Abstract
分化的小鼠胚胎干细胞的能力（ESC）的神经祖细胞允许控制神经规范以及产生成熟的神经细胞类型的进一步研究的机制的研究。在这个协议中，我们描述了ESC的使用无血清，单层培养神经祖细胞分化的方法。该方法具有可扩展性，高效率和结果在4内生产70％的神经祖细胞〜 - 6天。它可以从在各种条件下生长的各种菌株施加到ESC。神经祖细胞可以允许进一步分化为功能性神经元和神经胶质细胞或分析用显微镜，流式细胞仪或分子技术。分化过程是适合于延时显微镜，并且可以与使用记者行监测神经规范过程进行组合。我们提供培养基制备和细胞密度优化的详细说明，使该过程为bë施加到最ESC线和各种细胞培养容器。
Introduction
胚胎干细胞是从早期胚胎与体外无限增殖的能力，同时保留分化成以下再引入适当阶段胚胎所有成年细胞类型（通过形成嵌合体的能力），注射到同基因或免疫妥协的宿主衍生的多能细胞（通过形成畸胎瘤）或体外受到适当的线索1。 在体外分化的小鼠胚胎干细胞分化为神经谱系的于1995年首次被描述和所涉及的形成多细胞悬浮聚集体（胚体，胚）在补充有形态发生维甲酸2-4含血清介质。自那时以来，各种协议已被开发以允许神经分化5。许多人仍利用聚合，更为共培养与诱导细胞类型和几个涉及使用无血清介质。所有的协议有优势第二缺点和神经的确切性质或神经细胞产生的也有所不同，根据使用的协议。
理想的协议将是健壮的，可扩展和使用完全确定的培养基和基板，是适合于非侵入性监控分化过程的，并导致在神经祖细胞的纯群体的产生能够由外部线索和分化来图案成所有的神经元和神经胶质亚型具有高效率和产率在相当短的时间。在过去的十几年，我们一直在使用，用于从小鼠ESC神经祖细胞和神经元密度低，无血清贴壁单层培养6-10的方法。这个协议来完成许多上文所列的标准：在我们手中分化的效率已经相当一致多年来和各种细胞系，它可被放大或缩小（我们成功地使用从96孔板的船只直径15厘米迪畲族）和所使用的介质是良好定义的。这个过程是适合于缩时显微术为分化的监测和各种图案形成线索可加入以诱导不同类型的神经元亚型的的产生（ 例如，Shh和FGF8为多巴胺能神经元6）。
尽管如此，还是有一些挑战这一协议的成功应用。其中一个重要方面是精心准备的媒体。我们始终准备介质内部尽管商业替代品的可用性。其中所使用的添加剂的（N2;见协议 ）有修改过的标准的商用版本。最后，这种方法的成功应用的最重要的步骤之一是在电镀的最优的细胞密度。这主要是因为，而诱导信号中的一个（FGF4 11）的自分泌性质要 求足够细胞存在，以允许最佳viabil性和分化，在太高的密度分化受损（可能部分是由于自分泌生产LIF 12）。因此重要的是，这两个介质制备和细胞电镀仔细进行和一致，以确保最佳的效果。
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Protocol
1.媒体准备
注：协议依赖于使用两个单独的媒体混合的：DMEM / F12补充有改性N2添加剂和的Neurobasal补充有B27添加剂，典型地以1：1的比例。
- 通过混合各组分在一个15毫升管制备改性N2添加剂。不要涡旋或过滤这一点;通过倒转该管，直到溶液澄清混合。
- 开始吹打7.2毫升的DMEM / F12的，然后加入1毫升25毫克/毫升胰岛素（由在0.01M的HCl中），通过颠倒试管混匀。这需要几分钟的时间，直到解决方案是明确的。
- 加入1毫升100毫克/毫升脱辅基转铁蛋白（由水），33微升0.6毫克/毫升progesternone（由乙醇中），100微升160毫克/毫升（1μM）腐胺（由在水），10微升3毫亚硒酸钠（由在水中）和666微升7.5％的牛血清白蛋白和混合管井。分装成2.5毫升并储存在-20°下长达2个月。
- 准备媒体。
- 向250ml DMEM / F12的加入2.5毫升氮气。拌匀但不要摇晃或过滤器。
- 250ml的神经基础介质添加5毫升B27的补充。拌匀但不要摇晃或过滤器。
