Abstract
すべての既知の疾患の大部分は、心血管系の障害を伴う。心血管病態中に活性化相互作用する経路の複雑さへの研究は、しかし、堅牢かつ生理学的に関連する方法の欠如によって制限されている。病理学的な血管イベントをモデル化するために、我々は、内皮および全血の間の相互作用を研究するためのインビトロアッセイを開発した。アッセイは、ヒト全血と接触して配置されている一次ヒト内皮細胞から構成されている。この方法は、血管内に存在する分子と細胞成分との間の微妙な相互作用の研究を可能にする、全くないか非常に少ない抗凝固剤とのネイティブな血液を利用しています。
我々は、またはヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）なしでインキュベートし、異なる血液容量によって凝固の活性を比較することによって、アッセイの機能性を調べた。大きな血液量はに貢献したのに対し、トロンビンはアンチトロンビン（TAT）複合体の形成の増加は、HUVECの存在は、凝固の減少活性化をもたらした。さらに、本 発明者らは、腫瘍壊死因子（TNFα）で刺激し、CD16 +細胞の存在は、TNFαに有意に高いことが見出さHUVECへの白血球の付着の画像解析を適用し、血液接触後の非刺激細胞と比較して、細胞を刺激した。結論として、アッセイは、内皮および血液区画との間の相互作用が乱されている血管の病理を研究するために適用することができる。
Introduction
心血管疾患、血液血管の相互作用を分析するための方法は、一般に、動物研究実験を含む。実験的研究、動物モデルで作成された結果はこのように、しかし、ヒトの疾患のほとんど、または全く意味を有していてもよい1,2、血液区画と血管内皮細胞間の細胞間相互作用を調査するためのインビトロモデルにおいて良好で信頼性のための必要性がある人間のようなシステム。そこで我々は、血液内皮細胞チャンバーモデルを確立している。これは、生体材料とヒト全血との間の相互作用を調査するために使用前に説明したモデルに基づいている。通常、精製された成分の数を制限し、他のin vitroでのセットアップの3反しすなわち、血小板は、白血球または内皮細胞が利用可能で、現在のモデルは、すべて組み込まれて血管中に存在する成分。
血液内皮cの設定エル室モデルはほとんど、または全く追加の抗凝固剤との新たに採取したヒト血液の使用を可能にするように設計されている。より長い期間の間保存された血液は、赤血球の破壊は、血液および内皮細胞との間の微妙な相互作用を妨害し得る、いわゆる記憶病変を取得する。4
ex vivoでの全血の取り扱い中に血餅形成を回避するために抗凝固剤または血液と接触するすべての材料が非活性である必要は、高用量のいずれかを必要とする。非活性化表面のような材料は、代替的に固定化されたヘパリンの保護層を備えていてもよい、実験室環境ではまれである。血液接触は、凝固カスケードの活性化を引き起こすことなく、発生する可能性表面を形成する大部分の材料に適用することができる固定化されたヘパリンの保護層（以下、Corlineヘパリン表面（CHS）と呼ばれる）。5したがって、とチャンバ家具によってCHS、血液内皮CEllの室モデルは、血液中の抗凝固剤の非常に低い濃度の使用を可能にする。血液内皮室モデルにおける抗凝固剤の高濃度の添加を回避する他の方法でマスクされる可能性があり、血管内の敏感な相互作用を研究することを可能にする。6
プラスチック製顕微鏡スライドに：;（9ミリメートル、半径8ミリメートル、高さ）の血液内皮細胞室モデルは、プラスチック製のシリンダーを取り付けることにより形成された二つの室から構成されています。シリンダーに上向きに縁が細胞培養スライドに対してチャンバーを密封するため使用されるゴムのOリングが付いていた溝が付いています。チャンバは部分的にしかチャンバは、その後、垂直位置（ 図1）に回転すると、チャンバ内に残された空気が移動中の血液を保持するように、血液で満たされている。
モデルの機能性を評価するために、我々は完全に被覆されたCHSのいずれかで実験を行ったチャンバまたはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）。二つの別々の血液量をアッセイし、トロンビンアンチトロンビン（TAT）複合体（凝集の間接的マーカー）の形成は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）で測定した。次に、血液量の影響を評価し、腫瘍壊死因子（TNFα）は、画像解析により、白血球動員に内皮細胞を刺激した。
血液内皮細胞室モデルの1.セットアップ図。 （A）上部PMMAで作ら血液チャンバの概略図を表示する。（B）一次ヒト内皮細胞を、1ウェルチャンバースライド上で培養される。新鮮ヒト全血を、顕微鏡スライド上の2つのチャンバに添加される。チャンバおよび血液を処理するために使用されるすべての材料は、保護HSコーティングで処理される。 CEの壁を除去した後llの培養スライドは、細胞は血液に面して配置され、システムがシャットダウンをクランプする。（C）血液内皮細胞チャンバを37°Cで回転させながらインキュベートする。その後、血液区画における反応は、ELISAによって分析され、内皮細胞は、顕微鏡検査によって分析することができる。
Protocol
注：血液はウプサラの倫理審査委員会（許可番号264分の2008）と承認にオープンシステムの静脈穿刺により健常人から採取した。
1.播種細胞
- PBS pH7.4中1％ゼラチンでコーティングしたT75フラスコ中、5％、37℃で培養初代ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）CO 2。
- T75のHUVECを含むフラスコ（または一次ヒト内皮細胞の他のタイプ）からの培養培地を除去し、PBSのpHは7.4で2.1 mMのEDTAを用いて細胞を洗浄する。 37℃で3分 - 1ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを追加し、2インキュベートすることによって細胞を剥離。
- PBS pH7.4中に9ミリリットルの10％FBSの入ったフラスコをすすぐことによって細胞を収集し、15mlチューブに細胞懸濁液を移す。 5分間735×gで細胞をスピンダウン。
- 上清を除去し、内皮細胞増殖培地微小血管（EC GMMV）で慎重に細胞ペレットを再懸濁し、ビルケルチャンバー内の細胞を数える。シード21000 C1ウェル細胞培養スライド中のエル/ cm 2で、37℃でインキュベートする。培養2日 - HUVECを1の後にコンフルエントされます。光学顕微鏡下で毎日の細胞形態とフルエンシーを監視します。
全血の調製
- 製造元の指示に従って固定化されたヘパリン（CHS）の二重層と血液と接触するすべての人工表面を準備する。ほこりから保護CHS材料がコーティングされた機能を喪失することなく6ヶ月まで室温で保存することができる。
- 血液内皮室実験を開始する直前に健康なドナー（<30分）から血液を描画するオープンシステム静脈穿刺を使用してください。慎重にCHSコーティングされた50ミリリットルチューブに血液を採取する前に：カップルは、皮下注射針CHS被覆されたシリコンチューブ（2ミリメートル内径）に（18 Gが50ミリメートルをX）。未分画ヘパリンと補足血液は0.75 IU / mlの最終濃度に到達する。 inveにより穏やかに血液を混ぜる3回 - チューブ2をrting。
3.血液内皮商工モデル
- PMMAスライド（25×75ミリメートル）に接着されている2シリンダー（高さ8ミリメートルと半径9ミリメートル）から成るアクリルポリメチルメタクリレート（PMMA）で、血液室（トップビュー図1A）を製作する。培養内皮細胞（ 図1B）でガラススライドに対する血液チャンバをシールするゴム製のOリングで上向きシリンダの端部を取り付ける。その後垂直位置（ 図1C）中の内皮細胞と培養スライドに接続された血液チャンバーを回転させます。
- 血液を活性化しないように注意しながら、各CHSコーティングされたチャンバー内に1.5ミリリットルの血液を転送するために、CHSコーティングされたピペットチップを使用してください。
- 使用した初期血漿タンパク質濃度の決定のために、10mMのK 3 EDTAの最終濃度に達するように30μlの0.34 MK 3 EDTAを含む微小遠心管に転送1血液ml酵素免疫測定法（ELISA）を。慎重に血液を混ぜ、氷上にチューブを保つ。
- 製造業者の指示に従って細胞培養スライドガラスのプラスチック壁を取り外し、慎重にPBS pH7.4中で細胞を洗浄する。その後スライドからできるだけ多くの液体を除去してください。細胞が完全に乾くせてはいけない。
- 血液に直面して細胞を用いて、血液室の上にスライドを置きます。血液内皮細胞室の周りにクランプを置くことによって、スライドを固定します。クランプを配置するときに、細胞培養スライドガラスの破損を回避するために、追加のサポートのためのプラスチック製のスライドを使用する。
- 37℃の水浴中で回転するホイール上の血液内皮細胞チャンバを修正（40直径cm）の場所。 30分間の0.5×gでホイール上の各チャンバを回転させる。
- インキュベーション後、血液内皮細胞チャンバを解体。 PBS pH7.4中での細胞培養スライドを洗浄し、氷冷1％パラホルムアルデヒド（PFA）は、fで細胞を固定10分。 μlの0.34 MK 3 EDTAを30を含むマイクロ遠心チューブに各チャンバからの転送を1mlの血液を、10mM K 3 EDTAの最終濃度を達成し、穏やかにチューブを混合する。氷の上でチューブを保管してください。
- 4℃で10分間4560×gでチューブを遠心。さらなる分析まで-70℃で新しいマイクロ遠心チューブや店舗への血液の血漿を転送します。
血液内皮相互作用の解析4。
- 二次ヤギ抗マウスアレクサ488およびファロイジン - テキサスレッドに続くマウス抗ヒトCD16で免疫蛍光染色を行います。室温で1時間各染色工程を実行し、各ステップの間にPBS（pH7.4）中でスライドを洗浄する。室温で10分間、DAPIによる核の対比染色。このようCellProfilerのような適切な画像分析ソフトウェアを用いて画像解析と組み合わせて、蛍光顕微鏡により内皮細胞に結合した血液成分を分析する。
- QUANTIFY血漿サンプルの製造元の指示に従ってトロンビン - アンチトロンビン（TAT）をELISAで血液区画における反応。
- 例えば 、適切な統計ツールを使用してください。、不対t検定を、データを分析する。
Representative Results
CHSコーティングの必要性
内皮細胞によって誘発されるものと、特定の全血での反応を測定するために、血液内皮細胞チャンバに使用されるすべての材料は、使用前にCHSコーティングを提出しなければならない。 図2A（左）の30分後、コーティングされていないチャンバを示しているはっきりと見えるクロット存在と血液接触。一方、CHSとの室（ 図2A、右）を治療することは結果が内皮細胞の血液の相互作用によるものであることを確認して、制御不能な活性化からの血液を保護します。
チャンバー内の血液量の影響
活性化された凝固因子の間の相互作用の確率が増加するにつれて、凝固の活性化は、停滞血液中の可能性が高い。血液内皮細胞室モデルでは、血液に起因チャンバ内の気泡の循環に運動状態に維持される。 O中血液量の変化、ひいては気泡サイズの効果を決定するRDER、CHSコーティングされたチャンバーを1.5 mlまたは1.75ミリリットル、30分間、全血を用いて試験したCHSコーティングされたガラススライドに接続した。血液1.75mlの血液を1.5mlの（ 図2B）を用いた場合と比較して、チャンバーに添加されたときに気泡による任意の動きなしでの血液の体積が2.5倍大きい。測定されたTAT-値が増加した血液量（ 図2D）と増加したTAT-形成を示唆した。 HUVEC（ 図2C）は 、全血の1.5または1.75ミリリットルのいずれかとインキュベートした場合、差異は内皮細胞が凝固の活性化（ 図2D）を調節し得ることを示唆し、両群間で認められなかった。
血液細胞動員に対するTNFαの効果と凝固の活性化
白血球動員に対するTNFαの効果を研究するために、HUVECを治療するた20ng / mlの前に血液接触へのTNFα4時間とエド。血液接触- 2.4 mlまたは1.75ミリリットルの血液のいずれかでは、 -培養スライドを画像化し、CD16 +細胞の数を定量した、CD16（ 図2F）について染色した後、30分間継続した。 CD16 +細胞の動員を、1.5mlの血液を100〜256 CD16 +細胞/ mm 2（p <0.0001）からのTNFα処理（ 図2E）で有意に増加し、172から1.75ミリリットルの血液と378（P <0.0001）である。 TAT複合体の形成は、TNFα処理又は未処理細胞のいずれか（ 図2G）とインキュベートした血液の対応する血漿サンプル中で測定した。未処理の細胞と比較して、TNFα刺激細胞は、TAT複合体の約2倍を誘導した。
イチジクURE 2：血液内皮細胞室モデルの機能性。 CHSの有無にかかわらず、（A）チャンバーは、全血とともにインキュベートした。 CHSことなく、血餅を30分後に形成された。 CHSなしでインキュベートした血液中のトロンビン-アンチトロンビン（TAT）複合体は、凝固の間接的なマーカーの測定は、> 6000 / mlであった。（B）血液の量は、異なる血液量に応じて変化する回転気泡により移動維持されない。コンフルエント単層の位相差顕微鏡ショー典型的な内皮細胞形態で画像化し、それが1.75ミリリットルを加えて0.74ミリリットルに増加するのに対し、血液1.5mlを追加すると、このボリュームは、0.3ミリリットルになります。（C）HUVECの前に異なる血液ボリュームが追加されたときに完全にコーティングされたCHS室用の血液接触。（D）のTAT値はわずかな違いを示しています。 