Introduction
Die Möglichkeit zur Identifizierung und Quantifizierung Proteinexpressionsniveaus ist eine Standardtechnik für tier- und zellbasierten Experimenten. Doch trotz langjähriger Interesse an der frühen embryonalen Herzklappen Entwicklung, Bewertung Proteinexpression in diesem speziellen Gewebe während der Entwicklung ist derzeit sowohl in der Immunhistochemie Küken und Maus 1,2 begrenzt. Ein Teil der Schwierigkeit der Quantifizierung der Proteinexpression in den Entwicklungs Ventile aller Modellorganismen (beispielsweise Küken und Maus) ist die geringe Größe der Ventile, die die Menge an Protein, die erhalten werden können, begrenzt. So für quantitative Analysen, die Forscher der Regel verlassen sich auf die RNA-Extraktion und Amplifikation für die anschließende quantitative PCR oder Microarray-Analyse 2-5. Jedoch sind RNA-und Protein-Expressionsniveaus nicht vollständig korrelativen 6, so sich auf RNA-Expression nicht eine strenge aufgrund der zahlreichen Änderungen, die in einem gegebenen Signalisierungs auftretenWegs zu verschiedenen Zeiten während Entwicklungen. Basierend auf dieser Grenze in der gegenwärtig verfügbaren Methoden, das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Protokoll für die zuverlässige, ausreichende Mengen des Proteins aus den Entwicklungs embryonalen Maus Herzklappenbereiche für die quantitative Analyse der Änderungen, die in verschiedenen Signalwegen, die in wichtig auftreten entwickeln Die Reifung des Gewebes.
Embryonale Ventile sind bereits häufig von Mäusen für die RNA-Isolierung und anschließende Genexpressionsanalyse 2-5 seziert. Allerdings haben diese Studien mit Gen-Expression als ein Auslesen der Signalwegs-Aktivierung, die nicht den Nachweis erkennen posttranslationalen Proteinmodifikationen, die nachgeschalteten Signal beeinflussen können zulässt beschränkt. Mit Hilfe der RNA-Isolierung Techniken als Ausgangspunkt, begannen wir mit sezieren die Regionen von Interesse. Da unser Interesse wurde phosphoryliert Proteine, die indikativ Erkennen von Signal pat warenHWAY Aktivität während einer bestimmten Zeit Aortenklappe Entwicklung (E13.5-14.5), führten wir alle Sektionen in phosphatfreien Tris-Puffer und die Ventile in einem Tris-Lyse-Puffer mit Phosphatase und Protease-Inhibitoren gesammelt. In unserem speziellen Fall nur die Aortenklappe Regionen wurden gesammelt, aber der Pulmonalklappe Bereich leicht zur gleichen Zeit erhalten werden. Die Ventilbereiche wurden dann homogenisiert und in Kombination mit einem Probenpuffer, der derzeit verwendet wird, um die Proteinexpression in adulten Herzklappen 7 zu untersuchen. Durch die Verwendung von kleinen Probenmengen (beispielsweise 2 ul) und Vereinigen Ventilbereiche von Embryonen mit dem gleichen Genotyp, waren wir in der Lage, phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proteine an embryonalen Tag 8 13,5 erfassen. Da die Ventilbereiche können eingefroren und in Lyse-Puffer gespeichert werden können, wenn Embryonen vor Pooling benötigt genotypisiert werden.
Diese Technik erweitert den Satz von Tools, die für die Auswertung zur Verfügung stehen Zelle signaling Wege während der Entwicklung und eine quantitative Kompliment Immunhistochemie, die speziell für die Entwicklung von Herzklappen. Diese Technik sollte der Nutzen nicht nur für Entwicklungs Kardiologen, aber auch für alle Entwicklungsbiologen, die mit frühen Embryonen arbeiten, sind interessiert in Regionen, die begrenzte Gewebe enthalten sein.
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Protocol
HINWEIS: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Universität von North Carolina in Chapel Hill genehmigt.
1. Verbrauch der Aortenklappe
- Mit einem zugelassenen Euthanasie Technik für die embryonalen Stadium von Interesse, einschläfern eine schwangere Maus mit Welpen an der gewünschten embryonalen Tag (E) der Entwicklung.
- Verwenden 70% Ethanol, um den Bauch der Schwangeren zu sterilisieren. Heben Sie die Haut und Muskeln des Unterleibs oben und weg von den inneren Organen und sezieren unteren Bauchhöhle des Weibchens offen für den Zugang zum Uterushorn zu ermöglichen.
- Um die Uterushorn abzurufen, halten Sie die Zervix mit einer Pinzette und sorgfältig geschnitten kaudal der Zange. Heben Sie die Uterushorn, Schneiden jede Bindegewebe, das Horn an Ort und Stelle hält, und füllen Sie die Entfernung, indem die Kreuzung der Uterushorn mit den Eileiter.
- Legen Sie die seziert Uterushorn in eine Petrischale mit cold 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,6) und spülen Sie nach Bedarf. Dann schneiden Sie die Uterushorn offen in Längsrichtung, um die embryonalen Säcke aus.
- , Um den Embryo zu belichten, schnitt eine Fruchtblase an der Kreuzung von der Plazenta und des Embryos und schneiden Sie die Nabelgefässe, um den Embryo zu befreien. Legen Sie die seziert Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem 0,1 M Tris-Puffer. Bringen Sie die ersten Petrischale mit den restlichen unzer Embryonen Eis, bis sich bereit für den nächsten Embryo.
- Um Zugang Brustwand innerhalb des Embryos zu verbessern, den Embryo zu enthaupten. Wenn Genotypisierung notwendig ist, zu entfernen und speichern eine zusätzliche Gewebestück in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gestellt.
- Legen Sie den Embryo auf dem Rücken, und schneiden Sie die Brustwand vertikal entlang der Seite des Brustkorbs, in der Nähe einer Vordergliedmaße, und horizontal über der Membran, um das Herz zu visualisieren. Öffnen Sie dann die Brustwand, um das Herz freizulegen.
- Mit einer Pinzette hoch entlang der großen Gefäße zu halten, heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Gefäße unten. Dien, vor der Zange geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße bleiben ungeschnitten, kann die Lunge mit dem Herzen entfernt werden und sollte, bevor Sie fortfahren entfernt werden.
- Schneiden und entfernen Sie die Lungenarterie über dem Niveau des Ventils; bei der hier beschriebenen Embryonalstadien, die Lungenarterie leicht opak, die in ihrer Unterscheidung von den Ventilbereich unterstützt. Kurz unterhalb der Pulmonalklappe, die Vermeidung der trabekulierte Myokard und sammeln, wie in Schritt 1.10 beschrieben, wenn diese Region ist auch von Interesse. Hier und im nächsten Schritt verwendet Kapillarwirkung, um überschüssiges Tris-Puffer von dem interessierenden Bereich vor dem Sammeln in Lysepuffer ziehen.
- Die Aorta distal sorgfältig zu entfernen, um die Aortenklappe, gerade über dem Niveau des Ventils; wie die Lungenarterie, bleibt der Aorta bei diesen embryonalen Stadien leicht opake, Beihilfe in seiner Entfernung. Kurz unterhalb der Aortenklappe, wieder die Vermeidung der trabekulierte Myokard, und übertragen Sie dieVentil mit einer Pinzette in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 ul Lysepuffer (in der Material Tabelle beschrieben) mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte, bis 1,6-1,10 die Ventile aus allen Embryonen herausgeschnitten worden, sammeln jedes Ventil in einem separaten Eppendorf-Röhrchen. Wenn alle Embryonen haben den gleichen Genotyp, können alle Ventile in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt werden.
- Wenn die Genotypisierung durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche zu bündeln Ventile sollten sofort Proben in Lyse-Puffer bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Proben können dann nach Genotypisierung (Schritt 2.1.1) zusammengefasst werden.
2. Proteinextraktion
- Auftauen gesammelten Gewebe auf Eis und Zentrifugieren bei 13.100 × g für 1 Minute, um das Gewebe in Lysepuffer am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Wenn Embryonen wurden genotypisiert, mit einer Pipette vorsichtig sammeln und Pool-Lyse-Puffer, der die Ventilbereiche aus Embryonen mit ähnlichen Genotypen. Eine starke b gewährleistenund die Bündelung 3-4 Ventilbereiche von E13.5 Embryonen pro Probe wird empfohlen.