- 混合来自步骤1.2.1和1.2.2媒体以1：1的比例。在某些情况下，以1：3的混合，可能需要（补充作为1：1混合在步骤1.2.4）。
- 到混合添加0.5毫升L-谷氨酰胺（最终浓度为0.2mM）和3.5微升2-巯基乙醇（终浓度为0.1mM）拌匀不摇动。存储介质在4°C至3周，避免暴露于光。这最后的混音被称为N2B27。
- 制备明胶溶液。
- 准备在超纯水中和高压釜1％明胶溶液在121℃，15磅，15分钟。重要的是，用于该瓶是从洗涤剂或消毒剂完全干净，因此，建议一个新瓶是用于此，并且永远只漂洗在超纯水中使用之间。分装1％溶液到50ml等份，并保持在4℃下几个月。
- 暖1％明胶的等分试样在37℃水浴中直至溶解，并添加至500ml温热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的。拌匀，吸管，足以覆盖每个孔的底部或板。允许明胶涂布的表面为至少30分钟。
2.电镀的细胞
注意：此协议同样适用于在10％血清与白血病抑制因子（LIF），血清替代品与LIF或无血清培养基用LIF和骨形态发生蛋白4（BMP4），或MEK和GSK3抑制剂（2I媒体）生长小鼠ESC有或不含LIF。然而，分化的时间和效率可以依赖于介质和细胞（见讨论）而有所不同。对于这里显示的实验中，我们使用的鼠标46C线ESC（即有绿色荧光蛋白记者撞到Ø内源性SOX1等位基因ね），生长在GMEM含10％血清和LIF。为了达到最佳效果，重要的是细胞解离和再接种在N2B27媒体;简单地从GMEM /血清/ LIF改变媒体N2B27总是导致降低效率的差异比较replating细胞。
- 生长中的细胞GMEM含10％血清，1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸，0.1M 2-巯基乙醇，和100单位/ ml LIF 13。为了获取鼠标ESC，板的汇合培养1×10 6个细胞变成T25培养瓶中，这将需要2 - 3天。
- 观察明场显微镜下的细胞。当细胞是亚汇合并准备通道，在PBS两次冲洗。加入1毫升细胞解离试剂，并返回到培养箱中2 - 5分钟。尽管胰蛋白酶和其它酶也可用于细胞分离，也可以有对细胞附着有负面影响这样的电镀密度将需要adjuSTED。
- 一旦细胞开始从板抬起，挖掘船撞出成单细胞悬液。收集细胞成总体积为10ml的介质和细胞解离试剂和吸管入15ml离心管中。
- 旋转细胞在300×g离心3分钟，在室温。
- 小心吸出上清液，并通过上下抽吸3悬浮在10ml预热N2B27的粒料 - 5倍。当上下吹吸的悬浮液，吸移管对管的侧面，以避免产生气泡。计数细胞用自动细胞计数器或血球并记录浓度。
- 准备将每孔预温N2B27镀含有量的细胞的期望数量的每单位的细胞悬浮液。每平方厘米10500细胞在6孔培养皿的密度（ 即，每6孔培养皿的孔1×10 5个细胞）是最佳的。 见表1每平方厘米2和PLA细胞的数量建议廷介质卷，适用于各种细胞培养容器。
- 吸从培养容器中的明胶和板按照表1所建议的密度和体积的细胞悬浮液。不要摇动板，因为这将集中在细胞的中心。放置在潮湿的培养箱中培养，在37℃，5％的CO 2。
- 用新鲜的N2B27全部更换介质2日 - 改变媒体每1。吸管轻轻用作冲洗细胞可能会影响密度，减少分化的效率在接下来的几天。其中，电镀后的初始生存能力较差，板上的细胞以1：3的混合N2和B27为辅媒体和初二后更改为N2B27。细胞将开始分化，并应表现出SOX1表达式中4（经记者在这里使用的46C细胞系绿色荧光显示） - 6天。
3.免疫荧光染色
NOTE：该协议可以被应用到任何容器类型。各试剂的体积每孔中描述的6-孔板中并可以扩展到任何表面区域。 Replating不建议由于低可行性之后。
- 除去分化培养基，并通过添加500微升4％（体积/体积）的多聚甲醛固定细胞，进行15分钟离开。
- 洗和透化的细胞用2ml PBS-T（磷酸盐缓冲盐水含有0.5％（体积/体积）吐温20）洗涤两次。细胞可以保持在PBS-T中长达2个月，在4℃。
- 更换PBS-T用1ml的PBS-T，用10％（体积/体积）的血清（来自相同物种作为第二抗体）。孵育1小时在板摇杆在RT以阻止任何非特异性结合。
- 1小时后，用2ml的PBS-T洗细胞两次，并孵育在打击βIII微管蛋白500微升小鼠IgG（稀释1：1000于PBS-T的10％血清）。把上盘摇杆，并留下O / N在4℃。
- 从这个步骤，始终保护血管从光。用PBS-T清洗细胞两次，然后加入500μl荧光标记的抗小鼠IgG抗体（稀释至2微克/毫升在PBS-T中，用10％血清）。把它放在板摇杆1小时，在室温。
- 用PBS-T冲洗细胞两次，然后加入500μl的DAPI（稀释至0.5微克/毫升在PBS-T）和离开5分钟。
- 再次洗涤细胞，并让他们在PBS-T。细胞准备要被拍摄，并且可以保持长达2周，在4℃。注意，GFP信号消失时间的推移所以是不适当的比较固定的和活细胞的细胞固定在不同的时间或GFP的强度。
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Representative Results
在这个实验中，我们使用的46C细胞系14，小鼠胚胎干细胞与内源SOX1-GFP报告，以跟踪神经分化。通过使用该细胞系SOX1，一个标记为神经祖的，表达，可以通过绿色荧光来检测。电镀密度是实现神经元分化的关键因素。小鼠胚胎干细胞以不同的密度从10500到88500个细胞/ cm 2的变化的铺于6孔板中。 图1A示出了由不同的电镀密度在一个6孔板来实现分化效率。对分化的第6天，将细胞固定在4％多聚甲醛和染色的神经元标记βIII微管蛋白。在最佳密度（10500细胞/ cm 2），细胞分化为神经祖细胞和神经元。这是观察到绿色荧光信号SOX1-GFP记者和免疫对神经元标记，βIII微管蛋白。一lOWER接种密度导致细胞死亡的3天之内。但是，在过高的密度电镀（> 36500个细胞/ cm 2）的结果是绿色单元和βIII微管蛋白阳性细胞的比例下降。 图1B示出了在一个96孔板这需要大约10倍更高的细胞密度而进行的实验达到最佳的（155000细胞/ cm 2）和太汇合（362500细胞/ cm 2）的水平。
最佳密度可以是媒体制剂，媒体组件和细胞批次，细胞类型，或前培养条件之间的不同。它建议以优化铺板密度为每个实验。 表1提供了在各种平台有效电镀密度应包含在优化步骤的范围。在此范围内，应该可以得到一个密度，使内4个好分化效率 - 6天。
在分化êSC逐渐改变其形态， 图2所示为10500个/厘米2的电镀6孔板后1天至6天的细胞和菌落形态。细胞在分化条件下培养，并拍下每一天。这是不寻常地看到的第几天显著的细胞死亡是由于培养条件极端变化。然而，剩余的细胞仍然能够分化。在第4天，细胞开始成为神经祖细胞从SOX1-GFP报道绿色荧光信号首先出现。然而，即使是在第6天，并非所有的细胞是SOX1阳性。一些非神经细胞的存在预期，然而，在适当的条件下，大部分细胞将神经。
图1.铺板密度对分化效率的影响。两种不同的SOX1-GFP报告细胞（46C）的密度，根据该协议6天铺板并分化。 （ 一 ）辨证的6孔板。 （B）的分化，在96孔板中。比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
在分化过程图2.细胞形态。46C ESC分化为每平方厘米10500细胞在6孔培养板中，每日拍照以观察细胞形态的变化。比例尺：300微米请点击此处查看该图的放大版本。
| 平台 | 有效密度范围（细胞/ cm 2）的 | 细胞数量范围内板 | 建议初始介质卷（微升） | 第1天（微升）后提示媒体卷 |
| 6孔板 | 10500 - 36500 | 99,750 - 346750 | 1000 | 2000 |
| 24孔板 | 15600 - 46800 | 29640 - 88920 | 500 | 1000 |
| 96孔板 | 103500 - 26万 | 33,120 - 83,200 | 100 | 200 |
