Tillämpa stereotaktisk injektion teknik för att studera genetiska effekter på djurens beteenden

Summary

Stereotaktisk injektion av lentivirus uttrycker cDNA eller shRNAs kan modulera genuttryck i specifika områden i hjärnan på möss. Här presenterar vi ett protokoll för att kombinera stereotaktiska injektioner med beteende uppgifter, till exempel Open Field Test (OFT) och tvångs Simma Test (FST).

Abstract

Stereotaktisk injektion är en användbar teknik för att leverera hög titer lentivirus riktade områden i hjärnan hos möss. Lentivirus kan antingen överuttrycker eller knockdown genuttryck i en relativt fokuserad region utan väsentlig skada på hjärnvävnaden. Efter återhämtning, kan den injicerade musen testas på olika beteende uppgifter såsom Open Field Test (OFT) och tvångs Simma Test (FST). OFT är utformad för att bedöma förflyttning och den oroliga fenotyp i möss genom att mäta den tid som en mus bringar i centrum av en ny öppet fält. En mer angelägen mus kommer att spendera betydligt mindre tid i mitten av den nya fältet jämfört med kontroller. FST bedömer antidepressiva fenotyp genom att kvantifiera den mängd tid som mössen tillbringar orörliga när de placeras i en hink med vatten. En mus med en anti-depressiv fenotyp kommer att spendera betydligt mindre tid orörlig jämfört med kontrolldjur. Målet med detta protokoll är att använda STEReotactic injektion av en lentivirus i samband med beteendetester för att bedöma hur genetiska faktorer modulerar djurbeteenden.

Introduction

Musen har använts i stor utsträckning i neurobiologi, eftersom det är lätt att manipulera genetiskt. Gene knockout tekniker tillåter forskare att undersöka hur varje genetisk faktor formar mus beteenden. Dessutom ger den cre-loxP-systemet ett värdefullt verktyg för vävnads- och cell typ- specifik gen knockout hos möss, vilket gör det möjligt för forskare att studera geners funktion i olika vävnader. ¹ Men i praktiken, uttrycksmönster CRE promotorer är svåra att kontrollera , och så långt många etablerade CRE förare har inte uppnått regionspecifika uttryck. ^2,3

Alternativt är stereotaktisk injektion en metod som inriktar sig på specifika områden i hjärnan av den vuxna musen. Genom att injicera genetiskt manipulerade virus som uttrycker cDNA eller shRNA, kan uppnås regionspecifik modulering av genuttryck. Även om hjärnans storlek av varje mus varierar, kan placeringen av specifika delar av hjärnan bestämmas med hjälp av stereotaktisk samordningennater in från landmärken på skallen av musen hjärnan. De mest vanligen använda landmärken är bregma, lambda, och den interaurala linjen. Använda koordinater som erhållits från en hjärnatlas, kan ⁴ vart varje hjärna område identifieras av antero-posterior (A / P), medial-laterala (M / L), och rygg-ventrala (D / V) axlar från bregma / interaural linje korsning. Typiskt virus injicerades i hjärnan hos möss är märkta med antingen rött eller grönt fluorescerande protein (RFP eller GFP), så att injektioner kan bekräftas genom fluorescerande mikroskopi.

