Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Summary

Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).

Abstract

Stereotactische injectie is een nuttige techniek om hoge titer lentivirussen leveren aan gerichte hersengebieden bij muizen. Lentivirussen kunnen hetzij overexpressie of knockdown genexpressie in een relatief geconcentreerde gebied zonder significante schade aan het hersenweefsel. Na het herstel, kan de geïnjecteerde muis worden getest op verschillende behavioral taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST). De OFT is ontworpen om de voortbeweging en de angstige fenotype bij muizen beoordelen door het meten van de hoeveelheid tijd die een muis doorbrengt in het midden van een nieuw open veld. Een angstig muis aanzienlijk minder tijd in het midden van het nieuwe veld in vergelijking met controles. De FST beoordeelt de anti-depressieve fenotype door het kwantificeren van de hoeveelheid tijd die de muizen onbeweeglijk doorbrengen indien opgelost in een emmer water. Een muis met een anti-depressieve fenotype zal aanzienlijk minder tijd immobiel vergelijking met controledieren brengen. Het doel van dit protocol is om de ster te gebruikeneotactic injectie van een lentivirus in combinatie met gedrags-tests om te beoordelen hoe genetische factoren moduleren dierlijk gedrag.

Introduction

De muis is op grote schaal gebruikt in neurobiologie omdat het gemakkelijk genetisch te manipuleren. Gene knockout technieken kunnen de onderzoekers te onderzoeken hoe elke genetische factor vormen muis gedrag. Bovendien is het cre-loxP systeem een waardevol instrument voor weefsel- en cel type- specifiek gen knockout muizen, die onderzoekers in staat stelt bestudering van genfunctie in verschillende weefsels. ¹ In de praktijk, expressiepatronen van cre promoters zijn moeilijk te beheersen , en tot nu toe veel gevestigde cre stuurprogramma's zijn niet regio-specifieke expressie bereikt. ^2,3

Alternatief stereotactische injectie is een methode die specifieke hersengebieden van de volwassen muis gericht. Door het injecteren van genetisch gemanipuleerde virussen die cDNA of shRNA kan regiospecifieke modulering van genexpressie bereikt. Hoewel de omvang van de hersenen van elke muis varieert, kan de locatie van specifieke hersengebieden worden bepaald met behulp van stereotactische coördinatienates ingesteld van oriëntatiepunten op de schedel van de hersenen van muizen. De meest gebruikte monumenten zijn bregma, lambda, en de interaurale lijn. Met coördinaten verkregen uit een hersenatlas kan ⁴ de exacte locatie van elk hersengebied worden geïdentificeerd door de antero-posterior (A / P), mediaal-lateraal (M / L) en dorsale-ventrale (D / V) as van bregma / interaurale lijn kruising. Typisch Virussen geïnjecteerd in de hersenen van muizen gelabeld met ofwel rood of groen fluorescent eiwit (RFP en GFP), waardoor injecties kan worden bevestigd door fluorescentie microscopie.

Behavioral evaluaties van muizen zijn vooral nodig voor fundamenteel onderzoek van psychiatrische stoornissen. Symptomen van psychiatrische stoornissen bij patiënten betrekken meestal abnormaal gedrag. Sommige van deze menselijke gedragingen evolutionair geconserveerd en kan direct worden nagebootst en waargenomen in de muis. Bijvoorbeeld kan depressie worden gemodelleerd in de muis door meting behavioral wanhoop. Mensen met een depressie often het gevoel alsof ze niets doen zal ooit helpen, een symptoom dat uiteindelijk kan leiden tot zelfmoord. Bij knaagdieren, kan deze worden gemodelleerd met behulp van de temperatuur zwemtest (FST), die de hoeveelheid tijd die een muis zwemmen versus drijvend in een plas water (gezien vanaf opgeven) meet. Dit paradigma is gevalideerd door het redden van het fenotype met anti-depressiva. ^7,8,9 Muizen die anti-depressiva hebben ontvangen zal aanzienlijk minder tijd immobiel te besteden in vergelijking met onbehandelde controles. Een andere gedragstest, het Open Gebied Test (OFT) is ontworpen om voortbeweging beoordelen muizen, en bovendien kan worden gebruikt om de angstige fenotype bij muizen geanalyseerd. ^5,6 Deze test is gebaseerd op de vooronderstelling dat muizen zich veiliger ze dichtbij aan de wand in een nieuw open veld. Wild-type muizen zal uiteindelijk verkennen van de nieuwe omgeving, zoals ze zijn nieuwsgierige dieren. Echter, minder tijd in het midden van het veld geeft angst bij de muis, omdat de muis niet in staat om de initia overwinnenl angst veroorzaakt door een nieuwe omgeving. De angst van de muis, zoals gekwantificeerd door de hoeveelheid tijd doorgebracht in het centrum van een open veld, vergelijkbaar met de klinische angst bij mensen, die in vele psychiatrische stoornissen.