表1.推荐电镀密度和介质卷不同容器尺寸。在此表中的电镀密度，使用46C细胞系来确定。为了获得最佳结果，其中每个单独的线的铺板密度可能不得不被形usted。
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Discussion
单层神经分化协议已经使用了十多年6。该协议是高效率的，由确定的培养基，并在单层系统，使该系统更适用于临床前完成（ 例如，药物筛选）使用。然而，也有确定分化效率一些关键的因素。本文指出的那些因素，并针对每个障碍物的溶液。
电镀在分化条件后密度的细胞可能是最关键的因素。在太高的密度铺板细胞减少分化的效率，同时在太低的密度电镀导致细胞死亡。这种现象可能是由于自分泌生长因子信号。 FGF4是激活MAPK级联并驱动ESC分化11的自分泌生长因子。 LIF是由ESC产生的细胞因子另一个。它激活STAT3途径，促进自我更新<SUP> 15。该协议利用N2B27，使神经细胞。 N2B27包含其允许ESC生存的各种因素，促进神经细胞的生长，并且不包含任何LIF或BMP4的抑制神经分化6。在适当的密度，FGF4和LIF信号的适当的平衡维持，使ESC分化。在高密度，自分泌LIF和BMP抑制分化的过剩量。与此相反，将细胞在过低的密度在这些相当基本培养基具有受损的存活。因此，当出现大量的细胞不分化的电镀数目应减少，而如果显著细胞死亡观察需要增加的电镀细胞数。
除了细胞数有间接影响电镀密度一些其它因素。第一个因素是局部细胞浓度，取决于所使用在表面上均匀地分布在细胞中的技术区域。我们发现，漩阱是不理想的，因为它集中的细胞至孔的中心，使密度在中心处过高，而在周缘密度变得太低。其他混合技术，例如，电镀，或摇动板一侧到另一侧的前混合与细胞的培养基被推荐。此外，当容器被放置在培养箱中，介质的不均匀加热导致绘制的细胞至孔的中心，从而导致细胞中的同心环图案分布的对流力。对电镀日较低的介质体积建议减少这种影响。离开培养箱外板30分钟，以让细胞附着，以及混合也可以帮助实现均匀的电镀密度之前的介质升温。
其次，该容器类型也影响铺板密度。 图1清楚地表明细胞/孔的数量不能线性SCA导致了不同的血管表面积（换句话说，细胞/表面积相同数量不能被应用到每个容器类型）。较小的容器（具有较大体积/面积比）的影响更受媒体表面张力，这使得介质，即所谓的弯月面的凹面。表面张力推动细胞到孔的边缘和在中心处减小密度。此外，由于在小容器媒体量低，媒体升温快，降低了对流力。因此，细胞在小容器会移动到边缘由该弯月面效应，并且不会被对流力移动到中央。因此，该容器越小，更高，以获得在中心的最佳密度所需的铺板密度。
第三，细胞的条件之前，电镀也间接影响铺板密度和分化效率。我们发现在某些实验中最佳的密度的变化。与实验在第一天死亡率更高需要更高的密度进行高效分化。 ESC培养物在血清和LIF组成的异质群体幼稚多能细胞，致敏多能干细胞，并且甚至少数分化细胞16的。这些类型的细胞具有不同的能力，生存和分化的条件下分化。由于协议规定的数量，而不是细胞的状态，一些实验可能会开始与更加分化的细胞，这将死在最初几天，导致更低的密度比预期的。为了避免这种情况的变化，ESC一致的文化是需要确保每个国家之间的固定比例保持不变。
除了密度，定时是另一个因素，以实现高效率的分化。在此出版物中，我们描述6天内神经祖细胞的产生。然而，时间可以是不同的视的状态起始ESC文化。如上所述，ESC培养物是混合群，可以以不同的分化条件作出反应。不仅在细胞存活，而且分化的定时会受培养组合物。此协议可应用到大多数ESC培养条件例如，在含有LIF和BMP4，或2i和LIF N2B27介质。然而，如果有更多的幼稚细胞中培养，较长时期可能需要有效的分化。这是因为，幼稚细胞将需要更多的时间来切换到准备状态，然后分化为神经祖细胞。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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