Beteende bedömningar av möss är särskilt nödvändigt för grundforskning av psykiska störningar. Symtom på psykiatriska störningar hos patienter innebär vanligtvis onormala beteenden. Vissa av dessa humana beteenden är evolutionärt konserverade och kan direkt efterliknas och observeras i mus. Till exempel, kan depression modelleras i musen genom att mäta beteende förtvivlan. Personer med depression OFTsv känns som om ingenting de gör någonsin kommer att hjälpa, ett symptom som så småningom kan leda till självmord. Hos gnagare kan detta modelleras med hjälp av tvångs Simma Test (FST), som mäter den tid en mus simma kontra flytande i en pool av vatten (ses som att ge upp). Detta paradigm valideras genom att rädda fenotypen med antidepressiva. ^7,8,9 Möss som fått antidepressiva kommer att spendera betydligt mindre tid orörlig jämfört med obehandlade kontroller. En annan beteendetestet, Open Field Test (OFT) är utformad för att bedöma förflyttning i möss, och dessutom kan användas för att analysera den oroliga fenotyp i möss. ^5,6 Detta test är baserat på antagandet att möss känner sig tryggare när de är nära på väggen i ett nytt öppet fält. Möss av vildtyp kommer så småningom undersöka den nya miljön, eftersom de är nyfikna djur. Men tillbringa mindre tid i mitten av fältet indikerar ångest hos mus, som musen inte kommer att kunna övervinna inil rädsla orsakas av en ny miljö. Ångest av musen, som kvantifierades genom den mängd tid som tillbringas i mitten av ett öppet fält, kan jämföras med klinisk ångest hos människor, som är närvarande i många psykiatriska störningar.

Kombinationen av stereotaktiska injektioner med beteende paradigm är ett nytt sätt för att förändra uttrycket av en specifik gen på ett målinriktat hjärnområde. Effekten av modulerade genuttryck på mus beteenden kan sedan bestämmas. I motsats till hela hjärnan knockout, är denna metod speciellt användbar eftersom den endast inriktar sig på specifika områden i hjärnan. Dessutom är stereotaktiska injektioner vanligen utförs i den vuxna vildtyp mus därför endogen genexpression har upprätthållits under hela utvecklingsstadier. Denna metod kommer att undvika FÖRBRYLLA effekt om genen krävs för överlevnad under den embryonala eller postnatal utvecklingsstadium. En viktig begränsning är att de experimentella mössen behöver gå rakt igenomh en invasiv kirurgi, där skallarna hos möss måste öppnas. Dessutom är graden av gen module bestäms av titern och effektiviteten av viruset. Viruset måste sprutas in i rätt område med hjälp av stereotaktiska koordinater, som kräver särskilda instrument. Kontroll av korrekt injektionsstället kan bara slutföras efter slakt.

Denna metod har tidigare använts för att testa medverkan av en specifik gen i olika neurologiska sjukdomar. Exempelvis viralt medierad RNAi targeting TH-genen (som tillåter dopamin som skall syntetiseras) injicerades i substantia nigra compacta, och rörelsebeteendeanalys genomfördes. ¹⁰ En annan studie användes stereotaktisk injektion av ett lentivirus ljuddämpnings DISC1 att bedöma mus uppträdande i samband till schizofreni. Knockdown av DISC1 lett till ökad förflyttning som svar på nyhet (paralleller positiva symtom vid schizofreni), och större orörlighet iFST. ¹¹ På samma sätt fann ytterligare en studie som 5-HT _1B uttryck ledde till ökad undersökande beteende i OFT, i linje med en anti-ångest fenotyp med denna metod. ¹² stereotaktiska injektioner kan leverera CRE viruset att framkalla rekombination i cre-loxP möss . Denna metod användes för att selektivt ta bort Y2-receptom i amygdala och sängen kärnan av stria termin. Vid beteendeanalys, var dessa möss visade sig en anti-depressiv fenotyp när genen togs bort i den centrala amygdala, men ingen fenotyp när genen ströks i den basolateral amygdala eller sängen kärnan i stria termin. ¹³ Således, denna teknik ger ett unikt verktyg för att studera den genetiska påverkan på djurbeteenden.

Protocol

OBS: Alla protokoll som involverar djur följdes i enlighet med riktlinjerna för djur hand om Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. Lentivirus Produktion

OBS: Dagen före transfektion, bör LentiX-293-celler vara 80% konfluens.