De combinatie van stereotactische injecties van gedragsparadigma's is een nieuwe manier om doelgericht hersengebied de expressie van een specifiek gen te wijzigen. Het effect van gemoduleerde genexpressie op muis gedrag kan dan worden bepaald. In tegenstelling tot volledige hersenen knockout Deze werkwijze is bijzonder nuttig omdat het alleen gericht specifieke hersengebieden. Daarnaast worden stereotactische injecties typisch uitgevoerd in de volwassen wildtype muis derhalve endogene genexpressie wordt gehandhaafd gedurende ontwikkelingsstadia. Deze methode zal het verwarren effect te vermijden als het gen vereist is voor overleving tijdens de embryonale en postnatale ontwikkelingsstadium. Een belangrijke beperking is dat de experimentele muizen moeten throug gaanh een invasieve chirurgie, waarbij de schedels van muizen te openen. Bovendien wordt de mate van modulatie gen bepaald door de titer en de efficiëntie van het virus. Het virus moet worden geïnjecteerd in de juiste regio middels stereotactische coördinaten, waarbij speciale instrumenten vereist. Controle van de juiste injectieplaats kan alleen worden voltooid post mortem.

Deze werkwijze is eerder gebruikt om de betrokkenheid van een specifiek gen in verschillende neurologische aandoeningen testen. Virale gemedieerde RNAi gericht op het Th-gen (waardoor dopamine te synthetiseren) werd geïnjecteerd in de substantia nigra compacta en locomotorische gedragsanalyse uitgevoerd. ¹⁰ Een andere studie gebruikte stereotactische injectie van een lentivirus silencing DISC1 te muisgedrag dan worden geëvalueerd schizofrenie. Knockdown van DISC1 geleid tot meer beweging in reactie op de nieuwigheid (parallellen positieve symptomen bij schizofrenie), en een grotere onbeweeglijkheid in deFST. ¹¹ Evenzo is de aanvullende studie bleek dat _5-HT1B overexpressie geleid tot meer verkenningsgedrag in het OFT, in overeenstemming met een anti-angst fenotype met deze methode. ¹² Stereotactische injecties cre virus leveren recombinatie induceren in cre-loxP muizen . Deze methode werd gebruikt om de Y2 receptor in de amygdala en de bed kern van de stria terminalis één verwijderen. Bij gedragsanalyse, werden deze muizen blijkt een antidepressieve fenotype wanneer het gen in de centrale amygdala is verwijderd, maar geen fenotype wanneer het gen in de basolaterale amygdala of bed kern van de stria terminalis is verwijderd. ¹³ Aldus is deze techniek verschaft een uniek instrument om de genetische invloed op dierlijke gedrag bestuderen.

Protocol

LET OP: Alle protocollen met dieren werden gevolgd in overeenstemming met het dier zorg richtlijnen van de Pennsylvania State University, IACUC # 44057

1. Lentivirus Production

NB: De dag voor transfectie, moet LentiX-293-cellen worden op 80% confluentie.

1. Spoel de cellen met DMEM net vóór transfectie en incuberen in 10 ml DMEM / 10% FBS met penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Verdun DNA en Polyethyleenimine (PEI) (1 mg / ml) in 1: 3 verhouding (1 ug DNA: 3 pl PEI) in 1 ml DMEM en vortex gedurende 1 minuut. De hoeveelheid DNA toegevoegd is afhankelijk van de concentratie van het DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
   1. Gebruik bijvoorbeeld 20 ug plasmide DNA, bestaande uit 10 ug plasmide, 5 ug psPax2 ¹⁴ plasmide, 5 ug van vesiculair stomatitis virus (VSV) met 60 ul van PEI per schaal.
3. Voeg 1 / 10de volume van de totale kweekmedium DMEM (dwz 1 ml voor 10 ml kweekmedium in een 100 mm schaal). Voeg 1 ml van de DNA-PEI mengsel druppelsgewijs in de schaal en draai de schotel rond tot aan het kweekmedium wordt goed gemengd met de DNA.
4. Incubeer gedurende 6 uur bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Voeg 5 ml kweekmedium.
5. 48 uur na transfectie, verzamel viraal supernatant en centrifugeren bij 627 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een 50 ml buis. Filter 30 ml van virale supernatant door een 0,45 pm spuitfilter in een ultracentrifuge buis.
6. Voeg steriel water om de buizen in evenwicht, en bedek buizen met kleine stukje parafilm. Spin buizen bij 11.249 xg gedurende 120 min bij 4 ° C. Verwijder vloeistof met een stofzuiger tip.
7. Voeg 100 ul koud PBS de buis. Schud de buis bij 4 ° CO / N.
8. Om opnieuw op te schorten het virus, pipet tHij PBS toegevoegd in stap 1.8 op de korrel 10 keer, zorg dat u de pellet niet aan te raken met de tip. De pellet zal niet opnieuw worden opgeschort totdat deze is voltooid.
9. Aliquot het virus in 10-20 pi per buis, flash-bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

2. stereotactische injectie

2.1) Voorbereiding van de instrumenten

1. Plaats een schaar, tang stompe uiteinden, een naaldhouder, scalpel, wattenstaafjes en een doek in een gesloten verpakking met een sterilisatie-indicator, en autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Daarnaast krijgen 10% povidonjood, 70% ethylalcohol, absorbeerbare hechtingen, een verwarmingselement, kunsttranen, een glazen kraal sterilisator, boormachine, een boor, 2 wegwerpspuiten, een injectiespuit, elektrisch scheerapparaat, pijnstiller (ketoprofen), verdoving (Avertin), handschoenen en een stereotactische apparaat met injectie pomp.
2. Maak 1,25% avertin oplossing verse die dag, filter in een steriele kap met behulp van een 0,2 &# 181; m steriele spuit filter, en plaats in een steriele serum flacon. Meng 2,5 g 2,2,2-tribroomethyl alcohol in 5 ml tert-amylalcohol, dan oplossen in 200 ml water. Houd de pH onder 5. ¹⁵

2.2) Bereiding van de muis

1. Dien Avertin gebaseerd op het gewicht van de muis (375 mg / kg). ¹⁵ Injecteer de muis met de avertin via een intraperitoneale (IP) injectie en vervolgens weer plaatsen zijn kooi tot volledig onder narcose.
2. Geef een pijnstiller via IP-injectie (ketaprofen, 5 mg / kg), en plaats kunsttranen op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.
3. Zorg ervoor dat de muis is volledig in slaap door knijpen hun voet. Als de muis reageert op de voet knijpen, geef meer verdovingsmiddel (in doseringen van 50 pi). Scheer het hoofd van de muis met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Scheer de omgeving (gewoonlijk onmiddellijk achter de oren, de bovenkant van de snuit) te opereren, en het omliggende gebied.
4. Plaats de muis into de stereotactische apparaat. Grendel de voortanden op de voorste klem, en laat de klem en draai het zodat de kaak is volledig veilig.
5. Steek het oor bars in de gehoorgang volledig stabiliseren het hoofd. Wees voorzichtig niet aan het oor bars steek te ver, dat het binnenoor kunnen beschadigen. Zodra dit voltooid is, zal het lichaam van de muis kunnen enigszins worden bewogen zonder verstoring van de positie van de weg.
6. Plaats een verwarmingselement onder de muis om de lichaamstemperatuur van de muis reguleren gedurende de procedure.
7. Reinig de chirurgische gebied grondig. Met behulp van een wattenstaafje, wrijf 10% povidonjodium in een cirkelvormige beweging, vanaf het midden van de chirurgische site en naar buiten toe. Gebruik vervolgens een wattenstaafje 70% ethylalcohol wrijven op de operatieplaats op dezelfde manier. Herhaal tweemaal.

2.3) De eerste incisie

1. Zodra de muis wordt klaargestoomd, open de steriele apparatuur zak. Change handschoenen voordat Touching van de instrumenten. Neem de steriele doek en plaats de instrumenten op het doek. Als een instrument raakt een niet-steriele oppervlak, gebruik dan de glazen kraal sterilisator gedurende 15 sec om het te steriliseren.
2. Neem de scalpel in de dominante hand en blunt-end tang in de niet-dominante hand. Gebruik het stompe einde forceps voorzichtig grijpen de huid van de muis en een insnijding met de scalpel. Begin de incisie ongeveer 1,5 cm boven de oren (naar de neus) en zich uitstrekken tot ongeveer 0,5 cm onder de oren. Verleng de incisie verticaal door het midden van het hoofd van de muis aan bregma blootgesteld (Figuur 1).
3. Zodra bregma wordt gevisualiseerd, neem een ​​steriele katoenen tip om voorzichtig te verwijderen geen bloed die het oppervlak van de schedel. Gebruik twee katoen tips om de huid te duwen in de richting van de zijkant van het hoofd.

2.4) Apparatuur Setup

1. Nadat geen bloed wordt verwijderd van het oppervlak van de schedel en bregma duidelijk zichtbaar, bereid de spuit (concentratie van 10 ⁸ TU / ml, volume van 1 ui). In de zuurkast, vul de spuit met het virus te injecteren. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn binnen. Plaats de spuit in de stereotactische apparaat, om ervoor te zorgen dat het volledig is beveiligd.
2. Langzaam de spuit totdat deze vlak boven het oppervlak van de schedel, waardoor het uiteinde van de steriele naald wordt ingesteld op het snijpunt van bregma en de interaurale lijn. Stel dit punt als nul, en het bepalen van de coördinaten van dit punt.
3. Afhankelijk van de hersenen interessegebied, variëren de stereotactische coördinaten. Bepaal de coördinaten met behulp van een hersenatlas ^4. Zodra de coördinaten zijn bepaald, verplaats de naald van de spuit om die coördinaten te passen. Richt de dentate gyrus met de coördinaten: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Laat de naald recht boven de schedel te visualiseren waar het gat moet worden geboord.
4. Verhoog de spuit iets, neem de boor en plaats de boor bit direct boven de doelstelling boorlocatie op ongeveer een 45 ° hoek met de schedel. Begin boren, en houdt het boren tot aan de schedel geeft manier. Wanneer de schedel geeft wijze kan een daling in weerstand gedetecteerd. Wees voorzichtig niet te boren in de hersenen, om zo corticale schade te voorkomen.
5. Neem een ​​steriele katoenen tip en veeg geen bloed uit de buurt van het gat.
6. Laat de spuit, zodat de tip zit direct op het oppervlak van de hersenen (niet de schedel). Zet de D / V coordinaat (diepte) op 0. Laat de injectiespuit naar de gewenste diepte, gebaseerd op de hersenatlas coördinaten. Om de dentate gyrus, stelt D / V bereiken -1,79 mm.
7. Begin het injecteren met een snelheid van 0,2 ul / min. Let zodat de injectiespuit niet lager glijden dan de gewenste diepte. In dat geval voorzichtig omhoog de spuit aan de gewenste diepte weer.
8. Nadat de injectie is voltooid, wacht ongeveer 2 minuten zodat achtergebleven virus is geabsorbeerd. Langzaam verhogen de spuit en gebruik een wattenstaafje om eventuele li verwijderenquid uit de injectieplaats.
9. Herhaal dit voor het andere halfrond.

2.5) Hechten

1. Verwijder de steriele hechtdraad en naald uit de verpakking en greep de naald met behulp van de naald houders. Geconfronteerd met de puntige kant van de naald weg van de naald houder. Houd het stompe uiteinde pincet in de niet-dominante hand en gebruiken grip de huid van de muis. Begin met de dominante hand.
2. Duw de hechtdraad door de huid en met de stompe uiteinden tang om de huid aan de overkant van de incisie te grijpen. Trek het hechtmateriaal door tot ongeveer 0,75 inch blijft.
3. Loslaten van de naald, en gebruik de stompe-end tang om de hechting rond de naald houder één keer wrap, dan, pak de 0,75 inch resterende hechtdraad met de naald houder, en trek de hechtdraad door middel, zodat de naald en naaldhouder komen op de zijkant van de kop tegenover die waaraan zij oorspronkelijk waren. Dit moet een knoop te vormen.
4. Herhaal deze stapdrie keer, afwisselend de zijkant van de kop de naaldhouder belandt telkens wanneer.
5. Snijd de hechtdraad en herhaal stappen 2.5.1-2.5.3 totdat de incisie wordt gesloten.

2.6) postoperatieve zorg

1. Verwijder voorzichtig het oor bars van de muis en verwijder haar kaak uit de voorste klem.
2. Houd de muis op de verwarming pad totdat hij wakker en beweegt rond op zijn eigen. Bewaken van de muis dagelijks, en houd en oog uit voor tekenen van pijn, zoals het niet verzorging, eten of drinken. Geef extra pijnstillende wanneer dat nodig wordt geacht.

3. Open Field Test

3.1) instellen

1. Verkrijgen van een leeg plein, plastic arena met afmetingen van 50 cm x 50 cm, met 50 cm hoge muren (maar kan iets groter zijn). Reinig de arena met 70% ethylalcohol vóór het begin van het experiment. Zorg ervoor dat de ethylalcohol volledig droog is voordat u een muis in de arena.
2. Plaats de arena op devloer, en proberen te zorgen voor de verlichting is ingesteld op schaduwen en verblinding te minimaliseren.
3. Bij gebruik van tracking software, plaatst u de camera rechtstreeks overhead van het open veld, ongeveer 1,5 ft boven het open veld (ver genoeg om de volledige Encompass de hele arena, maar dicht genoeg om een ​​duidelijk beeld van de muis hebt).
4. Het opzetten van een zone in het centrum van de doos (ongeveer een oppervlakte van 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Om een zone instellen, klikt u op het tabblad zone 1 in het zijpaneel.
   1. Selecteer een vorm schets in het bovenste paneel, en een overzicht van de perimeter van het centrum zone. Selecteer voegen zone, en klik op de binnenkant van het centrum zone. Met behulp van het programma prompts, de naam van de zone (dit zal worden aangeduid als 'centrum' voor deze procedure). Als de gedrags-test zal worden gescoord door de hand, zorg ervoor dat de onderkant van het veld is verdeeld in 10 cm x 10 cm pleinen, gemarkeerd met tape.
5. Stel de software, zodat de instellingen correct zijn, en de muis is gemakkelijk visible op het scherm. Dit te bereiken door aanpassing van de detectie-instellingen op de machine overeenkomen met het testen arena (licht) en muis kleur te vertonen.
   OPMERKING: Als de instellingen juist zijn, moet het systeem volgen alleen de muis, en geen schaduwen of urine / ontlasting. De specifieke software instellingen zijn afhankelijk van de verlichting van de arena en de kleur van de muis.

3.2) Acclimatisering en Test

1. Verplaats experimentele muizen in de gedrags kamer 1 uur vóór de test om ze wennen aan hun omgeving. Laat de muizen in hun kooi voor de acclimatisatie.
2. Zet de camera naar tape de gedrags-taak en plaats de muis naar het midden voorkant van de arena, zodat de muis wordt geconfronteerd met de muur.
3. Stel de timer voor 5 min, en stap uit de buurt van de arena. Als het mogelijk is, verlaat de kamer om zo de muis niet per ongeluk beïnvloeden.
4. Zodra 5 min zijn up, verwijder de muis en plaats ze in hun kooi.
5. Gebruik 70% ethylalcohol om grondig reinigen van het veld alvorens tot de volgende muis. Zorg ervoor dat de ethylalcohol is volledig gedroogd.

3.3) Scoren

1. Beschouw de muis als in het midden van het veld wanneer alle vier poten in het midden 30 cm x 30 cm.
2. Kwantificeren tijd doorbrengt de muis in het centrum. Ook bepalen deze keer met behulp van tracking software (zoals Noldus ethovison).
   1. Om dit te doen, ga naar het tabblad analyse, en klik op "beweging" onder analyse profielen. Verwijder de categorieën momenteel ingesteld, en selecteer vervolgens "in de zone" onder het tabblad locatie. Selecteer het centrum zone. Selecteer vervolgens "analyse output" (onder het tabblad resultaten) om de resultaten te bekijken. Een tabel met de tijd onbeweeglijk voor elke proef moeten verschijnen.
3. Anders, de score van de OFT met de hand. Het open gebied te 25 10 cm x 10 cm vierkantjes beschreven op de bodem van de ope hebbenn veld (zoals aangegeven in stap 3.1.3). Kwantificeren tijd doorbrengt de muis in het centrum, naast het aantal binnenkomsten in het midden van de arena. ¹⁶
   Opmerking: Het centrum 30 cm x 30 cm gebied wordt beschouwd als het centrum van het open veld. Een muis wordt geacht bewoont het middengebied als alle vier poten in de 30 x 30 cm area.

4. Gedwongen Swim Test

OPMERKING: Laat een minimum van vijf dagen tussen behavioral taken.

4.1) instellen

1. Zorg voor een 2 L duidelijk emmer, en vul met 22 ° C water. Zet de emmer op een tafel, en proberen te zorgen voor de verlichting is ingesteld op schaduwen en verblinding te minimaliseren.
2. Bij gebruik van tracking software, plaatst u de camera rechtstreeks overhead van de emmer.
3. Zet software zodanig dat de muis gemakkelijk zichtbaar op het scherm.

4.2) Acclimatisering en Test

1. Verplaats experimentele muizen in de behavioral roOM 1 uur vóór de test om de omgeving acclimatiseren. Laat de muizen in hun kooi voor de acclimatisatie.
2. Zet de camera naar tape de gedrags-taak. Zachtjes, plaatst u de muis in het midden van de emmer water. Zorg ervoor dat de muis niet te laten vallen. Langzaam de muis, zodat de voorste voeten eerst raak het water. Neem zorg aan hun hoofd verhinderen dompelen.
3. Stel de timer gedurende 6 min en stap vanaf de gedrags gebied.
4. Zodra 6 min zijn up, verwijder de muis uit de emmer, en veeg het overtollige water voordat u de muis terug in hun kooi.

4.3) Scoren

1. Bij gebruik van tracking software, ingesteld procent immobiliteit tot 11%, zoals voorgesteld door Noldus (dit moet de standaardinstelling zijn), om tijd te kwantificeren drijvende vs. zwemmen.
2. Te kwantificeren met behulp van het tracking systeem, ga naar het tabblad analyse en klik op verkeer op grond van de analyse profielen. Verwijder de categorieën momenteel stellen en selecteer vervolgens mobiliteit staat, opde linker zijpaneel (onder het individuele gedrag). Stel immobiliteit tot 11%.
3. Selecteer spoor visualisatie, onder het tabblad resultaten. Selecteer analyse uitgang (onder het tabblad resultaten) om de resultaten te bekijken. Een tabel met de tijd onbeweeglijk voor elke proef moeten verschijnen.
4. Als de hand scoren, het meten van de tijd dat de muis besteedt zwemmen of klimmen, en de hoeveelheid tijd die de muis besteedt immobiel. Bovendien meet de latentie om de eerste keer onbeweeglijk. Zie figuur 2 in Results Section.

Representative Results

Accurate stereotactische injectie leunt zwaar op het instellen van de juiste coördinaten. De punt van de naald gebruikt om het virus te injecteren moeten rechtstreeks worden ingesteld op de kruising van bregma en de interaurale lijn (figuur 1). Het is nuttig om een ​​stereomicroscoop gebruiken om na te gaan of de naald correct is geplaatst. Bij het zoeken door de microscoop moet de naald worden geplaatst dat wanneer het virus werden geïnjecteerd, zou direct landen op de kruising van bregma en de interaurale lijn. Dat wil zeggen, de opening in de naald zou direct boven de kruising geplaatst. In deze studie werd een lentivirus expressie shRNA tegen RBM8a, een kern factor in het exon junction complex, werd geïnjecteerd in de dentate gyrus. De lentivirus drukt ook RFP geïnfecteerde neuronen label. Figuur 2 toont dat het virus werd geïnjecteerd in de juiste regio zoals aangegeven door het rode signaal (Figuur 3).

_content "> Om betekenis in behavioral taken te realiseren, moet de steekproefomvang variëren 12-15 muizen per groep. Behavioral taken kunnen worden uitgevoerd twee weken na stereotactische injecties. In het OFT, heden een angstige fenotype is als muizen besteden aanzienlijk minder tijd in het centrum van het open veld vergeleken met de controlegroep. De resultaten geven aan dat knockdown van RBM8a in de dentate gyrus van volwassen muizen leidt angstig gedrag (p <0,05, figuur 4). In de FST, was er geen waarneembaar verschil in onbeweeglijkheid tussen controle en experimentele muizen, wat suggereert dat RBM8a knockdown in de dentate gyrus geen invloed anti-depressief gedrag (Figuur 5). Statistische analyse bestond uit het uitvoeren van een tweezijdige, twee bemonster- ongelijke variantie t test.

Figuur 1: Kruising van Bregma en de Interauditieve Line. Voor stereotactische injecties, de naald moet worden bekleed met de kruising van bregma en de interaurale lijn. Dit punt wordt ingesteld op nul.

Figuur 2: Schematische illustratie van de tijdlijn voor het hele experiment.

Figuur 3: Representatieve stukje hersenen illustreert succesvolle injectie van virus in de dentate gyrus De schaal bar = 100 micrometer..

Figuur 4: De hoeveelheid tijd dat de controle en experimentele Muizen doorgebracht in het centrum van een Novel Open Gebied Experimentele muizen besteden signif.icantly minder tijd in het midden van de arena, wijst een angstige fenotype (N = 9-11, * t ₁₈ = -2,72, p <0,05, gemiddelde ± SEM)

Figuur 5:. De hoeveelheid tijd die controle en experimentele Muizen zijn Immobile in de FST experimentele muizen niet verschillen van controles in de tijd doorgebracht onbeweeglijk (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, gemiddelde SEM)

Discussion

Succesvolle stereotactische injecties afhankelijk van drie factoren: het houden van de muis in leven, het instellen van het juiste nulpunt voor coördinaten (tip van de naald op de kruising van bregma en de interaurale lijn), en het instellen van de juiste diepte aan het nulpunt (tip van de naald alleen aanraken van de buitenzijde van het hersenweefsel). De levensvatbaarheid van de muizen belang. Chirurgie overleving kan worden geholpen door ervoor te zorgen dat de muis goed is verdoofd en krijgt voldoende pijnstillende. Pijn is bekend een belangrijke oorzaak van slecht herstel na de operatie. Ervoor zorgen dat de muis volledig verdoofd gedurende de operatie (mag niet reageren op voet knijpt), en met de juiste dosis pijnstillende (gebaseerd op het gewicht van de muizen), dient te overleven. ¹⁷ Bovendien moet de muis worden bleef een verwarmingselement gedurende de operatie processen zolang ontwaakt uit de narcose. Muizen kunnen niet regelen hun lichaamstemperatuur als ze verdoofd. Hun lichaam temperamenttuur zal aanzienlijk dalen tijdens de operatie proces. Hoewel de lengte van stereotactische chirurgie is relatief kort, kan hypothermie ernstig aantasten muis overleven. Een goede hechting techniek is ook een hulpmiddel bij het uitvoeren van een succesvolle operatie. Muizen zal proberen te halen bij hun hechtingen, dus het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de hechtingen zijn strak genoeg om de verwijdering te voorkomen, maar niet te strak als te veel spanning zetten op de wond. Vier knopen in elke steek moet ervoor zorgen dat de muis niet in staat is om de hechting te verwijderen. Een goede hechting is belangrijk als een open wond de vatbaarheid voor infecties, die een negatieve invloed zou hebben op elke gedrags experimenten zal toenemen.

De OFT is een gedrags-paradigma ontworpen om de motoriek en de angstige fenotype in muizen te beoordelen. Bij het testen van de muis gedrag, is het belangrijk om zeer voorzichtig te zijn bij de behandeling van de muizen en het opzetten van de arena. In het OFT, is het paradigma ontworpen om aanhouding van de muis whe koppelenn geplaatst in een nieuwe omgeving, met zijn natuurlijke nieuwsgierigheid en verlangen om nieuwigheid te verkennen. Een wildtype muis aanvankelijk aarzelen om het centrum van het open veld, waar het kwetsbaarder voeren, maar uiteindelijk zal doen, vanwege de aangeboren nieuwsgierigheid. In een angstige muis, wordt de vrees van overschrijding van een kwetsbare plaats (het midden van het veld) groter is dan de natuurlijke nieuwsgierigheid en verlangen te onderzoeken, wat zal resulteren in aanzienlijk minder tijd doorgebracht op het centrum zijn. Om ervoor te zorgen dat het paradigma correct werkt, is het belangrijk om stress in verband met de andere dan het open veld factoren te minimaliseren. Stress kan worden geminimaliseerd doordat de muis te acclimatiseren aan de gedrags kamer (dus de buitenomgeving is niet mogelijk het verwarren variabel), en schoonmaken van het veld tussen muizen, te garanderen dat alle geuren verbonden met de vorige muis verwijderd. ¹⁸ Deze stappen moeten helpen eventuele verschillen die worden veroorzaakt door onjuist elimineren handling muizen. In deze studie RBM8a knockdown muizen brachten significant minder tijd in het midden van een nieuw open veld, vergeleken met controles. Dit wijst op een angstige fenotype, aangezien de muizen minder geneigd zijn naar het midden van het open veld boek, waar zij kwetsbaarder, in vergelijking met controles voeren.

