이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Summary

네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.

Abstract

미세 절제는 조직의 특정 지역을 격리하며 인접 지역에서 휴대 소스에서 오염을 제거 할 수있는 새로운 기술이다. 이 방법의 첫 번째 연구에서 이용 된 네 스틴을 발현하는 전구 세포 (네프)를, 소뇌 새싹 외부 층 (EGL) 세포의 새롭게 식별 인구. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 조합 미세 절제를 사용 네프의 순수한 인구 소뇌 EGL 종래 과립 뉴런 전구체로부터 다른 오염 네 스틴 발현 세포 별도로 수집 하였다. 미세 절제없이 네프의 기능성 분석은 퍼콜 구배 원심 분리 및 레이저 캡처 미세 절제으로 사용할 현재의 방법으로 불가능했을 것이다. 이 기술은 또한 인식 할 수있는 영역 또는 형광 표지 된 세포 중 하나를 포함하는 다양한 조직과 함께 사용하기 위해 적용될 수있다. 이 microdissectio 중 가장 중요한 것은, 가장 큰 장점N 기법은 절연 세포 사는 다른 한 방법으로 현재 불가능 추가적인 실험, 배양 될 수 있다는 것이다.

Introduction

소뇌 여러 세포층, 각각 별개 함유 세포 유형으로 구성된다. 분자 층 및 조롱박 층은 각각 버그만 글리와 조롱박 신경 세포를 포함하는 동안 개발 과정에서 EGL은 과립 신경 세포 전구체 (GNPs)를 증식 포함되어 있습니다. 소뇌 내 깊은 신경 줄기 세포 (NSCs의)와 희소 돌기 아교 세포 ^{하나가 들어있는} 흰색 물질을,있다.

소닉 헤지 호그 (쉬) 소뇌 발달을 조절하는데 중요한 역할을하고, 특히, 그것은 기워 수용체 PTC (), 쉬 ^{2-4 시그널링} 네거티브 레귤레이터에 결합을 통하여 GNPs의 증식을 촉진시킨다. 쉬 시그널링의 비정상적인 활성화가 모세포종 (MB), ^5,6 어린이에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 생성한다.

PTC 돌연변이 MB 형질 전환 마우스 모델은 MB의 연구를위한 강력한 도구이며, 인간의 MB ^7,8를 닮은 종양을 개발합니다. 사용이마우스, 그것은 GNPs 고슴도치 형 MB ^7의 원래 세포 것을 발견되었다. 또한, GNPs 외에, 우리는 또한 최근에 MB를 야기 할 수있는 현상 소뇌 EGL 내의 신경 전구 세포의 집단을 고유 식별했습니다. 이러한 세포 유형 VI 중간 필라멘트 단백질, 네 스틴의 높은 수준의 발현 및 네프 ⁹ 불린다. 네프는 EGL의 깊은 부분에 위치한 유일한 신생아 소뇌 개발 과정에서 일시적으로 존재한다. 그들은 GNPs와 과립 세포 계보에 최선을 다하고 있지만,이 대기하고 MATH1, 기존의 GNPs ¹⁰ 잘 설립 마커를 발현하지 않는 별개 있습니다. 또한, 네프 그들 MB의 종양에 대한 새로운 기원하게 쉬의 신호 전달 경로 ^(9)의 활성화 이후 MB에 상승보다 효율적으로보다 GNPs을 제공합니다.

우리는 이전에 미세 절제 기술에 의해 출생 후의 일 4 (P4)에서 소뇌 EGL에서 네프 격리여기에 ⁹ 설명했다. 조직의 직접 현미경 시각화를 통해 미세 절제는 소뇌 EGL의 특정 해부 수 있습니다. 네 스틴도 소뇌 백질과 분자 층 ^{1,7,11,12에서} 버그만 글리에 의해 NSCs을 표현하고 분석을 혼동 하듯이,이 세포를 포함하지 않는 것이 중요했다대로이 필요합니다. microdissected 조직에서 분리 한 세포는 분자 분석을 위해 즉시 이용 될 수도 있고 또 애플리케이션을 배양 할 수있다.

특히 EGL을 microdissecting을 돕기 위해 더욱 네프를 정화, MATH1-GFP (녹색 형광 단백질) 마우스는 네 스틴-CFP (시안 형광 단백질) 마우스와 함께 넘어졌다. 구체적 MATH1 GNPs 및 GFP 발현에 의해 표현되는 전사 인자는 EGL ^{9, 13에서} 명확하게 볼 수있다. 네 스틴 - CFP 생쥐 CFP의 핵 형태를 표현하고 쉽게 ^9,14 분자 층으로 시각화 될 수있다. 함께, CFP 및 GFP 발현 EGL의 미세 절제를위한 경계를 생성 (도 1 참조). CFP 양성 네프는 다음 해부 EGLs의 효소 분해 다음, FACS에 의해 고립되었다.

현재 EGL에서 세포를 분리하기위한 가장 잘 이용 방법은 전체 소뇌 조직 ^{(15, 16)의} 퍼콜 구배 원심이다. 그러나,이 방법은 완전히 분자 층과 백질에서의 네 스틴 + 세포 집단을 배제 할 수 없으며, 따라서 네프의 연구에 사용될 수 없다. 관심의 세포를 제거하기 위해 레이저 에너지의 전달을 사용하여 레이저 캡처 미세 절제는 이종 조직 ^{(17, 18)의} 특정 세포를 분리하기 위해 사용되지만 캡처 세포에서만 DNA, RNA 및 단백질의 복구를 위해 사용될 수없는 수있는 또 다른 방법이다 수는 배양한다.

이 프로토콜은 특히 EGL에서 네프의 살아있는 순수한 인구를 분리하는 방법을 제공합니다.이 기술은 인식 할 수있는 해부학 적 구조 또는 형광 표지 세포 / 영역들 중 하나가 다른 조직 유형에 적용될 수있다. 따라서, 세포 격리 프로토콜에이 신규 한 미세 절제 기술을 통합의 주요한 장점은 세포 조직에 인접 오염을 제거하는 특정 조직 영역으로부터 분리 될 수 있고, 셀이 다른 애플리케이션에 대한 분석 또는 배양 즉시 수집 될 수 있다는 것이다.

Protocol

이 프로토콜에서 동물의 사용은 폭스 체이스 암 센터의 동물 관리 및 사용위원회의 승인 절차에 따라 수행되었습니다.

인스트루먼트, 솔루션 및 Coverslips는의 1 준비

1. # 5 미세 집게의 청소 두 세트, # 7 한 세트의 미세 곡선 포셉, 하나의 큰 수술 가위, 한 microdissecting 가위, 한 주걱 하나 천공 숟가락. 자체 밀봉 멸균 파우치 및 오토 클레이브에 악기를 배치합니다. 사용할 준비가 될 때까지 주머니에 상품을 보관하십시오.
2. 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 솔루션을 준비합니다.
   1. 거품이 나타날 때까지 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) 50 ㎖에 1.5 g 아가로 오스를 추가 한 다음 전자 레인지와 더위에 배치합니다. 모든 아가 때까지 소용돌이 플라스크 및 재가열은 해산했다. 수풀이 나타나면 이전 가열 교반 막대와 솔루션을 섞는다.
   2. 37 ° C의 물을 욕조에 보관 솔루션까지 필요.
   3. 장기 저장 상에 대한전자, 개월 동안 실온에서 4 ° C에서 향후 사용을 위해 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 액화 전자 레인지에 재가열. 아가로 오스 용액의 반복 가열 따뜻한 멸균 증류수 초기 중량을 유지하도록 가열하기 전에 플라스크의 무게.
3. ^{이전에이 설명} 된대로 파파인 기반의 세포 분리에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 :
   1. 멸균 페놀 레드를 DPBS에 함유 파파인 (100 U / ㎖), 시스테인 (0.2 ㎎ / ㎖) 및 DNase의 (250 U / ml)로 파파인 용액.
   2. 소 혈청 알부민과 오보 뮤코 이드 용액 (BSA, 8 ㎎ / ㎖), 대두 트립신 억제제 (8 ㎎ / ㎖))과의 DNase (250 U / ㎖) 멸균 페놀 레드 - 함유 DPBS에서.
      필터 솔루션을 모두 소독 및 페놀 레드 함유 DPBS의 원래 색상을 반환하는 산도를 조정합니다.
4. 세포 배양액 (NB / B27)를 제조 : 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM의 L-글루타민을, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S) 및 B27 보충제와 기저 용지를 보충. FilteR 소독 및 빛으로부터 보호합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서 미디어와 5 % CO _2를 평형.
5. FACS 버퍼를 준비 : 5 % 소 태아 혈청 DPBS에서 (FBS). 47.5 ML의 DPBS에 2.5 ML의 FBS를 추가합니다.
6. 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 된 커버 슬립을 준비합니다.
   1. 오토 클레이브 새로운 유리 커버 슬립.
   2. 코트 PDL와 커버 슬립 (멸균 증류수 100 μg / ㎖) 및 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 또는 실온에서 하룻밤.
   3. 세척 멸균 증류수로 된 커버. NB / B27 매체와 한 번 씻으십시오. 커버 슬립은 사용하기 전에 조직 문화 후드 완전히 건조 시키십시오.

조직 조각의 2 해부 및 준비

1. 해부의 날, 흡수 패드와 70 % 에탄올 및 커버 해부 영역을 닦아.
2. 멸균 파우치 해부 도구를 제거합니다. 얼음 차가운 얼음에 작은 페트리 접시와 장소에 멸균 DPBS / 1 % P / s의를 추가합니다.
3. 목을 벨 P4 MATH1-GF큰 수술 가위로 P / 네 스틴 - CFP 마우스 새끼는 잘 곡선 집게로 머리를 누르십시오. 피부를 제거하고 부드럽게 미세 겸자 후 주걱을 이용하여 두개골로부터 뇌를 꺼내서 DPBS / 1 % P / 초를 포함하는 페트리 접시로 전송 # 5와 두개골을 벗겨.
   1. # 5 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분합니다. 가능한 빨리 한 번에 하나의 강아지를 해부해야합니다.
   2. 분자 및 기능적 분석을위한 충분한 네프를 얻기 위해 8 소뇌의 최소 수집.
4. 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 용액을 2 × 2 × 2cm를 측정 삽입 금형을 입력합니다. 아가로 오스의 온도가 더 이상 37 °의 C 없는지 확인하십시오.
5. 실험실 조직을 부드럽게 dabbing에 의해 소뇌 물기를 제거합니다. 수직으로 금형에 소뇌를 놓습니다. 신속 공고히 할 수 있도록 얼음에 금형을 놓습니다. 블록 당 ~ 4 소뇌를 사용합니다.
6. 리를 얻진동 블레이드와 vibratome ving 조직 섹션. 면도날과 소뇌 함유 아가로 오스 블록을 낸다. 수직으로 지향 소뇌와 vibratome 판 아가로 오스 블록을 붙인다.
7. 아래 얼음처럼 차가운 멸균 DPBS / 1 % P / S와 장소 얼음 vibratome의 트레이를 입력합니다.
   1. 소뇌의 전체 길이를 600 μm의 섹션을 잘라. 천공 숟가락을 사용하여 얼음 트레이에서 섹션을 수집합니다. 얼음에 DPBS / 1 % P / S 가득 페트리 접시에 넣어 섹션.

3 이외에 Microdissection 및 세포 분열

1. 형광 해부 현미경 조직 슬라이스가 들어있는 페트리 접시를 놓습니다.
   1. 신중하게 (도 1에 점선 참조) CFP + 분자 층 및 GFP + EGL 사이에서 해부에 의해 미세 핀셋을 이용하여 소뇌 섹션의 나머지로부터 분리 EGL. 될 것이다, 분자 층의 일부를 포함하지 않도록주의하십시오네 스틴 발현 버그만 글리의 오염.
   2. 가능한 한 빨리이 단계를 완료하고 세포 사멸을 방지하기 위해 얼음에 조직을 유지합니다.
   3. 다음 단계로 진행하기 전에 주변 조직 아가로 오스를 제거한다.
2. 이전에 단일 세포 현탁액을 수득 ² 바와 같이 파파인 기반 프로토콜을 사용 microdissected EGL 조직 다이제스트.
   1. FACS를 통해 CFP 양성 세포의 수집을 위해 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다.

4 셀 정렬 및 도금

1. CFP 적절한 필터를 포함하고 얼음에 FACS 완충액에 세포를 수집 사이토 멸균, 고속의 흐름을 이용하여 CFP 형광 용 정렬 셀. 각 P4 소뇌에서 약 100,000 네프를 얻습니다.
2. 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. 추가 실험을위한 분자 분석이나 문화에 대한 즉시 세포를 사용합니다.
3. 배양 세포에, 미리 예열 NB / B27의 m에서 세포를 다시 일시 중단PDL-코팅 된 커버에 edia 및 판은 ^{이전에이 설명했다.}

Representative Results

도 1a에 도시 된 바와 같이, 소뇌 슬라이스 된 소뇌 EGL는 GFP 발현 GNPs을 지배하고, 분자 층은 CFP 양성 신경 교세포에 의해 농축시키고, P4 MATH1-GFP / CFP 네 스틴 - 마우스로부터 제조 하였다. (; 그림 1A 점선을 따라) EGL의 깊은 부분에있는 네프를 분리하려면 슬라이스 EGL 및 분자 층 사이에 microdissected되었다. 해부 EGLs (그림 1B)는 다음 FACS 다음 효소 분해에 수집되었다.

예상대로, 해부 EGL에서 세포의 대부분 (85 % 이상)은 GFP (그림 2A)에 대해 긍정적이었다 기존 GNPs이었다. 네프 EGL 세포 인구의 약 5 %를 (CFP +) 계정. 대부분의 세포 중 어느 것도 FACS 분석을 기반으로 GFP 및 CFP 더블 양성 없었다. FACS에 의해 정제 CFP + 세포는 분화 pote를 검사 체외 배양ntial. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 네프 독점적으로 β-튜 불린하는 + 뉴런을 배양 4 일 후에 초래했다, 제안 네프는 혈통 제한이 신경 전구 세포이다.

이 미세 절제 프로토콜에 의해, 네프와 GNPs 또한 EGL의 PTC 결핍 소뇌에서 정제 하였다. 두개 내 이식시, 네프는 네프가 종양 변환 ^구에 특히 취약 것을 나타내는 GNPs에 비해 더 빠르게 매크로 블럭을 개발한다.

EGL의 미세 절제의 영역의 그림 1 식별. P4 MATH1-GFP / 네 스틴 - CFP 동물에서 형광 이미지. CFP 식의 대부분은 분자 층에있는 동안 (A) GFP 발현, EGL에 있습니다. 미세 절제는 t 함께 이루어졌다그는 황색 점선. (B)는 조직 EGLs 해리 수집 하였다. 이 수치는 리 외 ^9에서 수정되었습니다.

그림 2 네프는 EGL에서 세포의 작은 인구를 대표하고 혈통 제한이 신경 전구 세포입니다. (A). microdissected EGL에서 격리 CFP + 세포의 유동 세포 계측법 분석 (B) 네프 4 일 동안 분화 조건에서 배양 및 β-튜 블린 (빨간색)에 대한 염색 및 DAPI (파란색)와 대조. 이 수치는 리 외에서 수정되었습니다. ⁹

Discussion

여기에 설명 된 미세 절제 방법은 분자와 기능적 분석에 사용하기 위해 살아있는 세포의 순수 모집단을 분리 할 제 절차이다. 리 등. ^구에 의해 알 수 있듯이, 이 방법에 의해 얻어진 배양 네프 다양한 실험에 통합 때문에 고순도, 또한 마이크로 어레이 분석에 이용 될 수있다.

그것은이 미세 절제 기술에 능숙하게 시간이 걸리는 것이 매우 중요하다. 네프는 네 스틴 발현 버그만 글리는 NEP 세포 격리을 오염 및 순도를 손상시킬 수있는 분자 층에 매우 가까이에 EGL의 깊은 지역에 위치하고 있습니다. 미세 절제 따라서 포함되지 않은 인접 조직에 있는지 오염 세포를 만들기 위해 보수적으로 수행해야합니다. 여기에 설명 된 미세 절제 기술의 주요 장점은 furthe 배양 살아있는 세포 수를 얻을 수있는 능력이다연구 실험. 이 때문에,이 절차의 모든 단계 중에 신속하게 수행하고 조직이 최대한 얼음에 보관하는 것이 중요하다. 또한, 모든 장비와 시약은 멸균해야합니다. 다음 단계를 수행하여 세포 사멸과 세포 배양 오염을 줄일 수 있습니다. 또한, 아가로 장착 블록 당 여러 소뇌는 시술 시간을 감소 시키는데 도움이된다.

이 기술은 네프 단리에 한정되지 않고, 백질에서 분자 층과 신경 줄기 세포로부터 신경 교세포 같은 소뇌의 다른 영역으로부터 세포를 수집하기 위해 사용될 수있다. 소뇌 게다가, 미세 절제는 예를 들면, 해마와 같은 인식 가능한 영역을 포함하고 다른 조직으로 사용될 수있다. 여기서 이용 형광 유전자로의 사용은, 경계를 만드는 보조 또는 용이하게 식별 영역이 부족한 조직에 특히 도움이 될 수 있고, 그렇지 않으면 m이 될 수 없을 것이다 해부 용 영역을 식별 할 수있다icrodissected. 따라서이 기술 분야의 연구 및 응용의 넓은 범위에서의 휴대 purifications 돕기 있었다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
Ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144