Summary
Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.
Abstract
Mikrodisseksiyon bir doku spesifik bölgelerini izole ve komşu bölgelerde hücresel kaynaklardan kirlenmeyi ortadan kaldırabilir yeni bir tekniktir. Bu yöntem, ilk çalışmada kullanılmıştır Nestin salgılayan progenitorlar (döküntüler), serebellar dış germinal tabakadan (EGL) hücrelerin yeni tespit edilen bir popülasyon. Floresan-aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) ile kombinasyon halinde kullanılması mikrodiseksiyon, neps saf nüfus serebellumda EGL geleneksel granül nöron habercilerden ve diğer kirletici Nestin salgılayan hücrelerin ayrı olarak toplanmıştır. Mikrodiseksiyonu olmadan, NEP'lerin fonksiyonel analizleri gibi Percoll santrifüj ve lazer yakalama mikrodiseksiyon olarak kullanılabilir mevcut yöntemleri ile mümkün olmazdı. Bu teknik aynı zamanda tanınan bölgeleri veya floresan ile etiketlenmiş ya da hücreleri içeren çeşitli dokularda kullanılmak için de uygulanabilir. Bu microdissectio en önemlisi büyük bir avantajdırn, teknik izole edilmiş canlı hücreler ve başka tarif edilen yöntemler ile mümkün değil ayrıca deney için kültürlenebilir olmasıdır.
Introduction
Beyincik, çok hücreli bir katman, her biri farklı hücre tiplerinde meydana gelir. Moleküler tabaka ve purkinje katman sırasıyla Bergmann glia ve purkinje nöronları içeren ise gelişme sırasında, EGL granül nöron öncüleri (kişi başına milli geliri) çoğalan içerir. Beyincik içinde derin nöral kök hücreler (NSC'lerde) ve oligodendrositleri 1 içeren beyaz madde, yatıyor.
Sonic dikenli proteini (Shh) serebellar gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı ve özellikle de, kendi reseptörü olan yamalı (PTC), Shh, 2-4, sinyal bir negatif düzenleyicisi bağlanarak kişi başına milli geliri çoğalmasını teşvik eder. Sus sinyal anormal aktivasyonunun Medulloblastom (MB), çocuklarda 5,6 en sık görülen kötü huylu beyin tümörü oluşturur.
Ptc mutant MB transgenik fare modelleri MB çalışma için güçlü araçlar vardır ve insan MB 7,8 benzeyen tümörler gelişebilir. Kullanarak bufarenin, bu kişi başına milli geliri kirpi tipi MB 7 kökenli hücre olduğu keşfedildi. Ayrıca, ek olarak kişi başına milli geliri, yakın zamanda da MB ortaya çıkmasına neden olabilir gelişen beyincikte de EGL içinde nöronal progenitörlerin benzersiz bir popülasyonu tespit ettik. Bu hücreler, tip VI filaman protein Nestin yüksek seviyelerde ifade etmek ve NEP 9 olarak adlandırılır. NEP EGL derin bölümü içinde yer alan ve sadece yenidoğan serebellar gelişme sırasında geçici olarak mevcut olurlar. Onlar kişi başına milli geliri olarak granül hücre soyu kararlıdır ama onlar sakin ve Math1, konvansiyonel kişi başına milli geliri 10 köklü bir işaretleyici ifade yok gibi farklıdır edilmektedir. Buna ek olarak, NEP onları MB tümörogenez için yeni bir kökeni yapar Şşş sinyal yolunun 9 aktivasyonu sonrası MB yol daha verimli kişi başına milli geliri verir.
Biz daha önce mikrodisseksiyon tekniği ile doğum sonrası 4. günde (P4) de serebellar EGL gelen NEPS izoleburada 9 nitelendirdi. Dokunun direkt mikroskopik ile mikrodiseksiyon serebellar EGL belirli diseksiyon sağlar. Nestin da serebellar beyaz cevher ve moleküler tabaka 1,7,11,12 Bergmann glia ile NSC'lerde ifade ve analizleri etkileyebilecek gibi o, bu hücreler dahil edilmemesi çok önemliydi gibi bu gereklidir. Microdissected dokudan izole edilen hücreler moleküler analiz için hemen kullanılabilir ya da daha fazla uygulama için kültürlenebilir.
Özellikle EGL Microdissecting yardımcı olmak için ve daha fazla nepler arıtmak için Math1-GFP (yeşil floresan protein) farenin Nestin-CFP (mavi floresan protein) fareler ile çaprazlandı. Math1 spesifik kişi başına milli geliri ve GFP ifadesi ile anlatılmak istenen, transkripsiyon faktörü EGL 9,13 açıkça görülebilir. Nestin-CFP farenin CFP nükleer şeklinde ifade ve kolayca moleküler tabakanın 9,14 olarak görselleştirilebilir. Birlikte, GFP ve CFP ifade EGL mikrodiseksiyonu için sınırlarını oluşturmak (Şekil 1). CFP pozitif NEP daha sonra kesilmiş EGLs enzimatik ayrışma sonrasında, FACS ile izole edilmiştir.
Şu anda, EGL hücreleri izole etmek için en çok kullanılan yöntem, tüm beyincik dokusuna 15,16 Percoll gradient santrifüjleme. Ancak bu metot, tam olarak moleküler tabakanın beyaz maddeden Nestin + hücre popülasyonlarının dahil yapamaz ve dolayısıyla neps çalışma için kullanılamaz. Ilgi hücreleri çıkarmak için lazer enerjisinin transferini kullanan lazer yakalama mikrodiseksiyon, heterojen bir doku 17,18 içinde belirli hücreleri izole etmek için kullanılabilir, ancak yakalanan hücreleri sadece DNA, RNA ve proteinin geri kazanılması için kullanılan ve değildir başka bir yöntemdir edebilmek yetiştiriciliğine.
Bu protokol, özellikle EGL gelen NEP'lerin bir canlı, saf bir nüfusunu yalıtmak için bir yol sağlar.Bu teknik aynı zamanda tanınan anatomik mimari veya flüoresan etiketli hücre / alanlara sahip farklı doku türlerine uygulanabilir. Bu nedenle, hücre izolasyon protokolleri, bu yeni mikrodiseksiyon tekniği içeren en büyük avantajı, hücreler, doku komşu kirletici ortadan kaldırmak için özel doku bölgeleri izole edilebilir ve hücreler, diğer uygulamalar için veya kültür analizi için hemen elde edilebilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde hayvanların kullanımı Fox Chase Kanser Merkezi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Göstergeler, Çözümler ve lameller 1. Hazırlık
- # 5 ince forseps temiz iki takım, 7. bir set ince kavisli forseps, büyük bir cerrahi makas, bir Microdissecting makas, bir spatula ve bir delikli kaşık. Kendi kendine yapışan bir sterilizasyon kese ve otoklav içindeki aletleri yerleştirin. Kullanıma hazır olana kadar kese aletleri tutun.
- % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözelti hazırlayın.
- Kabarcıklar ortaya çıkıncaya kadar steril Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde 50 ml 1.5 g agarozun Add mikrodalga ve ısı yerleştirin. Tüm agaroz kadar girdap içinde eritildi ve yeniden ısıtma çözülene. Kümeleri görüldüğünde ısıtmadan önce bir karıştırma çubuğuna sahip olan çözüm karıştırın.
- Bir 37 ° C su banyosunda solüsyon deposu kadar gerekli.
- Uzun süreli Saklama Sistemi İçine ay boyunca oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de gelecekte kullanılmak üzere agaroz çözüm saklayın. Sıvılaştırılması için mikrodalga ısıtın. Agaroz çözeltinin tekrar ısıtılması için ılık steril damıtılmış su ile başlangıç ağırlığı korumak için ısıtmadan önce şişeyi tartın.
- Daha önce tarif edildiği gibi 2 papain temelli hücre ayrılması için aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
- Steril fenol kırmızı DPBS ihtiva eden papain (100 U / ml), sistein (0.2 mg / ml) ve DNAse (250 U / ml) ile bir papain çözeltisi.
- Büyükbaş hayvan serum albümini ile bir ovomukoid çözeltisi (BSA, 8 mg / ml), soya fasulyesi tripsin önleyici (8 mg / ml)) ve DNaz (250 U / ml) steril kırmızı olmayan fenol ihtiva eden DPBS.
Filtre hem çözümler sterilize ve fenol kırmızı içeren DPBS orijinal rengini geri dönmek için pH ayarlamak.
- Hücre kültürü ortamı (NB / B27) hazırlanması: 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin,% 1 penisilin-streptomisin (P / S), B27 eki ile bir bazal ortam ek. FilteR, sterilize ve ışıktan korur. Kullanımdan önce, 37 ° C'de ve ortam% 5 CO2 dengelenmesi.
- FACS tamponu hazırlayın:% 5 fetal sığır serumu, DPBS (FBS). 47.5 ml DPBS 2.5 ml FBS ekleyin.
- Poli-D-lisin (PDL) kaplı lamelleri hazırlayın.
- Otoklav Yeni cam lamelleri.
- Kaplayın PDL lamelleri (steril damıtılmış su içinde 100 ug / ml) ve 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir ve gece boyunca oda sıcaklığı.
- Yıkama steril damıtılmış su ile lamelleri. NB / B27 medya ile bir kez yıkayın. Lamelleri kullanmak için önce doku kültürü kaputu tamamen kurumasını bekleyin.
Doku Dilimleri 2. Diseksiyon ve Hazırlık
- Diseksiyon gününde, emici bir ped ile% 70 etanol ve kapak ile diseksiyon alanı silin.
- Sterilizasyon kesesinden diseksiyon aletleri çıkarın. Buz soğuk, buz üzerinde küçük bir petri ve yere steril DPBS /% 1 P / S ekleyin.
- Decapitate P4 Math1-GFBüyük cerrahi makas ile P / Nestin-OBP fare yavrular sonra ince kavisli bir forseps ile kafa basılı tutun. Cilt kaldırın ve yavaşça ince forseps daha sonra bir spatula kullanarak kafatası beyin kepçe ve DPBS /% 1 P / S içeren Petri kabı aktarmak # 5 ile kafatasını soymaya.
- # 5 ince forseps kullanarak, dikkatli bir beynin geri kalanından beyincik ayrı. Mümkün olduğunca çabuk bir defada bir yavru incelemek için emin olun.
- Moleküler ve işlevsel analiz için yeterli lif düğümlerinin elde edilmesi için 8 cerebella az toplayın.
- % 3 düşük erime sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisiyle 2 x 2 x 2 cm büyüklüğünde bir gömme kalıp doldurun. Agaroz sıcaklığı fazla 37 ° C olduğundan emin olun.
- Laboratuar doku yavaşça dabbing beyincik fazla sıvıyı çıkarın. Dikey konumda kalıba beyincik yerleştirin. Hızlı bir şekilde katılaşmasına izin vermek için buz üzerinde kalıp yerleştirin. Blok başına ~ 4 cerebella kullanın.
- Li edinintitreşimli bıçak vibratom ile Ving doku bölümleri. Bir jilet ile serebellası içeren agaroz blok Trim. Dikey konumda yönlendirilmiş cerebella ile vibratome plakasına agaroz blok tutkal.
- Altında buz-soğuk steril DPBS'de / 1% P / S ve yer buz ile vibratome tepsiyi doldurun.
- Beyincik tüm uzunluğu boyunca 600 um kesitler halinde kesilmiştir. Delikli bir kaşık kullanarak buz tepsiden bölümleri toplayın. Buz üzerinde DPBS /% 1 P / S ile dolu bir Petri tabağına yerleştirin bölümleri.
3. Mikrodisseksiyon ve Hücre Ayrılma
- Bir floresan mikroskop altında doku dilim içeren Petri kabı yerleştirin.
- Dikkatle (Şekil 1 'de noktalı çizgi bakınız) CFP + moleküler tabakası ve GFP + EGL arasında kesilmesi yoluyla ince pensler kullanılarak bir serebellar bölümün geri kalanından ayırmak EGL. Neden olacaktır, moleküler tabakanın herhangi bir bölümünü dahil değil dikkatli olunNestin-ifade Bergmann glia kontaminasyon.
- Mümkün olduğunca çabuk bu adımı tamamlayın ve hücre ölümünü önlemek için buz üzerinde doku tutun.
- Bir sonraki aşamaya geçmeden önce dokuyu çevreleyen agaroz çıkarın.
- Daha önce tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tarif edildiği gibi 2 papain tabanlı bir protokol kullanarak microdissected EGL doku Digest.
- FACS üzerinden CFP-pozitif hücrelerin toplanması için FACS tampon hücreleri yeniden askıya.
4. Hücre Sıralama ve Kaplama
- Uygun bir CFP filtresini içeren ve buz üzerinde FACS tamponu hücreleri toplamak sitometresi steril, yüksek hızlı akışı kullanılarak CFP floresan için sıralama hücreleri. Her P4 beyincik yaklaşık 100.000 NEPS edinin.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri. Daha fazla deney için moleküler analiz veya kültür için hemen hücreleri kullanır.
- Kültür hücreleri, önceden ısıtılmış NB / B27 m hücreleri yeniden askıyaPDL kaplı lamelleri edia ve plaka daha önce 2 nitelendirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, serebellar dilim hangi serebellar EGL GFP ifade kişi başına milli geliri hakim ve moleküler tabaka CFP pozitif glial hücreler tarafından zenginleştirilmiş P4 Math1 GFP / Nestin-CFP farelerden hazırlandı. (Şekil 1A kesikli hattı boyunca) EGL derin kısmında bulunan lif düğümlerini izole etmek için, dilimler EGL ve moleküler tabaka arasında microdissected edildi. Disseke EGLs (Şekil 1B) daha sonra FACS ile izlenen enzimsel ayrışma için toplanmıştır.