FST beoogt de anti-depressieve fenotype bij muizen onderzocht. Wanneer geplaatst in een emmer water, zijn muizen die aanzienlijk minder tijd te besteden drijvende versus zwemmen beschouwd als een anti-depressieve fenotype hebben. Immobiliteit in de gedwongen zwemmen test wordt geïnterpreteerd als gedrags wanhoop (bijv geven). Dit paradigma wordt bevestigd met antidepressieve behandeling. ^7,8,9 Muizen die ontvangen antidepressiva zal aanzienlijk minder tijd zwevende vergelijking met controles, hetgeen wijst op een anti-depressieve fenotype. In deze studie, deed RBM8a knockdown muizen niet significant af van controle muizen in de tijd doorgebracht immobiel. This geeft aan dat RBM8a knock-down in de dentate gyrus van volwassen muizen niet ontlokken een depressieve of anti-depressieve fenotype. In onze vorige studie, RBM8a overexpressie in de dentate gyrus van volwassen muizen aanzienlijk vermindert de tijd onbeweeglijk in vergelijking met controles, die een anti-depressieve effect geeft. ¹⁶

De stereotactische injecties gebruikt voor vertegenwoordiging in deze paper werden gericht op de dentate gyrus. De dentate gyrus werd gekozen als de doelwitplaats, aangezien het gen van interesse sterk daar in de volwassen muis tot expressie wordt gebracht. Bovendien heeft de dentate gyrus geassocieerd met depressie en angst. Bijvoorbeeld, een studie gebruikte POMC-ChR2 muizen om de granule cellen in zowel de dorsale en ventrale dentate gyrus selectief activeren. Activering van de zowel de dorsale en ventrale dentate gyrus geleid tot een grotere exploratie van een nieuwe omgeving, wat wijst op een mogelijke rol van de dentate gyrus in angst. ¹⁹ Een andere studiedat muizen met verminderde neurogenese waren immobiliteit in de FST toegenomen, hetgeen een depressieve fenotype. ²⁰ Bovendien activering van Ap oa ₁ in de voorhersenen leidt tot een anti-depressief effect bij de FST, nieuwigheid onderdrukt voeden en sucrose wordt aangevangen. Wanneer VEGF werd aangereden in de dentate gyrus van Ap oa ₁ werd deze anti-depressieve fenotype verloren. ²¹ Deze gegevens suggereren dat de dentate gyrus een rol speelt in de pathofysiologie van angst en depressie, en gaf aan dat de dentate gyrus kan een goede omgeving te richten voor onze genetische modulatie en gedragsexperimenten. Een lentivirus werd specifiek worden gebruikt, zodat alle cellen in de dentate gyrus zouden geïnfecteerd, tegenover slechts delende cellen (retrovirus).

Een combinatie van deze drie experimentele design (naast andere gedragstaken) is een nieuwe manier om gedrags fenotypen in muizen te evalueren, aangezien een virus kan worden geïnjecteerd in een specific hersengebied op specifieke ontwikkelingsstoornissen tijden. Met behulp van stereotactische injecties van een lentivirus gepaard met gedragsproblemen taken duurt slechts een paar maanden in beslag en maakt het mogelijk onderzoekers om voorlopige gegevens te verzamelen over de gedragseffecten van genexpressie in een bepaald gebied de hersenen. Daarentegen conditionele knockout muizen vaak jaren genereren. Bovendien kan celtype voorkeur van virussen worden gebruikt om cellen verder te richten. Zo kunnen retrovirussen enkel infecteren delende cellen (zoals neurale stamcellen in de dentate gyrus) terwijl een lentivirus infecteert alle celtypen. ^22,23 dus samen met co-injectie van deze verspreide en individueel gevalideerde testprotocollen te snel maar volledige manier om de rol van specifieke genen testen doelgericht hersengebied, op muis gedrag.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder