Introduction
단백질 발현 수준을 확인하고 정량 할 수있는 것은 동물성 및 세포 기반 실험을위한 표준 기술이다. 그러나,에도 불구하고 오랜 현재 병아리와 마우스 1, 2 모두에서 면역 조직 화학 염색으로 제한됩니다 개발 과정이 특정 조직에서 단백질 발현을 평가, 초기 배아 심장 밸브 개발에 관심을. 대부분의 모델 유기체 (예, 마우스 및 병아리)의 현상 밸브에서 단백질 발현을 정량화하는 어려움의 일부를 얻을 수있다 단백질의 양을 제한하는 밸브의 작은 크기이다. 따라서, 정량 분석을 위해, 연구원은 일반적으로 다음 정량 PCR이나 마이크로 어레이 분석 2-5 RNA 추출 및 증폭에 의존하고 있습니다. 그러나, RNA 및 단백질 발현 수준은 6 전적으로 상관 아니므 RNA 발현에 집중하면 특정 신호 발생 수많은 변화 엄격한 계정을 제공 할 수 없다개발하는 동안 여러 번 통로입니다. 현재 가능한 방법이 한계에 기초하여,이 절차의 목적은 안정적으로 중요한 다양한 신호 경로에서 발생하는 변화의 정량적 분석을 위해 개발 배아 마우스 심장 밸브 영역에서 단백질의 충분한 양을 획득하기위한 프로토콜을 개발하는 것이었다 이 조직의 성숙.
배아 밸브 이미 일반적으로 RNA 분리 및 후속 유전자 발현 분석을위한 2-5 생쥐 해부된다. 그러나, 이들 연구는 하류 시그널링에 영향을 미칠 수있는 번역 후 단백질 변형을 검출의 검출을 허용하지 않는 경로를 활성화, 신호의 판독으로 유전자 발현을 사용하여 한정 하였다. 출발점으로 RNA 분리 기법을 사용하여, 관심 영역을 해부 시작되었다. 우리의 관심은 인산화 된 단백질을 검출 되었기 때문에 신호 확실 나타내는라고대동맥 판막 개발 (E13.5-14.5)의 특정 기간 동안 hway 활동, 우리는 포스페이트없는 트리스 완충액에서 모두 박리를 수행 프로테아제 및 포스파타제 억제제 트리스 계 용해 완충액에 밸브를 모았다. 우리의 특정 경우에만 대동맥판 영역은 회수하고 있지만, 폐동맥 판막 영역 용이 동시에 얻을 수 있었다. 밸브 영역은 균질화 현재 성인 심장 밸브 (7)의 단백질 발현을 연구하는 데 사용되는 샘플 완충액과 혼합 하였다. 작은 샘플 볼륨 (예를 들어, 2 μL)를 사용하고 동일한 유전자형 배아에서 밸브 영역 풀링함으로써 배아 일 13.5 8에서 인산화 및 비 인산화 된 단백질을 검출 할 수 있었다. 밸브 영역 동결 및 용해 버퍼에 저장 될 수 있기 때문에 풀링하기 전에, 필요한 경우, 배아는 유전자형을 할 수있다.
이 기술은 셀 signalin 평가에 사용할 수있는 툴 세트를 넓게g 개발 중에 경로와 특별히 개발 심장 밸브에 대한 면역 조직 화학 염색에 대한 정량적 칭찬을 제공합니다. 이 기술은 발달 심장병 전문의로뿐만 아니라 제한적인 조직을 포함하는 지역에 관심이있는 초기 단계의 배아에서 작동하는 모든 발달 생물 학자뿐만 아니라 도움이 될 것이다.
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Protocol
참고 : 모든 실험 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1 소비세 대동맥판
- 관심 배아 스테이지 안락사 승인 기술을 사용하여, 개발의 목적 배아 일 (E)에서의 새끼와 임신 마우스를 안락사.
- 임신 여성의 복부를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 멀리 내부 장기에서 낮은 복부 위쪽의 피부와 근육을 들어 올리고 자궁 뿔에 액세스 할 수 있도록 열려있는 여성의 낮은 복강을 절개.
- 자궁 경적을 검색하려면 집게에 집게로 자궁 경부 조심스럽게 잘라 꼬리를 개최합니다. 장소에 혼을 유지하는 결합 조직을 절단, 자궁 경적을 들어 올리고 난관과 자궁 뿔의 접합을 절단하여 제거를 완료합니다.
- 페트리 접시 포함 COL에 해부 자궁 경적을 배치D 0.1 M 트리스 완충액 (pH 7.6) 및 필요에 따라 린스. 그런 다음, 오픈 길이 현명한 배아 주머니를 노출하는 자궁 뿔을 잘라.
- 배아를 표시하려면, 태반 및 태아의 교차점에서 배아 주머니를 열고 잘라 배아를 무료로 제대 혈관을 잘라. 차가운 0.1 M 트리스 버퍼를 가지는 초 페트리 접시에서 해부 배아를 놓습니다. 다음 배아에 대한 준비가 될 때까지 얼음에 나머지 undissected 배아와 첫번째 페트리 접시를 돌려줍니다.
- 배아 내의 흉벽 접근을 개선하기 위해 배아를 참살. 유전자형이 필요한 경우 제거하고 얼음에 배치 된 에펜 도르프 튜브에 여분의 조직 일부를 저장한다.
- 그 뒷면에있는 배아를 놓고 앞다리 근처, 흉곽의 측면을 따라 수직으로 가슴 벽을 잘라 수평 격막 위의 마음을 시각화 할 수 있습니다. 그런 마음을 노출하는 가슴 벽을 엽니 다.
- 대 혈관을 따라 높은 잡아 집게를 사용하여 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라.N, 마음을 무료로 집게 위에 잘라. 폐 혈관 포경 남아 있으면, 폐 심장으로 제거 될 수 있고 계속하기 전에 제거되어야한다.
- 잘라 내기 및 밸브의 수준의 위 폐동맥을 제거; 여기에 기술 된 배아 단계에서, 폐동맥 밸브 지역에서의 차별에 도움되는 약간 불투명하다. 그냥 폐동맥 판막 아래 잘라 trabeculated 심실의 심근을 방지하고이 지역이 관심 또한 경우 단계 1.10에 설명 된대로 수집합니다. 여기서 및 다음 단계에서, 종래의 용해 완충액에 수집 어웨이 관심 영역으로부터 과량의 트리스 완충액을 그리 모세관을 사용한다.
- 조심스럽게 그냥 밸브의 수준 이상으로, 대동맥 판막을 대동맥 원위부를 제거; 폐동맥과 같은 대동맥의 제거에 도움을줌으로써 이러한 배아 단계에서 약간 불투명 남아있다. 다시 trabeculated 심실 심근을 피하고, 단지 대동맥판 이하 잘라 및 전송얼음에 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제를 포함하는 (재료 표에 설명) 2 μL 용해 버퍼 에펜 도르프 튜브에 집게를 사용하여 밸브.
- 밸브는 별도의 에펜 도르프 튜브에 각 밸브를 수집, 모든 배아에서 적출 될 때까지 반복 1.6-1.10 단계를 반복합니다. 모든 배아는 동일한 유전자형을 가지고 있다면, 모든 밸브는 단일 에펜 도르프 튜브에 수집 될 수있다.
- 유전자형이 함께 풀에 밸브를 결정하기 위해 수행해야하는 경우, 즉시 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 용해 버퍼에 샘플을 배치. 시료 (단계 2.1.1) 유전형 후 풀링 될 수있다.
2 단백질 추출
- 1 분은 튜브의 바닥에 용해 완충액에서 조직을 수집하기위한 13100 XG에서 얼음과 원심 분리기에 수집 된 조직을 해동.
- 배아 유전자형 된 경우, 부드럽게 수집하고 풀 용해 버퍼 유사한 유전자형을 가진 배아에서 밸브 영역을 포함하는 피펫을 사용합니다. 강한 B를 확보하려면샘플이 좋습니다 당과, E13.5 배아에서 3-4 밸브 영역을 풀링.
- 모든 배아는 동일한 유전자형의이었고 모든 밸브 영역은 1.10 단계에서 함께 회수하고 있으면 단계 2.2에 기재된 바와 같이, 전체 샘플을 용해.
- 풀링 얻어진 시료의 부피를 점검하고 40 ㎕의 총 부피에 용해 완충액을 추가; 그때, 중단하고 에펜 도르프 튜브에 5mm 스테인리스 비즈를 사용하여 샘플을 균질화. 제조업체의 지침에 따라, 50 Hz에서 2-4 분 동안 lyser을 사용하십시오. 간단히 스핀 튜브, 불용성 이물질 남기고 새로운 튜브로 (13100 ~ 1 분간 XG) 및 전송 샘플.
- 준비 및 Eslami 외 9와 같은 프로토콜 다음 SDS-PAGE 이후 서양 얼룩 분석을 위해 전송을위한 별도의 샘플. 로드 제어 단백질 블로 팅하는 단백질 정량에 필수적이다.
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Representative Results
이러한 준비의 기술을 사용하여, 우리는 E13.5 배아에서 하나의 대동맥 판막 지역에서 인산화 TGF 계통 1,5,8 (pSmad)을 감지 할 수 있었다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 심지어 단일 밸브 영역으로부터 분리 된 단백질은 희미한 pSmad 밴드를 검출하기에 충분하다. 신호 강도는 풀링 밸브 영역의 개수에 비례하여 증가한다. 중요한 것은, pSmad / β-액틴 비율은 서로 다른 샘플 크기 (그림 1C)에 걸쳐 거의 일정하게 유지된다. 인해 가능한 단백질의 낮은 수준으로, 동일한 오점이 박탈 될 수없고 전체 TGF 계통 위해 reprobed. 그러나, 별도의 총 TGF 계통으로 한 보여주는 오와 β-액틴 같은 표현 패턴 (그림 1B)를 보여줍니다.
이 밸브 영역은 심실 심근 오염의 거의없는 상태이다. 우심실의 샘플과 함께이 준비 기술을 사용하여, 우리는 ventric를 감지 할 수 없습니다대동맥 판막 지역의 신경근 심근 마커 ANP이 마커가 쉽게 뇌실에서 검출 된 반면 (그림 2). 또한, 심실 마커 심근 미오신 경쇄 2V도 용이 심실 샘플에서 검출되지만 대동맥판 영역에서 거의 검출 가능하다. 이러한 결과는 절개의 정밀도를 지원한다.
배아 대동맥 판막 지역에서 그림 1은 TGF 계통 인산화. 샘플 1에서 샘플 당 4 밸브 영역에 이르기까지 풀 배아 마우스 대동맥 밸브 영역의 숫자가 증가함에 따라 제조 하였다. 각 샘플은 25 ~ 28 μL의 총 부피에 밸브 전체 영역 (들)에서 분리 된 모든 단백질을 포함한다. 준비 조직은 다음 인산화 Smad1,5,8 (pSmad) (A 웨스턴 블롯 분석을 실시 하였다) 전체 Smad1 (C), 및 β-액틴 (A, C). 단백질은 Lumigen ECL 울트라 및 UVM VisionWorks 소프트웨어로 이미지화하여 검출되었다. pSmad 및 β-액틴의 밴드 강도는 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 (B)에 정량으로, 출발 물질의 양에 비례한다. 제시된 데이터는 평균과 두 개의 분리 된 말의 표준 편차입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 대동맥 밸브 영역은 심실 심근 마커를 표명하지 아니합니다. 샘플이, 또는 함께 1 샘플 당 4 밸브 영역에 이르기까지 풀 배아 마우스 대동맥 밸브 영역의 숫자가 증가함에 따라 제조 하였다우심실의 샘플입니다. 도 1에서 설명한 심근 심실 대해 도말 표본으로 처리 찬 ANP (A) 및 미오신 경쇄 (MLC) -2V (B)를 마커. ANP 완전히 심실 샘플로 제한되고, MLC-2V가 심실 샘플에 비해 극히 낮은 수준으로 발현된다. β-액틴은 부하 제어로 표시됩니다.
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Discussion
심장 밸브 영역을 조기에 마우스 배아 단백질 수준을 정량화하고 병아리 능력 밸브 개발에 중요한 세포 신호 전달 사건을 이해하기위한 추가 툴을 제공한다. 여기에 설명 된 우리의 프로토콜은 표준 단백질 분리 과정에서 크게 차이가 없습니다. 그러나, 몇 가지 주요 단계를 수정하여, 우리는 성공적으로 매우 작은 샘플 크기에서 인산화 단백질을 얻을 수있다. 이 결과를 달성하기 위해, 다음 단계가 특히 중요하다. 즉 양질의 단백질이 얻어진다 유지하려면 얼음 여부 필요한 경우, 인산 분해 효소 억제제의 존재하에, 빙냉 버퍼를 사용하여, 시료를 냉장 보관하는 것이 중요하다. 또한, 작은 샘플 볼륨을 처리하도록 설계된 장치는 충분히 균질화 세포막을 방해 필수적이다. 심지어이주의 사항으로, 단백질의 얻어진 수율은 분광 광도계와 브래드 포드 분석을 통해 검출 너무 낮을 수 있습니다또는 정지 단백질 정량 키트 및 후속 분석에 사용할 샘플을 가지고있다. 우리는 각 대동맥 판막 지역은 7 대동맥 판막 영역을 풀링 및 정량 전체 샘플을 사용하여 약 1 μg의 단백질이 포함되어 있는지 확인 할 수 있었다. 이러한 제한에도 불구하고, 충분한 정량 단백질은 종래의 부족이 중요 부하 제어한다하더라도, 인산화 및 비 - 인산화 된 단백질을 검출하기 위해 얻어진다. 그것은 우리가도 막 여러 번 제거 후이를 감지 할 수 높은 풍부한 단백질이기 때문에 우리는 특별히 β-액틴을 활용; 그 분자량은 관심 단백질 우리 달랐다; 그것은 재하 표현된다. 풀링 된 샘플의 수가 다른 재판 서양 얼룩 개발의 다른 단계에서 또는 관심의 다른 작은 조직에 대한 배아 심장 밸브 지역 중 하나에 풀링해야합니다 얼마나 많은 조직을 결정하는 것이 좋습니다. 또, 적어도 삼t 풀링 권장각 단백질 시료 문제 샘플 해부 조직의 크기뿐만 아니라, 각각의 배아 절개 전에 얼음에 앉아있는 시간에 변동을 고려하여. 관심의 단백질에서도 샘플을 풀링 한 후 웨스턴 블롯을 통해 검출 할 수없는 경우에, 우리는 샘플 볼륨을 감소시키고 잠재적 인 모든 단백질이 검출 가능하다는 것을 보장하기 위해 균질화 시간을 증가 권장합니다. 또한, 프로테아제 억제제는 불안정하거나 쉽게 분해 단백질 해부 동안 빙냉 트리스 완충액에 첨가 할 수있다. 관심의 단백질이 이러한 차 항체 배양 또는 기판 검출 방법을 조정 낮은 수준의 실험 웨스턴 블롯 부 중에 추가적인 문제, 발현되는 경우, 시각화에 도움이있다.