1. Skölj celler med DMEM strax före transfektion och inkubera i 10 ml DMEM / 10% FBS med penicillin (100 lU / ml) och streptomycin (100 | ig / ml) under 5 min vid RT.
2. Späd DNA och Polyetylenimin (PEI) (1 mg / ml) i 1: 3-förhållande (1 | j, g av DNA: 3 | il PEI) i 1 ml DMEM och vortexblanda i 1 minut. Volymen av DNA tillsätts är beroende av koncentrationen av DNA. Inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
   1. Använd till exempel 20 mikrogram av DNA-plasmid, som består av 10 mikrogram av vektorplasmiden, 5 mikrogram av psPax2 ¹⁴ plasmid, 5 mikrogram av vesikulärt stomatitvirus (VSV) med 60 il PEI per fat.
3. Lägg ett / 10th volym av totalt odlingsmedium DMEM (dvs. 1 ml för 10 ml odlingsmedium i en 100 mm skål). Tillsätt 1 ml av DNA-PEI blandning droppe för droppe i skålen och snurra skålen runt tills till odlingsmediet är väl blandat med DNA.
4. Inkubera under 6 h vid RT och avlägsna supernatanten. Tillsätt 5 ml odlingsmedium.
5. 48 h efter transfektion, samla virala supernatanten och centrifugera vid 627 xg under 5 min vid 4 ° C i en 50 ml tub. Filtrera 30 ml av virala supernatanten genom ett 0,45 fim sprutfilter in i ett ultracentrifugrör.
6. Lägg sterilt vatten för att balansera rören och täcka rör med liten bit av parafilm. Spin rören vid 11.249 xg under 120 min vid 4 ° C. Ta bort vätskan med hjälp av en vakuumspets.
7. Tillsätt 100 ni kall PBS röret. Skaka röret vid 4 ° CO / N.
8. För att åter skjuta upp viruset, pipetten than PBS tillsätts i steg 1.8 under pellets 10 gånger, var noga med att inte röra pelleten med spetsen. Pelleten kommer inte åter avbrytas tills detta är klart.
9. Alikvotera viruset vid 10-20 ^ il per rör, flash-frysning i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.

2. Stereotaktisk injektion

2.1) Framställning av instrument

1. Placera en sax, trubbig-end pincett, en nål hållare, skalpell, bomullspinnar, och en trasa i en förseglad förpackning med en steriliseringsindikator, och autoklav före operation. Dessutom får 10% povidonjod, 70% etanol, absorberbara suturer, en värmedyna, artificiella tårar, en glaspärla autoklav, borra, en borrkrona, 2 engångssprutor, en injektionsspruta, rakapparat, smärtstillande (ketoprofen) bedövningsmedel (avertin), handskar och en stereotaktisk apparat med insprutningspumpen.
2. Gör 1,25% avertin lösning färska dagen, filter i en steril huva med hjälp av en 0,2 &# 181; m sterilt sprutfilter och placera i en steril ampull serum. Blanda 2,5 g 2,2,2-tribrometyl alkohol till 5 ml tert-amylalkohol, då löser sig i 200 ml vatten. Håll pH under 5. ¹⁵

2.2) Framställning av musen

1. Administrera avertin baserat på vikten av musen (375 mg / kg). ¹⁵ Injicera musen med avertin via en intraperitoneal (IP) injektion, och sedan placera tillbaka till sin bur tills den är helt sövd.
2. Ge ett smärtstillande medel via IP-injektion (ketaprofen, 5 mg / kg), och plats artificiella tårar på ögonen på musen för att förhindra uttorkning.
3. Se till att musen är helt sover genom att nypa sin fot. Om musen svarar på foten nypa, sedan ge mer bedövningsmedel (i doser om 50 fil). Raka huvudet av musen med hjälp av en elektrisk rakapparat. Raka området som skall opereras (typiskt från strax bakom öronen, till toppen av nosen), och det omgivande området.
4. Placera musen into den stereotaktiska anordningen. Spärr framtänderna på den främre klämman och sänk klämman och dra åt så att käken är helt säker.
5. Sätt i örat barer i hörselgången att helt stabilisera huvudet. Var noga med att inte sätta örat barer för långt, vilket kan skada innerörat. När du är klar, ska kroppen av musen kunna flyttas något utan att störa läget för huvudet.
6. Placera en värmedyna under musen för att reglera musens kroppstemperatur under hela förfarandet.
7. Rengör operationsområdet ordentligt. Med hjälp av en bomullspinne, gnida 10% povidonjod i en cirkulär rörelse, med början från mitten av operationsstället och rör sig utåt. Använd sedan en bomullstuss att gnida 70% etylalkohol på operationsområdet på samma sätt. Upprepa två gånger.