- Wenn alle Embryonen wurden aus dem gleichen Genotyp und alle Ventilbereiche in Schritt 1.10 zusammen gesammelt, lysiert die gesamte Probe, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Überprüfen Sie die Lautstärke des resultierenden Mischprobe und fügen Lyse-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 40 ul; dann, und homogenisieren Proben unter Verwendung von 5 mm Edelstahlkugeln in Eppendorf-Röhrchen. Betreiben Sie das lyser für 2-4 min bei 50 Hz, nach den Anweisungen des Herstellers. Spin Röhrchen kurz (~ 13.100 × g für 1 min), und die Übertragung Proben in neue Röhrchen, so dass hinter dem unlöslichen Rückstand.
- Vorbereitung und getrennte Proben für SDS-PAGE und Transfer zur anschließenden Western-Blot-Analyse nach einem Protokoll wie Eslami et al 9. Blotting für eine Ladekontrollprotein ist von wesentlicher Bedeutung für die Proteinquantifizierung.
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Representative Results
Mit dieser Präparationstechnik, waren wir in der Lage, im Einzel Aortenklappe Regionen aus E13.5 Embryonen erkennen phosphoryliert Smad 1,5,8 (pSmad). Wie in 1A gezeigt, ist das Protein von sogar einer einzigen Ventilbereich isoliert ausreicht, um eine schwache pSmad Band zu erfassen. Signalintensität nimmt proportional zur Anzahl der Ventilbereiche, die gebündelt sind. Wichtig ist, bleibt die pSmad / β-Actin-Verhältnis in den verschiedenen Stichprobengrößen (Abbildung 1c) nahezu konstant. Aufgrund der geringen Mengen an Protein zur Verfügung, kann der gleiche Blot gestrippt und nicht für die Gesamt Smad sondiert werden. Eine separate Blot, insgesamt Smad 1 und β-Aktin zeigt jedoch die gleiche Expressionsmuster (Abbildung 1B).
Diese Ventil Regionen sind fast völlig frei von verunreinigenden Myokard. Mit dieser Präparationstechnik in Kombination mit Proben von der rechten Herzkammer, waren wir nicht in der Lage zu erkennen ventricdere Myokard Marker ANP in Aortenklappe Regionen, während dieser Marker wurde leicht in der Herzkammer festgestellt (Abbildung 2). Ferner ist die ventrikuläre myokardiale Markierungs Myosin leichte Kette 2 V ist auch ohne die ventrikuläre Probe nachgewiesen, aber in der Aortenklappe Regionen kaum nachweisbar. Diese Ergebnisse unterstützen die Genauigkeit der Dissektion.
Abbildung 1 Smad-Phosphorylierung in embryonalen Aortenklappe Regionen. Proben wurden mit zunehmender Zahl von gepoolten embryonalen Maus Aortenklappe Regionen von 1 bis 4 Ventil Bereiche pro Probe hergestellt. Jede Probe umfasst alle Proteine des gesamten Ventil Region (en) in einem Volumen von 25-28 ul isoliert. Vorbereitet Gewebe wurden dann einer Western-Blot-Analyse für phosphoryliert Smad1,5,8 (pSmad) (A unterzogen), Gesamt Smad1 (C), und β-Actin (A, C). Protein wurde mit ECL Lumigen Ultra und mit UVM Visionworks Software abgebildet erkannt. Die Bandenintensität pSmad und β-Actin ist proportional zu der Menge des Ausgangsmaterials, wie in (B) mit ImageJ Software quantifiziert. Die vorgestellten Daten sind der Mittelwert und Standardabweichung von zwei separaten Blots. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2 Aortenklappe Regionen exprimieren keine ventrikuläre Myokard-Marker. Proben wurden mit zunehmender Anzahl von gepoolten embryonalen Maus Aortenklappe Regionen, die von 1 bis 4 Ventil Bereiche pro Probe oder mit einer vorbereitetenProbe des rechten Ventrikels. Proben wurden wie in Abbildung 1 beschrieben geblottet und der ventrikulären Myokard verarbeitet Marker ANP (A) und Myosin-Leichtkette (MLC) -2 V (B). ANP ist vollständig mit der ventrikulären Probe beschränkt und MLC-2V bei extrem niedrigen Konzentrationen exprimiert, verglichen mit der ventrikulären Probe. β-Aktin als Ladekontrolle gezeigt.
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Discussion
Die Fähigkeit, Proteinspiegel in der frühen embryonalen Maus quantifizieren und Küken Herzklappen Regionen bietet ein zusätzliches Werkzeug für das Verständnis der kritischen zellulären Signalereignisse für Ventil Entwicklung. Unsere hier beschriebenen Protokoll nicht wesentlich von Standardproteinisolierungsverfahren abweichen. Jedoch durch Änderung einiger Schlüsselschritte, haben wir erfolgreich erhalten phosphoryliert Proteine aus extrem kleinen Probengrößen. Um dieses Ergebnis zu erreichen, sind die folgenden Schritte von besonderer Bedeutung. Um sicherzustellen, dass die Qualität Protein erhalten wird, ist es wichtig, die Proben gekühlt zu halten, sei es auf Eis oder unter Verwendung von eiskaltem Puffer, in Gegenwart von Protease und ggf. Phosphatase-Inhibitoren. Weiterhin ist die Homogenisierung mit einem Gerät, das dazu bestimmt ist, kleine Probenvolumina verarbeiten wichtig für Zellmembranen angemessen zu stören. Selbst mit diesen Vorsichtsmaßnahmen kann die erhaltene Proteinausbeute zu gering sein, um über die Bradford-Assay mit einem Spektrophotometer zu erkennenoder ein Proteinquantifizierung Kit und haben immer noch Probe für spätere Analysen zur Verfügung. Wir waren in der Lage, festzustellen, dass jeder Aortenklappe Region enthält ca. 1 ug Protein durch die Bündelung von 7 Aortenklappe Regionen und mit der gesamten Stichprobe für die Quantifizierung. Trotz dieser Einschränkung ist ausreichend Protein erhalten, um phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Proteine zu erkennen, obwohl die fehlende vorherige Quantifizierung macht eine Ladekontrolle unerlässlich. Wir haben uns speziell genutzt β-Actin, weil es eine hohe Fülle Protein, das uns erlaubt, es auch nach Strippen der Membran mehrfach zu erkennen ist; sein Molekulargewicht unterschied sich von unserem Proteine von Interesse; und es wird ubiquitär exprimiert. Eine Western-Blot-Versuch mit einer unterschiedlichen Anzahl von gepoolten Proben empfiehlt sich festzustellen, wie viele Gewebe muss entweder embryonale Herzklappenbereiche auf anderen Stufen der Entwicklung oder für andere kleine interessierende Gewebe zusammengefasst werden. Darüber hinaus empfehlen wir die Bündelung mindestens drei tAusgabe Proben für jede Proteinprobe, um die Variabilität in der Grße der sezierten Gewebe sowie in der Länge der Zeit jeder Embryo saß auf Eis vor der Präparation ausmachen. Wenn das Protein von Interesse kann nicht über Western-Blot auch nach Bündelung Proben nachgewiesen werden, empfehlen wir die Reduzierung Probenvolumen und die Erhöhung der Homogenisierung Zeit, um sicherzustellen, dass alle potentiellen Protein ist für den Nachweis zur Verfügung. Zusätzlich, Protease-Inhibitoren kann auch auf eiskaltem Tris-Puffer bei Dissektionen für instabile oder leicht abgebaut Proteine hinzugefügt werden. Wenn das Protein von Interesse ist auf einem niedrigen Niveau, zusätzliche Fehlersuche während der Western-Blot-Teil des Experiments, wie die Anpassung der Primär Antikörper-Inkubation oder das Substrat Nachweisverfahren exprimiert wird, kann mit der Visualisierung zu helfen.
Wenn der Nachweis (zB Immunhistochemie oder in situ-Hybridisierung) zeigt, dass ein Protein von Interesse sowohl in der Herzklappen und der surrou ausgedrücktnden Myokard, die Aorta oder Lungenarterie Myokard auseinander vorsichtig mit Wolfram Nadeln sogar von Armaturen aus E12.5 Embryonen 5 gehänselt werden. Da dieser zusätzliche Schritt wird die Zeit der Dissektion verlängern und fügen erhebliche technische Schwierigkeiten, empfehlen wir den Einsatz als nur nötig. In unserer ursprünglichen Studie, begannen wir mit einer immunhistochemischen Analyse, die zeigte, dass Smad-Phosphorylierung wurde nur in der Ventil Mesenchym geändert; So waren wir zuversichtlich, dass alle über Western-Blot beobachteten Unterschiede aufgrund von Veränderungen in der Expression in der Ventil Mesenchym 8 waren. Da ferner die Entwicklungsausflusstrakt Ventile sitzen an der Verbindungsposition der großen Arterien und den Ventrikeln, Durchführen einer Steuerung Blot für ventrikuläre Verunreinigung mit einem Myokard-spezifischen Antikörper wie beispielsweise ANP oder MLC-2V empfohlen.
Da die Ventile unterziehen dramatischen Reorganisation während ihrer Entwicklung, bieten wir folgende stufenspezifische rMPFEHLUNGEN für die Kissen / Ventile und die sie umgebenden Gewebe. Für den ersten Kissen (E9.5-11.5) sind sowohl die Ausflusstrakt und atrioventrikuläre Kissen einfach visualisiert und seziert aufgrund der Durchsichtigkeit des Myokards 10; jedoch sind diese Embryonen klein und Sezieren Nadeln anstelle der Pinzette und Mikroschere empfohlen. Für Mittelstufendifferenzierung (E12.5-14.5) 10, der Taschenklappen (dh die Aorta und Lungenarterie Ventile) werden leichter zugänglich als die AV-Klappen sein (dh der Mitral-und Trikuspidalklappe). Allerdings müssen die Taschenklappen sorgfältig seziert werden, weil die Aorta und Lungenarterie sind septating und während dieser Zeitrahmen 11,12 dreht. Aufmerksamkeit sollte auf die Drehung der Basis der Aorta und der Lungenschlagader gegeben werden, und der Mittelpunkt zwischen diesen Arterien sollte konsistent identifiziert werden. In späteren Stadien der Reifung und Ventil Kondensation (E15.5 und später) 10 kann der Mitral-und Trikuspidalklappe weg aus dem Inneren der Herzkammern gehänselt werden; jedoch sollten die Taschenklappen leichter zugänglich sein.
Western-Blot-Analyse ist eine seit langem bestehende Technik zur Quantifizierung Proteinexpressionsniveaus in der Erwachsenenherzklappen 13, wobei das Biopsiegröße groß ist. Im Gegensatz dazu weisen die komplementären frühen embryonalen Analysen entweder nicht-quantitative Immunhistochemie Proteinexpression nachzuweisen oder reverse Transkription-PCR, wobei die kleine Menge an Ausgangs isolierte mRNA kann vor der Analyse amplifiziert werden konzentriert. Diese derzeit verwendeten Techniken bieten einige wichtige Informationen zu Änderungen in der Signal-und Gen-Expression, aber nicht die Fähigkeit, quantitativ zu erfassen Protein-Ebene. Bei diesem Protokoll kann man jetzt auf quantitative Proteinexpressionsdaten mit der quantitativen mRNA-Expressionsdaten und immunhistochemische Analysen korreliert.
Dieses Protokoll Komplimente etablierten Techniken zur Isolierung von mRNA aus den embryonalen Herzklappen-und Imaging-Proteinexpression. Als solche wird die Kombination dieser Techniken für eine vollständige Analyse der Up-und Down-Regulation von Signalwegen zu ermöglichen, die von mRNA zu Protein posttranslationalen Modifikation. Ferner ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression, die derzeit verwendet Immunhistochemie-Techniken verbessern wird diese Technik. Gemeinsam sind wir der Meinung, dass diese Technik wird von Interesse für jeden Forscher interessiert an den Herzklappen oder Zubereitung anderer besonders kleine Gewebeexplantaten für quantitative Western-Blot-Analyse sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
References
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