증거 (예, 면역 조직 화학 또는 현장 교잡)는 관심의 단백질이 심장 밸브 및 surrou 모두를 표현 제안하는 경우심근을 찾아내는, 대동맥이나 폐동맥 심근은, 텅스텐 바늘 떨어져 조심스럽게 조롱에도 E12.5 배아 5에서 밸브에서 할 수 있습니다. 이 추가 단계가 상당한 기술적 어려움을 해부의 시간을 연장하고 추가 할 것입니다 때문에, 우리는 필요에 따라 이용하는 것이 좋습니다. 우리의 원래 연구에서는 TGF 계통의 인산화는 밸브의 중간 엽에서 변경된 것으로 나타났다 면역 조직 화학 분석을 시작했다; 따라서, 우리는 서양 얼룩을 통해 관찰 차이가 밸브 중간 엽 8의 발현의 변화로 인해 있다고 확신했다. 개발 유출 관 밸브는 ANP 또는 MLC-2V로 심실 심근 특이 항체를 이용한 심실 오염 제어 오점을 수행, 큰 동맥과 심실의 교차점에 앉아 있기 때문에 더 좋습니다.
밸브가 개발 과정에서 극적인 재구성을 받아야하기 때문에, 우리는 다음 단계 별 R을 제공쿠션 / 밸브와 그 주변 조직에 대한 ecommendations. 초기 쿠션 (E9.5-11.5)의 경우, 유출 관과 방실 쿠션 모두 쉽게 인한 심근 (10)의 투명도를 시각화하고 해부; 그러나,이 배아는 작은, 그리고 해부 바늘 대신 집게와 microscissors 권장된다. 중간 단계의 분화 (E12.5-14.5) (10), 반월판의 경우 (즉, 대동맥과 폐동맥 밸브는) 더 쉽게 액세스 할 수있는 방실 밸브보다 (즉, 승모판 막 및 삼첨판 막 밸브). 대동맥과 폐동맥이 septating이 기간 동안 11, 12 회전하고 있기 때문에, 반월판 신중하게 해부해야합니다. 세심한주의가 대동맥 및 폐동맥의 기지의 회전에 제공되어야하며, 이러한 동맥 사이의 중간 점은 일관되게 식별한다. 밸브 성숙 축합 후반부 (AT이상과 E15.5) (10)는, 승모판과 삼첨판 밸브 심실 내부에서 멀리 놀림 될 수있다; 그러나, 반월판 더 쉽게 액세스 할 수 있어야합니다.
웨스턴 블롯 분석은 생검 크기가 큰 성인 심장 밸브 (13)에서의 단백질 발현 수준을 정량화하기위한 오랜 기술이다. 대조적으로, 무료 초기 배아 분석은 절연의 mRNA 작은 초기 량 분석 전에 증폭 될 수 전사 PCR을, 단백질 발현을 검출하거나 리버스 비 정량적 면역 하나에 초점을 맞추고있다. 이러한 기술은 현재 사용중인 시그널링 및 유전자 발현의 변화에 관한 일부 관련 정보를 제공하지만, 정량적 단백질 수준을 평가하는 능력이 부족하다. 이 프로토콜로, 우리는 지금 정량적 mRNA 발현 데이터 및 면역 조직 화학 분석과 상관 관계를 정량적 단백질 발현 데이터를 추가 할 수있다.
이 프로토콜의 칭찬은 배아 심장 밸브 및 이미징 단백질 발현에서의 mRNA를 분리하는 기술을 설립했다. 따라서, 이러한 기술을 결합하는 단백질 수정 번역을 게시하는 mRNA의에서, 위쪽의보다 완전한 분석 및 하위 규정 신호 전달 경로의 수 있습니다. 또한,이 기술은 현재 이용 면역 조직 화학 기술을 향상시키는 단백질 발현의 정량화를 허용. 함께, 우리는이 기술은 심장 밸브에 관심이나 양적 서양 얼룩 분석을 위해 다른 특히 작은 조직 절편을 준비하는 연구자들에 대한 관심이 될 것이라고 믿는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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