Introduction
יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray 2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות 6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA אינו יכולות לספק חשבון קפדני של שינויים הרבים המתרחשים בכל איתות שניתנהמסלול בזמנים שונים במהלך התפתחות. בהתבסס על מגבלה זו במתודולוגיה זמינה כרגע, המטרה של הליך זה הייתה לפתח פרוטוקול למהימן קבלת כמות מספקת של חלבון מאזורי שסתום לב העכבר עוברי מתפתחים לניתוח כמותי של שינויים המתרחשים במסלולי איתות שונים שחשובים ב ההבשלה של רקמה זו.
שסתומים עובריים כבר הם גזורים בדרך כלל מעכברים לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים לאחר 2-5. עם זאת, מחקרים אלו היו מוגבלים לשימוש בביטוי גנים כקריאה מתוך איתות הפעלת מסלול, שאינו מאפשר זיהוי של לאתר שינויי חלבון לאחר translational שעשוי להשפיע על איתות במורד הזרם. תוך שימוש בטכניקות בידוד RNA כנקודת התחלה, התחלנו עם לנתח האזורים של עניין. בגלל האינטרס שלנו היה גילוי חלבוני phosphorylated שהיו מעיד על טפיחת איתותפעילות hway במהלך תקופה מסוימת של התפתחות שסתום אב העורקים (E13.5-14.5), ביצענו את כל הניתוחים במאגר טריס נטול פוספט ואספתי את השסתומים במאגר תמוגה מבוססת טריס עם מעכבי phosphatase ופרוטאז. במקרה הספציפי שלנו, רק אזורי שסתום אב העורקים נאספו, אבל יכול בקלות להיות מושגת אזור שסתום ריאתי באותו הזמן. אזורי שסתום היו אז הומוגני ושילוב עם מאגר מדגם המשמש כיום ללמוד ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגר 7. על ידי שימוש בכמויות קטנות מדגם (למשל, 2 μl) ואיגום אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפ זהה, שהיינו מסוגל לזהות חלבונים עוברים פוספורילציה וnonphosphorylated ביום עוברי 13.5 8. מאחר שניתן להקפיא את אזורי שסתום ומאוחסנים במאגר תמוגה, ניתן genotyped עוברים במידת צורך לפני איגום.
טכניקה זו מרחיבה את הסט של כלים הזמינים להערכת סיגנליזטורי תאמסלולים גרם במהלך פיתוח ומספק מחמאה כמותי לאימונוהיסטוכימיה, במיוחד עבור שסתומי לב מתפתחים. טכניקה זו צריכה להיות בעל ערך לא רק לקרדיולוגים התפתחותיים, אלא גם לכל הביולוגים התפתחותיים שעובדים עם עוברים בראשית התפתחות מעוניינים באזורים המכילים רקמה מוגבלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.
.1 בלו מסתם אאורטלי
- שימוש בטכניקת המתת חסד אושרה לשלב העוברי של עניין, להרדים עכבר בהריון עם גורים ביום הרצוי העוברי (E) של פיתוח.
- השתמש 70% אתנול לעקר הבטן של הנשים בהריון. הרם את העור ושרירים של הבטן התחתונה ומן האיברים הפנימיים, ולנתח חלל הבטן התחתונה של פתוחה הנקבה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם.
- כדי לאחזר את קרן הרחם, להחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים וזנב לחתוך בזהירות למלקחיים. הרם את קרן הרחם, חיתוך כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום, ולהשלים את ההסרה על ידי חיתוך הצומת של קרן הרחם עם oviduct.
- הנח את קרן הרחם גזור בcol צלחת פטרי המכילד 0.1 חיץ M טריס (pH 7.6) ולשטוף לפי צורך. לאחר מכן, חותך את קרן הרחם פתוח אורך חכם לחשוף את שקים העובריים.
- כדי לחשוף את העובר, לחתוך לפתוח שק עוברי בצומת של השליה והעוברת ולחתוך את כלי הטבור לשחרר את העובר. מניחים את העובר גזור בצלחת פטרי שנייה עם חיץ M טריס קר 0.1. להחזיר את צלחת פטרי הראשונה עם עוברי undissected נותרים לקרח עד מוכן לעובר הבא.
- כדי לשפר את קיר גישת חזה בתוך העובר, לערוף את העובר. אם גנוטיפ יש צורך, להסיר ולשמור חתיכת רקמה נוספת בצינור Eppendorf הניח על קרח.
- מניחים את העובר על הגב שלה, וחתך את קיר החזה בצורה אנכית בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואופקית מעל הסרעפת לדמיין את הלב. לאחר מכן, לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב.
- בעזרת מלקחיים להחזיק גבוה לאורך כלי הגדול, להרים את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי להלן.n, לחתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי להישאר נימול, הריאות ניתן להסיר עם הלב, ויש להסיר לפני שתמשיך.
- לחתוך ולהסיר את עורק הריאה מעל לרמה של השסתום; בשלבים העובריים שתוארו במסמך זה, עורק הריאה הוא מעט אטום, אשר מסייע באפליה שלה מאזור שסתום. לחתוך ממש מתחת לשסתום ריאתי, הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated ולאסוף כפי שמתואר בשלב 1.10 אם אזור זה גם הוא עניין. כאן ובשלב הבא, להשתמש בפעולת נימים לצייר חיץ טריס עודף מהאזור של עניין לפני האיסוף במאגר תמוגה.
- מוציא בזהירות את דיסטלי אב העורקים לשסתום אב העורקים, ממש מעל הרמה של השסתום; כמו עורק הריאה, אב העורקים נשארים אטומים מעט בשלבים העובריים אלה, בסיוע בהסרתה. לחתוך ממש מתחת לשסתום אב העורקים, שוב הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated, ולהעביר אתשסתום באמצעות מלקחיים לצינור Eppendorf עם חיץ תמוגה 2 μl (שמתואר בטבלת חומרים) המכיל מעכבי פרוטאז וphosphatase על קרח.
- חזור על שלבים 1.6-1.10 עד שסתומים כבר נכרת מכל העוברים, איסוף כל שסתום בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים גנוטיפ זהה, כל השסתומים עשויים להיות שנאספו בצינור Eppendorf יחיד.
- אם גנוטיפ הוא שיש לבצע כדי לקבוע אילו שסתומי לחבור יחדיו, להציב מייד דגימות במאגר תמוגה ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אז יכולות להיות ונקוו דגימות לאחר genotyping (צעד 2.1.1).
הפקת .2 חלבון
- להפשיר רקמות שנאספו על קרח ו צנטריפוגות ב XG 13,100 עבור 1 דקות כדי לאסוף את הרקמות במאגר תמוגה בחלק התחתון של הצינור.
- אם עוברים עברו מיפוי, להשתמש פיפטה לאסוף בעדינות ובמאגר תמוגה בריכה המכיל את אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפים דומים. כדי להבטיח ב חזקו, איגום 3-4 אזורים שסתום מעוברי E13.5 לדגימה מומלצת.
- אם כל העוברים היו של אותו גנוטיפ וכל אזורי שסתום נאספו יחד בשלב 1.10, lyse המדגם כולו, כפי שמתואר בשלב 2.2.
- בדוק את עוצמת הקול של המדגם נקווה כתוצאה ולהוסיף למאגר תמוגה להיקף כולל של 40 μl; לאחר מכן, לשבש וhomogenize דגימות באמצעות חרוזים נירוסטה 5 מ"מ בצינורות אפנדורף. פועל lyser ל2-4 דק 'ב 50 הרץ, לפי הוראות היצרן. צינורות ספין בקצרה, (~ 13,100 XG 1 דקות), והעברת דגימות לצינורות חדשים, והותירו אחריו את הפסולת בלתי מסיס.
- הכן דגימות נפרדות לSDS-PAGE והעברה לניתוח כתם מערבי שלאחר מכן, בעקבות פרוטוקול כגון אסלאמי et al 9. סופג לחלבון בקרת טעינה הוא חיוני לכימות חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בטכניקת הכנה זו, שהיינו מסוגל לזהות סמאד 1,5,8 פוספורילציה (pSmad) באזורי שסתום אב העורקים אחת מE13.5 עוברים. כפי שניתן לראות באיור 1 א, החלבון מבודד מאף אזור שסתום חד מספיק כדי לזהות להקת pSmad קלושה. עוצמת אות מגדילה באופן יחסי למספר אזורי שסתום שייאגרו. חשוב לציין, pSmad / היחס β-אקטין נשאר כמעט קבוע על פני הגדלים השונים מדגם (איור 1 ג). בשל הרמות נמוכות של חלבון זמין, באותו הכתם לא יכול להיות חשוף וreprobed לסמאד סך הכל. עם זאת, כתם נפרד מראה כולל 1 סמאד וβ-אקטין מראה אותו דפוס הביטוי (איור 1).
אזורי שסתום אלה חסרי כמעט לחלוטין את זיהום שריר הלב של חדר. שימוש בטכניקת הכנה זו בשילוב עם דגימות של החדר ממני, שלא הצליחו לזהות ventricANP ular סמן שריר לב באזורי שסתום אב העורקים, ואילו סמן זה זוהה בקלות בחדר (איור 2). יתר על כן, 2V שריר הלב של חדר שרירן סמן שרשרת אור גם זוהה בקלות במדגם של החדר, אבל הוא בקושי להבחין באזורי שסתום אב העורקים. תוצאות אלו תומכות בדייקנות של הנתיחה.
איור 1 זרחון סמאד באזורי שסתום אב העורקים עובריים. דוגמאות היו מוכנות עם מספר הגדל והולך של אזורים מסתם אאורטלי עכבר עוברי נקוו, החל מ 1 עד 4 אזורים שסתום לדגימה. כל דגימה כוללת את כל החלבונים שבודדו את אזור כולו השסתום (ים) בהיקף כולל של 25-28 μl. רקמות שהוכנו לאחר מכן היו נתונים לניתוח כתם מערבי לSmad1,5,8 פוספורילציה (pSmad) (), Smad1 הכולל (C), וβ-אקטין (A, C). חלבון זוהה באמצעות Lumigen ECL Ultra וצלם עם תוכנת UVM VisionWorks. עוצמת הלהקה של pSmad וβ-אקטין היא פרופורציונלית לכמות חומר מוצאת, כלכמת ב( ב ') באמצעות תוכנת ImageJ. הנתונים שהוצגו הם ממוצעים וסטיית התקן של שני כתמים נפרדים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2 אזורים שסתום אבי העורקים איור אינם מבטאים סמני שריר לב של חדר. דוגמאות היו מוכנות עם מספר גדל והולך של אזורים מסתם אאורטלי עכבר עוברי נקוו, החל מ 1 עד 4 אזורים שסתום לדגימה, או עםמדגם של החדר ממני. דוגמאות עובדו כמתואר באיור 1 ומחק לשריר הלב של חדר סמני ANP () ושרשרת שרירן אור (MLC) -2v (B). ANP מוגבל לחלוטין למדגם של החדר, וMLC-2V בא לידי ביטוי ברמות נמוכות מאוד בהשוואה למדגם של החדר. β-אקטין מוצג כביקורת טעינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני phosphorylated מגודל מדגם קטן מאוד. כדי להשיג תוצאה זו, השלבים הבאים הם בעלת חשיבות מיוחדת. כדי להבטיח שחלבון באיכות מתקבל, זה הוא חיוני כדי לשמור על דגימות מקוררים, אם על קרח או על ידי שימוש במאגרים קר כקרח, בנוכחותו של פרוטאז ו, במידת צורך, מעכבי phosphatase. יתר על כן, הומוגניות עם מכשיר שנועד לעבד כמויות מדגם קטנות היא חיונית לכראוי שיבוש קרום תא. למרות אמצעי הזהירות הללו, התשואה המתקבלת מחלבון עלולה להיות נמוכה מדי כדי לזהות באמצעות assay ברדפורד עם ספקטרופוטומטראו שיש לי ערכת כימות חלבון ועדיין מדגם זמין עבור ניתוחים שלאחר מכן. היינו יכול לקבוע שכל אזור שסתום אב העורקים מכיל כ 1 מיקרוגרם של חלבון על ידי איגום 7 אזורי שסתום אב העורקים ובאמצעות המדגם כולו לכימות. למרות מגבלה זו, חלבון מספיק מתקבל לגילוי חלבונים עוברים פוספורילציה ואינה פוספורילציה, אם כי חוסר כימות מראש הופך את שליטת טעינה חיונית. אנחנו דווקא ניצלנו β-אקטין כי זה חלבון גבוה שפע, אשר אפשר לנו לזהות אותו גם לאחר הפשטת פעמים רבות הקרום; המשקל המולקולרי שלה היה שונה מחלבונים ענייננו; והוא בא לידי ביטוי בכל מקום. כתם מערבי משפט עם מספרים שונים של דגימות ונקוו מומלץ לקבוע כמה רקמות חייבות להיות נקווה לשני אזורי שסתום לב עובריים בשלבים אחרים של התפתחות או לרקמות קטנות אחרות של עניין. בנוסף, אנו ממליצים איגום לפחות שלושה tדגימות בעיה עבור כל דגימת חלבון לדין וחשבון על שונות בגודל של הרקמות גזורים, כמו גם באורך של זמן בכל עובר ישב על קרח לפני הנתיחה. אם החלבון של עניין לא ניתן לאתר באמצעות כתם מערבי גם לאחר איגום דגימות, אנו ממליצים על הפחתת נפח דגימה ולהגדיל את זמן יצירת הומוגניות על מנת להבטיח כי כל החלבון הפוטנציאלי זמין לגילוי. בנוסף, מעכבי פרוטאז יכולים גם להוסיף למאגר טריס קר כקרח במהלך ניתוחים לחלבונים לא יציבים או מושפלים בקלות. אם החלבון של העניין בא לידי ביטוי ברמות נמוכות, פתרון בעיות נוספות במהלך חלק הכתם המערבי של הניסוי, כגון התאמת הדגירה הנוגדן הראשונית או שיטת זיהוי מצע, עשוי לעזור עם הדמיה.
אם הראיות (למשל, אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר) מצביעים על כך שחלבון של העניין בא לידי ביטוי הוא בשסתומי הלב וsurrounding שריר לב, שריר לב עורק אב העורקים או ריאות יכול להיות הקניט בנפרד בעדינות עם מחטי טונגסטן, אפילו משסתומים מעוברי E12.5 5. משום צעד נוסף זה יהיה להאריך את משך הזמן של נתיחה ולהוסיף קושי טכני משמעותי, אנו ממליצים להשתמש בטכנולוגיה זו במידת צורך בלבד. במחקר המקורי שלנו, שהתחלנו עם ניתוח immunohistochemical שהראה כי זירחון סמאד שונו רק בmesenchyme השסתום; וכך, היינו בטוחים שכל הבדלים שנצפו באמצעות כתם המערבי היו כתוצאה משינויים בביטוי בmesenchyme השסתום 8. יתר על כן, מכיוון שהשסתומים בדרכי יצוא פיתוח לשבת בצומת של העורקים הגדולים וחדרי הלב, ביצוע כתם שליטה לזיהום חדרית באמצעות נוגדן ספציפי לשריר לב של חדר כגון ANP או MLC-2V מומלץ.
מכיוון שסתומים לעבור ארגון מחדש דרמטי במהלך התפתחותם, אנו מציעים r השלב ספציפי הבאecommendations לכריות / שסתומים ורקמות המקיפות אותם. לכריות המוקדמות (E9.5-11.5), שניהם בדרכי יצוא וכריות בין עליות וחדרים הם דמיינו בקלות וגזורה בשל השקיפות של שריר הלב 10; עם זאת, עובר אלה הם קטנים, ומחטים לנתח מומלצות במקום מלקחיים וmicroscissors. לבידול אמצע הבמה (E12.5-14.5) 10, שסתומי semilunar (כלומר, אב העורקים סתומים עורק ריאה) יהיו יותר נגיש מאשר השסתומים בין העליות וחדרים (כלומר, צניפי שסתומים tricuspid). עם זאת, שסתומים semilunar חייבים להיות גזורים בזהירות, כי אב העורקים ועורק ריאה הם septating ומסתובבים במסגרת זמן זו 11,12. תשומת לב קפדנית צריך להינתן לסיבוב של הבסיס של אב העורקים ועורק ריאה, ונקודת האמצע בין עורקים אלה צריכים להיות מזוהים באופן עקבי. בשלבים מאוחר יותר של התבגרות שסתום ועיבוי (E15.5 ומאוחר יותר) 10, צניפי שסתומים tricuspid ניתן הקניטו מבפנים את החדרים; עם זאת, שסתומים semilunar צריכים להיות יותר נגיש בקלות.
ניתוח כתם מערבי הוא טכניקה ארוכה שנים לכימות רמות ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגרים 13, שבו גודל הביופסיה הוא גדול. בניגוד לכך, הניתוחים העובריים המוקדמים חינם התמקדו בשני אימונוהיסטוכימיה שאינה כמותי כדי לזהות ביטוי חלבון או להפוך שעתוק PCR, כאשר הסכום ההתחלתי הקטן של mRNA המבודד יכול להיות מוגבר לפני הניתוח. טכניקות מועסקות כיום אלה מספקים מידע רלוונטי בנוגע לשינויים בביטוי איתות וגן אך חסרים את היכולת להעריך כמותית רמות חלבון. עם פרוטוקול זה, עכשיו אנחנו יכולים להוסיף נתונים ביטוי חלבון כמותי לתאם עם נתונים ביטוי mRNA כמותיים וניתוחי immunohistochemical.
מחמאות פרוטוקול זה הוקמו טכניקות לבידוד mRNA משסתומי לב העובריים וביטוי חלבון הדמיה. ככזה, שילוב טכניקות אלה יאפשר לניתוחים של למעלה מלאים יותר ולמטה רגולציה של מסלולי איתות, מmRNA שלאחר translational שינוי חלבון. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לכימות של ביטוי חלבון, שתשפר את טכניקות אימונוהיסטוכימיה מנוצלות כיום. יחד, אנו מאמינים כי טכניקה זו תהיה עניין לכל חוקר מעוניין בשסתומי לב או הכנת explants רקמה קטנה במיוחד אחר לניתוח כתם מערבי כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