1.5ミリリットルの血液を添加すると、85が得られた1.75ミリリットルに±11μg/ mlのた（n = 7）と比較して35を生じた77。 70 / mlのTATた（n = 8）。 HUVECは、同じ血液量と共にインキュベートされた場合、この差は、もはや存在しない。 1.5ミリリットルのための66±55μgの/ mlである（n = 5）で66±29 1.75ミリリットル（nは7 =）非刺激またはTNFαのいずれかでCD16 +細胞の数の（E）定量存在した後にHUVECを刺激するためのμg/ mlの血液接触。 CD16 +細胞の数が有意にTNFαと共に増加されるか、1.5ミリリットル（基礎：100±40細胞/ mm;TNFα：256±121細胞/ mm）とインキュベートした細胞刺激1.75ミリリットル（基礎：172±67細胞/ mmと、 TNFα：全血の378±185細胞/ mm）（F）HUVECはファロイジン（赤色について染色刺激され、刺激されていないとTNFαの代表的な画像）、CD16（緑色）及びDAPI（青色）。スケールバー=250μmの血液（1.5 mlをインキュベート未処理細胞と比較してTAT複合体の形成はほぼTNFαによって倍増される（G）の細胞を刺激した：2。1±0.1倍のTAT、n = 3である。 1.75ミリリットル：1.7±1.0倍のTATはn = 4）。すべての値は平均±標準偏差として提示されている。 p値は、不対t検定によって計算した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
血液と血管壁との間の複数の相互作用は、通常による内皮の非粘着性および抗血栓性のために静止状態に維持される。7炎症を伴う病理学的状態の間、内皮は接着受容体の発現8で得られた増加と活性化され止血を阻害する能力が低下。今度は血液中のカスケードシステムの9の活性化は、さらに血栓症および白血球動員を引き起こす内皮の血栓形成を増幅する。10内皮細胞および全血の間のこの微妙な相互作用のより良い理解を得るために、我々は持っている培養された内皮細胞は、全血と接触して配置されているインビトロ方法における新規に開発した。我々の知る限りでは、私たちのセットアップは、より長い期間のために全く又はほとんどない抗凝固剤とのヒト全血とインキュベートした内皮細胞を示す最初のものである。
塩基 ">このシステムの感度は、血液と接触して配置されるすべての表面上に固定化されたヘパリンの保護層と組み合わせてオープン系静脈穿刺によってイネーブルされる。血液調達中に開放系の使用は、静脈穿刺時に、カスケードシステムの活性化を減少させる抗凝固剤の自己決定された量の使用を可能にしながら、市販の真空に血液チューブは、しかし、研究の意図されたエンドポイントに応じて使用することができる。ほとんどの市販のクローズドシステムのチューブに加え、抗凝固剤の最終濃度を敏感阻害することができる、そうでなければ、ハード設定で、相互作用を研究するために、図6を保護ヘパリン表面はさらに、内皮細胞以外の表面による面接触を通る血液の活性化を排除する5確かに、未分画ヘパリンの少量を補充した全血のインキュベーションCHSの保護なしチャンバは、血餅形成をもたらした。さらに、TNFαは、独立して、血液量のTATの重形成と組み合わせてHUVEC活性化に向けて血液細胞の動員における2倍の増加があった。これは、モデル系の安定性を検証し、また、全血との組合せで活性化された内皮細胞を使用する可能性を示している。将来、血液内皮細胞チャンバは、活性化の様々な条件やステージの下の細胞上で発現されるマーカーの種々の活性化内皮細胞に対する白血球の動員を調査するために使用することができる。さらに、モデルは、炎症状態に対する効果を評価するために、薬理学的薬剤と組み合わせて使用することができる。
要約すると、我々は、血管疾患の関連性の調査を実行するためにインビトロ系で完全なヒトを作成するためにヒト血液と血管細胞とチャンバモデルを組み合わせて大きな利点を示す。
Acknowledgments
この研究は、n 602699（DIREKTを）°グラント契約の下、スウェーデンの研究評議会（90293501、A0290401、A0290402）、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムからの助成金によって支えられ、NovoNordisk財団、GurliとエドワードBrunnberg財団は、セラピー、Vleugel幹財団とオーケWiberg財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
References
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