2.3) Första snitt

1. När musen är förberedd öppnar steril utrustning väska. Byt handskar innan touching instrumenten. Ta ut den sterila trasa och placera instrument på duken. Om något instrument berör en un-steril yta, använd glaspärla autoklav under 15 sekunder för att sterilisera det.
2. Ta skalpell i den dominerande handen och trubbig-end pincett i den icke-dominanta handen. Använd trubbiga änden pincett till försiktigt grepp huden på musen, och gör ett snitt med hjälp av skalpell. Börja snittet ca 1,5 cm ovanför öronen (mot näsan) och sträcker sig till ca 0,5 cm under öronen. Utöka snittet vertikalt i mitten av musens huvud för att exponera bregma (Figur 1).
3. När bregma visualiseras, ta en steril bomullsspets för att försiktigt avlägsna eventuellt blod som täcker ytan av skallen. Använd två bomulls tips för att driva huden mot sidan av huvudet.

2.4) Utrustning Setup

1. Efter något blod avlägsnas från ytan av skallen, och bregma är klart visualiseras, förbereda sprutan (concentrationen av 10 ⁸ TU / ml, volym 1 pl). I dragskåp, fylla sprutan med det virus som skall injiceras. Se till att inga bubblor är inne. Placera sprutan i stereoapparaten, och se till att den är helt säkrad.
2. Långsamt sänka sprutan tills den är precis ovanför ytan av skallen, så att spetsen av den sterila injektionsnålen ställs in till korsningen mellan bregma och den interaurala linjen. Ställ denna punkt som noll, och bestämma koordinaterna från denna punkt.
3. Beroende på hjärnan område av intresse, varierar de stereotaktiska koordinaterna. Bestäm koordinaterna genom att använda hjärnan atlas ^4. När koordinaterna bestäms, flytta nålen på sprutan för att matcha dessa koordinater. Rikta gyrus gyrus med hjälp av koordinater: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Sänka nålen till höger ovanför skallen att visualisera där hålet måste borras.
4. Lyft sprutan något, ta borren och placera borr bit precis ovanför målet borrplatsen i ungefär 45 ° vinkel mot skallen. Börja borrning, och hålla borrning tills skallen ger vika. När skallen ger vika, kan en nedgång i motstånd påvisas. Var noga med att inte borra i hjärnan, för att förhindra kortikala skador.
5. Ta en steril bomullsspets och torka bort blod från hålet.
6. Sänk sprutan så att spetsen sitter rätt på ytan av hjärnan (inte skallen). Ställ D / V koordinat (djup) till 0. Sänk sprutan till önskat djup, baserat på hjärnan atlas koordinater. För att nå gyrus gyrus, sätta D / V till -1,79 mm.
7. Starta injektion vid en hastighet av 0,2 | j, l / min. Titta för att säkerställa att sprutan inte glider lägre än det önskade djupet. Om detta inträffar, försiktigt lyfta sprutan till önskat djup igen.
8. Efter injektionen är avslutad, vänta ca två minuter för att säkerställa att eventuellt kvarvarande virus har absorberats. Sakta höja sprutan och använda en bomullsspets för att avlägsna eventuella liquid från injektionsstället.
9. Upprepa för den andra halvklotet.

2,5) Suturering

1. Ta den sterila sutur och nål ur förpackningen och gripa nålen med hjälp av nålhållare. Face den spetsiga kanten av nålen från nålhållaren. Håll trubbiga änden pincett i den icke-dominanta handen, och använda den för att gripa huden på musen. Börja med den dominerande handen.
2. Tryck försiktigt sutur genom huden och använd trubbiga änden pincett för att ta tag i huden på andra sidan av snittet. Dra suturmaterialet genom tills ca 0,75 tum kvarstår.
3. Släpp nålen och använd trubbiga änden pincett för att linda sutur runt nålhållaren en gång, sedan ta tag i 0,75 tum återstående sutur med nålhållaren och dra suturen igenom, så att nålen och nålhållaren hamnar på den sida av huvudet som är motsatt den som de var på ursprungligen. Detta bör utgöra en knut.
4. Upprepa detta stegtre gånger, omväxlande den sida av huvudet nålhållaren hamnar på varje gång.
5. Skär suturen och upprepa steg 2.5.1-2.5.3 tills snittet stängs.

2.6) postoperativ vård

1. Försiktigt bort örat barer från mus och ta bort sin käke från den främre klämman.
2. Håll musen på värmedyna tills den vaknar och går runt på egen hand. Övervaka musen dagligen, och hålla och utkik efter tecken på smärta, såsom inte grooming, äta eller dricka. Ge ytterligare smärtstillande vid behov.

3. Öppna Fälttest

3.1) Konfigurera

1. Skaffa en tom ruta, plast arena med dimensionerna 50 cm x 50 cm, med 50 cm höga väggar (men kan vara något större). Rengör arenan med 70% etylalkohol före början av experimentet. Se till att etylalkohol har helt torkat innan du placerar en mus in på arenan.
2. Placera arenan påvåningen, och försöka se till att belysningen är inställd på att minimera skuggor och reflexer.
3. Om du använder mjukvara, placera kameran direkt overhead av det öppna fältet, cirka 1,5 ft över öppna fält (tillräckligt långt bort för att fullt ut omfatta hela arenan, men tillräckligt nära för att ha en klar bild av musen).
4. Inrätta en zon i mitten av rutan (cirka en yta av 30 cm x 30 cm). ¹⁶ För att ställa in en zon genom att klicka på zon 1 flik i sidopanelen.
   1. Välj en form kontur i den övre panelen, och beskriver hur omkretsen av mittzonen. Välj lägga zon, och klicka på insidan av mittzonen. Med hjälp av anvisningarna program namnge zonen (detta kommer att kallas "centrum" för denna procedur). Om beteende testet görs för hand, se till att botten av fältet är uppdelat i 10 cm x 10 cm torg, märkta med tejp.
5. Ställ upp programvaran så att inställningarna är korrekta, och musen är lätt visigänglig på skärmen. Uppnå detta genom att justera inställningarna detektions på maskinen för att vara kompatibel med testarenan (belysning) och mus-färg.
   OBS: När inställningarna är korrekta, bör systemet spåra endast musen, och inga skuggor eller urin / avföring. De särskilda programinställningar beror på belysning av arenan, och färgen på musen.

3.2) Acklimatisering och Test

1. Flytta experimentella möss i beteende rum 1 timme före provet för att acklimatisera dem till sin omgivning. Låt möss i sin bur för acklimatisering.
2. Slå på kameran för att tejpa beteende uppgiften och placera musen mot mitten framför arenan så att musen är vänd mot väggen.
3. Ställ in timern under 5 min, och steg bort från arenan. Om det är möjligt, lämna rummet så att inte av misstag påverka musen.
4. När 5 minuter är upp, ta musen och placera dem i sin bur.
5. Använd 70% etylalkohol för att rengöra i fältet innan du fortsätter till nästa musen. Se till att etylalkohol har helt torkat.

3,3) Bedömning

1. Betrakta musen som att vara i centrum av fältet när alla fyra tassar är inne mitten 30 cm X 30 cm.
2. Kvantifiera mängden tid som musen tillbringar i mitten. Alternativt, avgöra den här gången med hjälp av mjukvara (t.ex. Noldus ethovison).
   1. För att göra detta, gå till fliken analys, och klicka på "rörelse" under analysprofiler. Radera kategorierna för närvarande fastställts, och välj sedan "i zonen" under fliken platsen. Välj mittzonen. Nästa, välj "analys output" (under fliken resultat) för att visa resultat. En tabell över tiden orörlig för varje försök ska visas.
3. Annars gör det OFT hand. Den öppna fältet ska ha 25 10 cm x 10 cm rutor som beskrivs på botten av öppn fält (som beskrivs i steg 3.1.3). Kvantifiera den tid musen tillbringar i centrum, förutom antalet poster i mitten av arenan. ¹⁶
   OBS: Center 30 cm X 30 cm stort område anses vara centrum av det öppna fältet. En mus anses lever mittområdet om alla fyra tassar är inuti 30 x 30 cm stort område.

4. Forced Swim Test

OBS: Låt det gå minst fem dagar mellan beteende uppgifter.

4.1) Konfigurera

1. Skaffa en 2 L klar hink och fyll med 22 ° C vatten. Placera hinken på ett bord, och försöka se till att belysningen är inställd på att minimera skuggor och reflexer.
2. Om du använder mjukvara, placera kameran direkt overhead hinken.
3. Ställ in programvara så att musen är väl synlig på skärmen.

4.2) Acklimatisering och Test

1. Flytta experimentella möss in i beteende roOm 1 timme före testet att vänja omgivningen. Låt möss i sin bur för acklimatisering.
2. Slå på kameran för att tejpa beteende uppgiften. Försiktigt, placera musen i mitten av hink vatten. Se till att inte släppa musen i. Långsamt sänka musen, så att dess främre fötter vidrör vattnet först. Var noga med att förhindra att deras huvud från att sänka.
3. Ställ in timern för 6 minuter, och steg bort från beteendeområdet.
4. När 6 minuter är upp, ta bort musen från hinken, och torka bort överflödigt vatten innan du placerar musen tillbaka i sin bur.

4,3) Bedömning

1. Om du använder mjukvara, ställa procent orörlighet till 11%, som föreslagits av Noldus (detta bör vara standardinställningen), att kvantifiera tid flytande kontra simning.
2. För att kvantifiera med hjälp av spårningssystem, gå till fliken analys, och klicka på rörlighet enligt analysprofiler. Radera kategorierna för närvarande fastställts, och välj sedan rörlighet tillstånd, påden vänstra sidopanelen (under individens beteende). Ställ orörlighet till 11%.
3. Välj spår visualisering, under fliken resultat. Välj analys utgång (under fliken resultat) för att visa resultat. En tabell över tiden orörlig för varje försök ska visas.
4. Om handen poäng, mäta tiden musen bringar simning eller klättring, och hur lång tid musen bringar orörlig. Dessutom mäter latensen till första gången orörliga. Se figur 2 i resultat avsnitt.

Representative Results

Exakt stereotaktisk injektion är starkt beroende av att ställa de rätta koordinaterna. Spetsen på nålen som används för att injicera viruset bör sättas direkt på skärningspunkten mellan bregma och interaurala linjen (Figur 1). Det är bra att använda en stereo att fastställa huruvida nålen är korrekt placerad. När man tittar igenom mikroskopet, bör nålen placeras så att om viruset injicerades, skulle det landar direkt på skärningspunkten mellan bregma och interaurala linjen. Det vill säga, öppningen i sprutans nål bör placeras direkt ovanför korsningen. I denna studie, ett lentivirus som uttrycker shRNA mot RBM8a, en kärnfaktor i exon korsningen komplexa, injicerades i dentate gyrus. Den lentivirus uttrycker också RFP att märka infekterade neuroner. Figur 2 visar att viruset injicerades i rätt region som indikeras av den röda signalen (Figur 3).

_content "> För att uppnå betydelse i beteende uppgifter, bör provstorleken varierar från 12 till 15 möss per grupp. Beteende uppgifter kan utföras två veckor efter stereotaktisk injektioner. I OFT, föreligger en ängslig fenotyp om möss spenderar betydligt mindre tid i centrum av det öppna fältet jämfört med kontrollgruppen. Resultaten indikerar att knockdown av RBM8a i dentate gyrus hos vuxna möss leder till ängs beteenden (p <0,05, figur 4). I FST, fanns ingen observerbar skillnad i orörlighet mellan kontroll- och experimentmöss, vilket antyder att RBM8a knockdown i gyrus dentatus inte påverkar antidepressiv beteende (figur 5). Statistisk analys bestod av att utföra en två-tailed, två prov-olika varians t-test.