Beklendiği gibi, kesilmiş EGL hücrelerin bir bölümü (% 85'e kadar), GFP (Şekil 2A) için pozitif olduğu bilinen kişi başına milli geliri idi. NEP EGL hücre nüfusun sadece yaklaşık% 5 (OBP +) hesabı. Hemen hemen hücrelerin hiçbiri, FACS analizi göre GFP ve CFP Çift pozitif idi. FACS ile arıtılmış, CFP + hücrelerinin farklılaşma POTE incelemek için in vitro olarak kültürlendintial. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, özel NEP β-tubulin ile + nöronların kültür içinde 4 gün sonra yol açmıştır, işaret NEP soy yoktur nöronal progenitorlar bulunmaktadır.
Bu mikrodiseksiyon protokol ile, NEP ve kişi başına milli geliri de EGL PTC eksikliği serebellum saflaştırılmıştır. Intrakranial nakli üzerine, NEP NEP onkojenik transformasyon 9 özellikle duyarlı olduğunu gösteren, kişi başına milli geliri ile karşılaştırıldığında daha hızlı MB'ları gelişir.
EGL mikrodiseksiyon bölgenin Şekil 1. tanımlanması. P4 Math1-GFP / Nestin-CFP hayvanlardan Floresan ve görüntüler. CFP ifade çoğunluğu moleküler tabakanın içinde yer almaktadır (A) GFP tanımı, EGL bulunur. Mikrodisseksiyon t boyunca yapıldıo sarı noktalı çizgi. (B) 'EGLs doku ayrılması için toplanmıştır. Bu rakam, Li ve arkadaşları 9 modifiye edilmiştir.
Şekil 2. NEP EGL hücrelerin küçük bir nüfusu temsil ve soy-kısıtlı nöronal atalarıdır. (A). Microdissected EGL izole CFP + hücrelerinin akış sitometri analizi (B), NEP 4 gün için farklılaştırma koşullar altında kültürlenir ve β-tübülin (kırmızı) için boyandı ve DAPI (mavi) ile zıt boyama yapılmıştır. Bu rakam, Li ve arkadaşları modifiye edilmiştir. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntem mikrodiseksiyon moleküler ve fonksiyonel analizlerde kullanım için canlı hücreler saf bir popülasyonu izole etmek mümkün ilk işlemdir. Li ve ark. 9 ile gösterildiği gibi, Bu yöntemle elde edilen NEP kültürlenmiştir ve çeşitli deneyler dahil edilir ve olduğu gibi yüksek saflıkta, aynı zamanda mikro-dizi analizi için de kullanılabilir edilebilir.
Bu mikrodisseksiyon tekniğiyle ustalaşmanın zaman çok önemlidir. NEP-Nestin ifade Bergmann NEP glia hücre izolasyonu kirletebilir ve saflık tehlikeye sokabilecek bir moleküler tabakanın çok yakın EGL derin bölgede yer alır. Mikrodisseksiyon nedenle dahil değildir komşu dokuda emin kirletici hücreleri yapmak için konservatif yapılmalıdır. Burada açıklanan mikrodiseksiyon tekniğin en önemli avantajı, ilave edilen boyunca kültürlenebilir canlı hücreler elde etmek için yeteneğir deney. Bu nedenle, bu işlem sırasında tüm adımları hızlı bir şekilde yapılabilir ve bu doku mümkün olduğu kadar buz üzerinde muhafaza edilmesi çok önemlidir. Ayrıca, tüm alet ve reaktifler steril olması gerekmektedir. Bu adımları izleyerek hücre ölümü ve hücre kültürü kirlenmeyi azaltacak. Buna ek olarak, agaroz blok başına birden fazla montaj serebellası işlem süresini azaltmaya yardımcı olacaktır.
Bu teknik, neps izolasyonu ile sınırlı değildir ve bu beyaz madde çıkan moleküler tabakası ve nöral kök hücrelerinden glial hücreleri gibi diğer alanlarda beyincik, hücreleri toplamak için kullanılabilir. Beyincik dışında mikrodisseksiyon örneğin, hipokampus gibi tanınabilir bölgeler içeren diğer dokuları ile kullanılabilir. Burada kullanılan floresan Transgenlerin kullanımı, sınırları oluştururken yardım veya kolayca tanımlanabilen alanları eksikliği dokularda özellikle yardımcı olabilir ve aksi m olması mümkün olmaz diseksiyon için bölgeler, belirleyebiliricrodissected. Bu nedenle bu teknik alanda araştırma ve geniş bir uygulama aralığında, hücre saflaştırma yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar yardım flow sitometri James Oesterling teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (R01-CA178380, ZY) ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Doktora Sonrası eğitim bursu (5T32CA009035-37, LWY) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
