应用立体定位注射技术研究基因对动物行为的影响

摘要

通过立体定位注射表达 cDNA 或 shRNA 的慢病毒，可调控小鼠特定脑区的基因表达。本文中，我们介绍了一种将立体定位注射与行为学实验（如旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST））相结合的实验方案。

摘要

立体定位注射是一种有用的技术，可用于将高滴度的慢病毒递送至小鼠脑内的特定区域。慢病毒可在相对局限的脑区实现基因的过表达或表达敲低，同时对脑组织造成较小损伤。注射后经恢复，可对小鼠进行多种行为学任务测试，例如开放旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）。开放旷场实验通过测量小鼠在新颖开放环境中央区域停留的时间，用于评估其运动能力及焦虑表型。相较于对照组，焦虑程度更高的小鼠在新颖环境中央区域停留的时间显著更短。强迫游泳实验则通过量化小鼠被置于水桶中时静止不动的时间，评估其抗抑郁表型。具有抗抑郁表型的小鼠相较于对照动物，其静止不动的时间显著减少。本实验方案的目标是结合慢病毒立体定位注射与行为学测试，探究遗传因素如何调控动物行为。

引言

小鼠在神经生物学研究中被广泛使用，因为其基因操作较为简便。基因敲除技术使研究人员能够探究每个遗传因子如何影响小鼠的行为。此外，Cre-loxP 系统为小鼠中组织和细胞类型特异性的基因敲除提供了有力工具，使研究人员能够在不同组织中研究基因功能¹。然而在实际应用中，Cre 启动子的表达模式难以精确控制，迄今为止许多已建立的 Cre 驱动小鼠品系尚未实现特定脑区的表达^2,3。

或者，立体定位注射是一种针对成年小鼠特定脑区的方法。通过注射表达cDNA或shRNA的基因工程病毒，可实现特定脑区的基因表达调控。尽管每只小鼠的脑大小存在差异，但可利用小鼠颅骨上的解剖标志点所建立的立体定位坐标来确定特定脑区的位置。最常用的解剖标志点包括前囟（bregma）、后囟（lambda）和耳间线（interaural line）。根据脑图谱提供的坐标⁴，可通过从前囟/耳间线交点出发的前后（A/P）、内外侧（M/L）和背腹（D/V）三个轴向精确定位各个脑区。通常，注射到小鼠脑内的病毒会标记红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP），以便通过荧光显微镜确认注射位置。

对小鼠进行行为学评估对于精神疾病的基础研究尤为重要。患者的精神疾病症状通常表现为异常行为。其中一些人类行为在进化上具有保守性，可在小鼠中直接模拟并观察。例如，可通过测量小鼠的“行为绝望”来建立抑郁症模型。抑郁症患者常感....

方案

注意：所有涉及动物的实验方案均遵循宾夕法尼亚州立大学动物护理指南及 IACUC #44057 的规定

1. 慢病毒生产

注意：转染前一天，LentiX-293 细胞应达到 80% 汇合度。

1. 转染前用 DMEM 清洗细胞，并在 10 ml 含青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 µg/ml）的 DMEM/10% FBS 中于室温孵育 5 分钟 。
2. 将 DNA 与聚乙烯亚胺（PEI）（1 mg/ml）按 1:3 的比例（1 µg DNA : 3 µl PEI）溶于 1 ml DMEM 中，涡旋混匀 1 分钟。所加 DNA 的体积取决于 DNA 浓度。室温孵育 10 分钟。
   1. 例如，每皿使用 20 µg 质粒 DNA，包括 10 µg 载体质粒、5 µg psPax2¹⁴ 质粒、5 µg 水疱性口炎病毒（VSV）质粒，以及 60 µl PEI。
3. 再次涡旋混匀 DNA 与 PEI 溶液 1 分钟，室温孵育 10 分钟。
4. 加入相当于总培养基体积 1/10 的 DMEM（即 在 100 mm 培养皿中，10 ml 培养基加入 1 ml）。将 1 ml DNA-PEI 混合液逐滴加入培养皿中，并轻轻旋转培养皿，使混合液与培养基充分混匀。....

结果

精确的立体定位注射在很大程度上依赖于正确设定坐标。用于注射病毒的针尖应准确置于前囟（bregma）与耳间线的交点处（图1）。使用体视显微镜有助于判断针尖是否放置到位。通过显微镜观察时，应调整针的位置，使得一旦注射病毒，其注射点恰好位于前囟与耳间线的交点处，即注射针头的开口应正对准该交点上方。本研究中，将一种表达针对外显子连接复合体核心因子 RBM8a 的 shRNA 的慢病毒注射至齿状回。该慢病毒同时表达红色荧光蛋白（RFP），以标记被感染的神经元。图2 显示病毒已成功注射至目标区域，红色信号清晰指示了注射位置（图3）。

为了在行为学任务中达到显著性，每组小鼠的数量应在12至15只之间。行为学任务可在立体定位注射后两周进行。在开放旷场实验（OFT）中，若小鼠在开放场中心区域停留的时间显著少于对照组，则表现为焦虑表型。结果表明，在成年小鼠齿状回中敲低RBM8a会导致焦虑样行为（p <0.05，图4）。在强迫游泳实验（FST）中.......

讨论

立体定位注射的成功依赖于三个因素：保持小鼠存活、设定正确的坐标零点（针尖位于前囟与耳间线的交点处），以及设定从零点到目标位置的正确深度（针尖刚好接触脑组织表面）。小鼠的存活至关重要。通过确保小鼠得到充分麻醉并接受足量镇痛剂，有助于提高术后存活率¹⁷。已知疼痛是术后恢复不良的主要原因之一。在整个手术过程中确保小鼠完全麻醉（对足部夹捏无反应），并根据小鼠体重给予正确剂量的镇痛剂，有助于提高存活率。此外，小鼠在整个手术过程中直至从麻醉中苏醒前，都应置于加热垫上。麻醉状态下小鼠无法调节体温，在手术期间体温会显著下降。即使立体定位手术时间相对较短，低体温仍可能严重损害小鼠的存活。正确的缝合技术对于成功完成手术也至关重要。小鼠可能会尝试撕扯缝线，因此必须确保缝线足够牢固以防止其自行拆除，但又不能过紧而对伤口造成过大张力。每个缝合结打四个结可确保小鼠无法拆除缝线。良好的缝合非常重要，因为开放性伤口会增加感染风险，从而对后续的行为学实验产生负面影响。

旷场实验（OFT）是一种用于评估小鼠运动能力和焦虑表型的行为学范式。在测试小鼠行为时，操作小鼠和设置实验场地需格外谨慎。OFT.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential 立体定位泵	Stoelting co.	53311
注射器，65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
剪刀	精细外科工具	14084-08
钝头镊子	精细外科工具	11002-12
持针器	精细外科工具	12001-13
钻机	Ram Products Inc	Microtorque 控制箱，Tech2000 手柄	带脚踏板
玻璃珠灭菌器	Inotech	IS-400
可吸收缝线	Unify	M-K518r19	可吸收，反向切割
棉签	VWR	89031-270
加热垫	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
人工泪液	Rugby	NDC 0536-6550-91
一次性注射器	BD Syringe	309623
布巾
手套	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin 或其他麻醉剂	参见配方引用
酮洛芬或其他镇痛剂	参见兽医
追踪软件	Noldus	Ethovision XT
追踪摄像头	Noldus	Media Recorder