Figur 1: Skärningspunkten mellan Bregma och Interfonetiska Line. För stereotaktiska injektioner, bör sprutan nålen uppradade med skärningspunkten mellan bregma och interaurala linjen. Denna punkt är satt till noll.

Figur 2: Schematisk illustrerar tidslinjen för hela experimentet.

Figur 3: Representant hjärna skiva illustrerande lyckad injektion av virus i gyrus dentatus Skalan bar = 100 | j, m..

Figur 4: Den tid som kontroll- och experiment möss Tillbringade i centrum av en roman öppet fält Experimentella möss spenderar Signif.icantly mindre tid i centrum av arenan, vilket indikerar en ängslig fenotyp (n = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, medelvärde SEM)

Figur 5:. Den tid som kontroll- och experiment Möss är orörliga i FST Experimentella möss skiljer sig inte från kontroller i tid orörlig (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, medelvärde SEM)

Discussion

Framgångsrika stereotaktiska injektioner lita på tre faktorer: att hålla musen liv, ställa rätt nollpunkten för koordinaterna (nålspetsen på skärningspunkten mellan bregma och interaurala linje), och ställa rätt djup till nollpunkten (nålspetsen precis vidrör det yttre av hjärnvävnad). Den livskraft möss är viktigt. Kirurgi överlevnad kan underlättas genom att se till att musen är ordentligt sövda och får adekvat smärtstillande. Smärta är känd att vara en viktig orsak till dålig återhämtning efter kirurgi. Att se till att musen är helt bedövad under operationen (det bör inte svara på fot nyper), och ge rätt dos av smärtstillande (baserat på vikten av musen), bör bidra till överlevnad. ¹⁷ Dessutom bör musen hållas på en värmedyna under hela operationen tills den vaknar upp ur narkosen. Möss kan inte reglera sin kroppstemperatur när de bedövas. Deras kropp humörratur kommer att minska kraftigt under operationen processen. Även om längden av stereotaktisk kirurgi är relativt kort, kan hypotermi allvarligt försämra mus överlevnad. Korrekt suturering teknik är också avgörande för att genomföra en lyckad operation. Möss kommer att försöka plocka på sina suturer, så det är viktigt att se till att suturerna är tillräckligt stram för att förhindra avlägsnande, men inte för hårt så att lägga alltför mycket spänning på såret. Fyra knop i varje stygn bör se till att musen inte kan ta bort suturen. Korrekt suturering är viktig som ett öppet sår kommer att öka känsligheten för infektioner, vilket skulle påverka eventuella beteendeexperiment negativt.

OFT är en beteende paradigm för att bedöma förflyttning och den oroliga fenotyp i möss. Vid provning mus beteende, är det viktigt att vara mycket försiktig när du hanterar mössen och inrätta arenan. I OFT är paradigm som syftar till att koppla ihop musens gripandet when placeras i en ny miljö, med dess naturliga nyfikenhet och lust att utforska nyhet. En vild typ mus kommer inledningsvis att vara tveksam till att komma in i mitten av det öppna fältet, där det är mer sårbar, men så småningom kommer att göra det, på grund av sin inneboende nyfikenhet. I en orolig mus, kommer gripandet att korsa en mer sårbar utrymme (mitten av fältet) vara större än deras naturliga nyfikenhet och lust att utforska, vilket resulterar i betydligt mindre tid i centrum. För att se till paradigm fungerar korrekt, är det viktigt att minimera stress i samband med de andra än det öppna fältet faktorer. Stress kan minimeras genom att låta musen för att anpassa sig till den beteende rummet (så den yttre miljön inte är en möjlig confounding variabel), och rengöring i fältet mellan möss, för att garantera att alla dofter förknippade med föregående musen har tagits bort. ¹⁸ Dessa åtgärder bör bidra till att eliminera eventuella skillnader som orsakas av felaktigt hanteringshjälpmedelng möss. I denna studie tillbringade RBM8a knockdown möss betydligt mindre tid i mitten av ett nytt öppet fält, jämfört med kontroller. Detta är en indikation på en ängslig fenotyp, eftersom möss är mindre benägna att komma in i mitten av den nya öppet fält, där de är mer sårbara, jämfört med kontroller.

FST strävar att undersöka den anti-depressiva fenotyp i möss. När den placeras i en hink med vatten, möss som tillbringar betydligt mindre tid flytande kontra simning anses ha en anti-depressiv fenotyp. Orörlighet i den påtvingade simma testet tolkas som beteende förtvivlan (t.ex. ge upp). Detta paradigm är validerat av antidepressiv behandling. ^7,8,9 Möss som får antidepressiva läkemedel kommer att spendera betydligt mindre tid floating jämfört med kontroller, vilket tyder på en anti-depressiv fenotyp. I denna studie hade RBM8a knockdown möss inte skilja sig nämnvärt från kontrollmöss i tid orörlig. This anger att RBM8a knockdown i dentate gyrus av vuxna möss inte framkallar en depressiv, eller anti-depressiva fenotyp. I vår tidigare studie, RBM8a uttryck i dentate gyrus hos vuxna möss minskar avsevärt tid orörlig jämfört med kontroller, vilket tyder på en antidepressiv effekt. ¹⁶

De stereotaktiska injektioner används för representation i detta dokument riktade till gyrus gyrus. Gyrus dentatus valdes som målstället, eftersom den intressanta genen uttrycks kraftigt där i vuxen mus. Dessutom har gyrus dentatus förknippats med depression och ångest. Till exempel använde en studie POMC-ChR2 möss för att selektivt aktiverar granulceller i antingen rygg eller ventrala dentate gyrus. Aktivering av både rygg och ventrala gyrus dentatus lett till ökad utforskning av en ny miljö, vilket tyder på en potentiell roll dentate gyrus i ångest. ¹⁹ En annan studiefann att möss med nedsatt neurogenes hade ökat orörlighet i FST, vilket tyder på en depressiv fenotyp. ²⁰ Dessutom aktivering av Ap oa ₁ i framhjärnan leder till en antidepressiv effekt i FST, nyhet undertryckta utfodring, och sackaros konsumtion test. När VEGF slogs ned i dentate gyrus av Ap oa _1, var detta anti-depressiv fenotyp vilse. ²¹ Dessa data tyder på att gyrus gyrus har en roll i patofysiologin av ångest och depression, och uppgav att gyrus gyrus kan vara ett bra område att målet för vår genetiska modulering och beteendeexperiment. En lentivirus användes specifikt, så att alla celler i gyrus gyrus skulle vara smittade, i motsats till endast delande celler (retrovirus).

En kombination av dessa tre experimentell design (utöver andra beteende uppgifter) är ett nytt sätt att bedöma beteende fenotyper hos möss, eftersom ett virus kan injiceras i en specific hjärnan området vid specifika utvecklingstider. Använda stereotaktiska injektioner av en lentivirus parat med beteende uppgifter tar bara några månader att slutföra och låter forskare att samla in preliminära uppgifter om beteendeeffekter av genuttryck i ett visst område i hjärnan. Däremot villkorad knockout-möss tar ofta flera år att skapa. Dessutom kan celltyp preferens av virus användas för att ytterligare målceller. Till exempel kan retrovirus endast infekterar delande celler (såsom neurala stamceller i gyrus dentatus), medan ett lentivirus infekterar alla celltyper. ^22,23 således tillsammans med co-injektion, dessa allmänt använda och individuellt validerade experimentella protokoll ger en snabb men omfattande sätt att testa rollen av specifika genen på ett målinriktat hjärna område, på mus beteenden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder