora do tanque de retenção e colocá-lo no tanque de solução droga apropriada (Figura 1A).
- Anote o tempo de dosagem, conforme necessário. Use 30 min em solução de etanol para o processo descrito aqui.
- Se possível, tenha assistentes ajudar com a transferência de todos os grupos experimentais para a solução da droga ao mesmo tempo para garantir o tempo de dosagem precisa. Em alternativa, transferir um grupo de cada vez e manter o controle de dosagem vezes (Figura 1A) 'grupos individuais.
- No final do período de dosagem necessária, remover o peixe a partir da solução de etanol com cuidado levantando a inserção de desovapara fora da solução do fármaco e colocando suavemente de volta para o tanque de retenção.
- Gentilmente net o peixe nos tanques de conservação e colocá-los de volta para seu habitat até a próxima vez a administração programada, ou coloque a desova inserir de volta para o tanque de retenção para eliminar compensação.
- Como mencionado anteriormente, se possível, dentro dos parâmetros do equipamento de animais habitação, casa dos animais do mesmo tanque de desova e inserção que é utilizada como o tanque de retenção. Isto irá eliminar compensação completamente durante o processo de administração.
3. Teste Comportamental
- Obter uma luz / escuro arena de 9,5 centímetros de largura por 55 cm de comprimento e 9,5 cm de profundidade com um piso impermeável branco (Figura 1B). Cole papel não-reflexiva impermeável branco e preto para as paredes internas da arena usando velcro, com metade da arena coberta de branco e metade coberto de preto. Encher a arena a uma profundidade de 5 cm de altura com água a uma temperatura de habitat de 25-28 ° C. Manutain esta temperatura durante todo o teste.
- Minimalize estímulos visuais externos através da construção de um cerco de três lados branco para a arena para situar-se em. Certifique-se de área de testes tem difundir iluminação superior que não causa reflexos na superfície da água, mas é suficientemente brilhante para o software de rastreamento de movimento, ou pós quantificação manual do -hoc a partir de imagens de vídeo.
- Coloque a arena no recinto e definir os parâmetros de gravação e análise de movimento do software de rastreamento de comportamento. Defina a duração de teste para 5-15 min, dependendo da questão de pesquisa.
NOTA: Aqui, usamos 5 min. - Transportar o grupo de peixes a ser testado para a área de pesquisa no tanque de habitat e colocá-los do lado de fora do gabinete arena. Aclimatar o peixe por 10 min.
- Gentilmente net um peixe do grupo e local apropriado no centro da luz / Arena escuro, tendo a certeza de soltar o peixe quando é posicionada paralela ao longo eixo da arena para avoID de influenciar os resultados do peixe para a luz ou zona escura.
- Comece comportamento gravação imediatamente depois que o animal é liberado. Preste atenção para os problemas de software com acompanhamento de peixe ou de peixe que salta ou congelamento. Girar a arena 180 ° depois de metade dos sujeitos foram testados para prevenir quaisquer confunde devido a preconceitos resultantes da qual a extremidade da arena está orientado para a extremidade aberta do invólucro.
- Após o julgamento terminou, gentilmente net e retire o peixe da arena para um tanque ou tanque de habitat.
4. Análise
- Examine o tempo gasto na luz contra as zonas escuras. Para cada grupo e cada peixe, obter o tempo relativo gasto nas zonas claras e escuras e analisar usando um teste t uma amostra (ou teste de Wilcoxon para dados não paramétricos; diferença de (metade do tempo de julgamento total) 150 sec) para determinar se os grupos preferem significativamente uma área sobre a outra.
- Para comparar preferências, calcular a prefeíndice de rence, subtraindo o tempo gasto na zona de luz a partir do tempo gasto na zona escura e comparar as diferenças entre grupos. t- testes pode ser utilizado para comparar dois grupos. Compare vários grupos com um one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário.
- Compare a velocidade, número de transições de zona, sinuosos, e imobilidade entre os grupos. Use one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário.
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Representative Results
Para manter a precisão e controlo em estudos farmacológicos com peixe-zebra é importante para o tempo de duração da administração de etanol de forma consistente e com precisão, tal como descrito acima. O nosso procedimento pode aumentar o rendimento e a facilidade do procedimento de dosagem. A administração de etanol no horário ou uma compulsão semanal ou diária moderada resultou em níveis de ansiedade alterados, medidos com o teste de claro / escuro, em comparação aos controles. Quando testados dois dias após a última dose, peixe-zebra no grupo de controle (que não recebeu nenhum álcool, mas ainda assim foram transferidos para tanques de dosagem) exibido o padrão esperado de comportamento, com os gastos peixes controle muito mais tempo no lado escuro da arena ( Figura 2A) semelhante ao peixe-zebra ingênuo em outros estudos 6,9,13. Peixe no grupo binge semanal não mostrou preferência por zonas ou a claras ou escuras na tarefa quando testados dois dias depois de sua última administração de etanol (Figura 2B (Figura 2C); em contraste com o grupo de controlo. O índice de preferência indicou uma diferença significativa entre os grupos controle e diária moderada (Figura 2D). Não houve diferenças significativas na velocidade de natação, ou a imobilidade entre os grupos (Tabela 1), e, por conseguinte, este efeito não foi devido a um défice motor no peixe.
Figura 1:. Transferência de Procedimento e Luz / Arena escuro Estas fotos ilustram o procedimento de transferência (A) Em primeiro lugar, os peixes estão situados no tanque de transferência (à esquerda).. Dosagem tanque contendo etanol é retratado (direita). (BC) Mover o peixe do tanque de transferência para a solução de etanol requer a researcher para levantar a inserção de desova fora do tanque de transferência e para o tanque de solução de etanol. (D) A luz / escuro como ilustrado arena de 9,5 centímetros de largura medida de 9,5 cm de profundidade e 55 cm de comprimento. Piso branco é usado, juntamente com as paredes pretas na metade da arena (esquerda) e paredes brancas na outra metade, criando uma zona de luz e escuridão.
Figura 2: Os resultados representativos e trackplots do procedimento de dosagem de etanol em três grupos de peixes-zebra, após dois dias de abstinência. (A) A trackplot representante de um caminho único movimento de controle em todo o peixe-zebra 5 min de luz / escuro julgamento. Abaixo é o mesmo trackplot peixe-zebra representado como um mapa de calor, que é uma representação de cor do peixe-zebra movimento ao longo do ensaio, com base no tempo gasto o peixe no local representado por cada pixel. (B) A represtrackplot tante de um único peixe-zebra do grupo semanal-binge em todo o 5 min de luz / escuro tarefa. Abaixo está o mapa de calor do mesmo peixe-zebra. (C) A trackplot representante de um movimento único peixe-zebra diária moderada em toda a 5 min de luz / escuro julgamento. Abaixo está o mapa de calor do mesmo peixe-zebra. (D) O índice de preferência foi calculado para todos os grupos de tempo gasto na zona de luz do tempo gasto na zona escura subtração. Os números negativos indicam preferência pela zona escura. Números positivos indicam preferência para a zona de luz. Os resultados indicam uma diferença significativa na preferência entre os grupos controle e diariamente moderadas em dois dias de retirada * p <0,05 (one-way ANOVA). Nota há também uma significativa preferência por escuro no grupo de controlo, p <0,05 (teste t uma amostra, diferença entre 0), e uma significativa preferência por luz no grupo diária moderada, p <0,05 (uma amostra <em> t -teste, diferença de 0). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Velocidade | Imobilidade | |
| (Cm / seg) | (Seg) | |
| 2 dias Wd | 2 dias Wd | |
| Controlo (n = 13) | 9,1 ± 0,6 | 1,9 ± 0,6 |
| Compulsão (n = 14) | 9,8 ± 0,5 | 0,8 ± 0,2 |
| Crónica (n = 15) | 10,3 ± 0,5 | 2,5 ± 1,0 |
Tabela 1: Velocidade média e imobilidade durante o teste de claro / escuro. A velocidade média de natação (cm / seg) e imobilidade (seg) de um grupo representativo de peixe-zebra, após 2 dias de abstinência (média ± SEM). Aqui, não foram encontradas diferenças significativas em qualquer velocidade ou imobilidade. Usado com permissão de Holcombe et al., (2013).
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Discussion
Estudos anteriores envolvendo a administração da droga no peixe-zebra simplesmente invocada compensação peixes para transportá-los a partir de seu tanque de casa para a solução de drogas 12,16. Rede nem sempre é consistente e frequentemente leva mais tempo do que o esperado, devido à resposta de fuga do peixe-zebra, que tem variabilidade individual significativa. Métodos de transferência tradicionais, embora úteis, pode ser melhorado através da diminuição da quantidade de tempo total dos peixes passar do lado de fora da água, assim como diminuir a quantidade de variabilidade no tempo de transferência entre os animais. Além de melhorar a praticabilidade, este método dá investigadores a capacidade para dosear grandes grupos de peixes simultaneamente numa solução para uma quantidade precisa de tempo. Métodos anteriores requerem ou dosagem de um único peixe, ou a tentativa de um lucro líquido de toda grupos de peixes ao mesmo tempo. O primeiro é lento e diminui o rendimento, enquanto que o último é uma tarefa difícil e incómodo. Além disso, os sistemas de rastreamento de movimento que cuma avaliação do comportamento dos peixes múltiplos de uma só vez pode se beneficiar com a precisão do método. Peixe pode ser transferido diretamente a partir da inserção de desova para a arena empolamento, o que garantiria perto a exposição simultânea a arena para todos os peixes.
Utilizando esse novo método produziu resultados significativos quando implementado em três grupos de peixes-zebra ao longo de um período de 21 dias. Peixes controle recebeu nenhum álcool, peixe diariamente moderada recebeu uma pequena quantidade de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu uma grande dose de álcool uma vez por semana durante o período de 21 dias. Na tarefa de luz / escuro, o procedimento de dosagem não alterou a preferência normal do peixe-zebra para a zona escura sob condições de controlo. No entanto, após 2 dias de retirada do etanol, peixe-zebra no grupo diária moderada preferido a zona de luz da arena, uma reversão de preferência. A análise estatística confirma uma mudança significativa na zona de preferências. É possível que o doseamento procedure resultou em etanol, devido ao comportamento de procura de um lugar de preferência condicionada (CPP), com a procura de peixe etanol (um estímulo appetitive), e preferindo a zona de branco devido à sua semelhança em relação à área de doseamento brilhante. Uma pesquisa recente revela que a PPC pode ocorrer em peixes-zebra e em áreas onde peixe-zebra são doseados com etanol 17,18. Weekly binge-peixe não mostraram preferência dois dias postar etanol, e apesar de evidências sobre os mecanismos neurais responsáveis por esse achado está faltando, é possível que doses esporádicas, mas grandes de álcool pode danificar o cérebro, possivelmente deixando peixe incapaz de discriminar entre as zonas.
Outra vantagem que este procedimento de dosagem confere pesquisadores é a sua generalização. Como descrito, o procedimento produz resultados claros e úteis no peixe-zebra. No entanto, o procedimento não se limita apenas ao peixe-zebra. As restrições sobre o processo estão relacionadas com o tamanho e limites dos tanques de dosagem, os animais e testing aparelho, assim como a capacidade para analisar os dados. Com o uso do software de rastreamento de movimento, estudos recentes têm investigado muitas variáveis adicionais ao longo de um julgamento. Branco habituação evasão, praças cruzados, locomoção habituação, a latência para a zona branca, natação errática, thigmotaxis (tempo gasto perto das muralhas de arena), e avaliação de risco também podem ser quantificados 14. É concebível utilizar este procedimento em outros organismos modelo, como o peixinho, que foram anteriormente utilizados para investigar o papel da tolerância e retirada 19. Os investigadores que esperam para investigar os efeitos de outros agentes farmacológicos ou toxinas ambientais, a utilização de outros ensaios comportamentais, ou outros animais marinhos ou de água doce, também poderia utilizar esta metodologia básica.
Usando este protocolo é simples e eficaz. No entanto, se os resultados não forem os esperados, considere a solução de problemas do sistema de rastreamento de movimento para garantir a coleta de dados adequada. Tracking deve ser suave e preciso em todos os ensaios. O sistema de seguimento deve ser gravar o movimento do centro do corpo-a do peixe em todos os momentos. Qualquer salto ou movimento errático do rastreamento ponto devido a artefatos visuais, tais como reflexos de luz em ondinhas da água, ou as configurações de rastreamento inadequados podem confundir os resultados. Algumas discrepâncias nos resultados podem surgir a partir de pequenas diferenças no desenho arena ou ambientes de dosagem. Para ter a certeza de replicação, a arena deve ser tal como descrito, particularmente no que diz respeito ao uso de um chão branco para maximizar a eficiência de rastreamento em peixes-zebra. Com outros peixes que são de cor mais clara, um piso escuro deve ser usado para ajudar no rastreamento de movimento. Da mesma forma, a dosagem do peixe em um ambiente que é livre de quaisquer estímulos visuais que poderiam influenciar o peixe é extremamente importante. Qualquer cor distinta, padrão ou matiz que é perceptível para os peixes poderiam confundir os resultados. A, de cor clara fundo neutro semelhante à do sistema de habitação é recomendada. </ P>
Embora seja possível modificar este método como necessário para outras espécies de peixes, os resultados podem variar em termos de luz inata / preferência escuro 20-21. É também importante notar ainda o processo descrito aqui ainda faz com que algum stress. Embora a compensação é significativamente reduzida, o procedimento ainda envolve um período muito curto de tempo em que os peixes devem estar fora de água, eventualmente induzir uma resposta ao estresse. Ramsay e seus colegas descobriram que 22 zebrafish rendeu teve, pelo menos, o dobro dos níveis de cortisol em seu corpo em comparação com aqueles que não foram compensados. Desde cortisol é um hormônio ligado ao estresse 11 isso pode alterar a resposta comportamental que é medido. Enquanto o nosso método reduz compensação, não eliminá-lo. No entanto, ele dá aos pesquisadores a oportunidade de eliminar a incidência da compensação, se o desejarem por peixe-zebra habitação nas inserções de desova. Estudos futuros devem investigar se o uso da inser desovat para a transferência de peixe pode diminuir a resposta ao estresse em relação à compensação. Além disso, é extremamente importante para manter a administração vezes precisas e transferir vezes entre os grupos. Mudanças nas vezes ou grandes diferenças de dosagem no tempo gasto fora da água poderia alterar os resultados. Para reduzir possíveis efeitos circadianos, também é fundamental para dosar o peixe durante tempos semelhantes do dia. Na atual peixe experimento foram dosados e testados dez horas - duas horas. Replicação exata e confiável deste procedimento baseia-se em repetir o protocolo com precisão.
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Disclosures
Os autores reconhecem Joshua Gallup para o uso de seu equipamento de fotografia utilizada para a Figura 1. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia (NSERC) Canadá Descoberta de subvenção (para TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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