Abstract
La capacidad para diferenciar las células madre embrionarias de ratón (ESC) a progenitores neurales permite el estudio de los mecanismos que controlan la especificación neural, así como la generación de tipos de células neuronales maduros para el estudio adicional. En este protocolo se describe un método para la diferenciación de ESC para progenitores neurales utilizando suero libre, la cultura monocapa. El método es escalable, eficaz y resulta en la producción de ~ 70% de células progenitoras neurales dentro de 4 - 6 días. Se puede aplicar a ESC de diversas cepas cultivadas bajo una variedad de condiciones. Progenitores neurales se puede permitir que diferenciar aún más en neuronas funcionales y glía o analizado mediante microscopía, citometría de flujo o técnicas moleculares. El proceso de diferenciación es susceptible de microscopía de lapso de tiempo y se puede combinar con el uso de líneas de reportero para supervisar el proceso de especificación neural. Proporcionamos instrucciones detalladas acerca de la preparación de los medios de comunicación y la optimización de la densidad celular para permitir que el proceso de abe aplica a la mayoría de las líneas de la ESC y una variedad de recipientes de cultivo celular.
Introduction
Las células madre embrionarias son células pluripotentes derivadas de embrión temprano con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro conservando la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares adulto siguientes reintroducción en un embrión etapa apropiada (mediante la formación de una quimera), la inyección en singénicos o inmunocomprometidos hosts (mediante la formación de un teratoma) o in vitro sujetos a las señales apropiadas 1. La diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales fue descrita por primera vez en 1995 y consistió en la formación de agregados de suspensión multicelulares (cuerpos embrionarios, EBS) en medios que contienen suero complementado con el ácido retinoico morfógeno 2-4. Desde entonces una variedad de protocolos han sido desarrollados para permitir la diferenciación neural 5. Muchos todavía utilizar la agregación, otros co-cultivo con la inducción de tipos de células y varios implican el uso de medios libres de suero. Todos los protocolos tienen ventajas unasnd desventajas y la naturaleza precisa de neural o células neuronales producidas también varía de acuerdo con el protocolo utilizado.
El protocolo ideal sería que robusto, escalable y hacer uso de los medios de comunicación y sustratos completamente definidos, ser susceptibles de monitorización no invasiva del proceso de diferenciación y el resultado en la generación de poblaciones puras de progenitores neurales capaz de ser modelada por las señales externas y para diferenciar en todos los subtipos neuronales y gliales con alta eficiencia y rendimiento en un tiempo relativamente corto. En los últimos doce años hemos estado utilizando un método para generar células progenitoras neuronales y neuronas de ratón CES en una baja densidad, la cultura monocapa adherente sin suero 6-10. Este protocolo cumple muchos de los criterios establecidos anteriormente: en nuestras manos la eficiencia de diferenciación ha sido bastante constante durante muchos años y una variedad de líneas celulares, se puede escalar hacia arriba o hacia abajo (que utilizamos con éxito buques de placas de 96 pocillos a 15 cm de diámetro diella es) y los medios utilizados están bien definidos. El proceso es susceptible de microscopía timelapse para el seguimiento de la diferenciación y una variedad de señales de modelado puede ser añadido para inducir la generación de distintos tipos de subtipos neuronales (por ejemplo, Shh y Fgf8 para las neuronas dopaminérgicas 6).
Sin embargo, hay algunos retos para la aplicación exitosa de este protocolo. Uno de los aspectos clave es la preparación cuidadosa de los medios de comunicación. Siempre nos preparamos los medios de comunicación en la empresa a pesar de la disponibilidad de alternativas comerciales. Uno de los suplementos utilizados (N2; véase el Protocolo) tiene modificaciones sobre el estándar versiones disponibles en el mercado. Por último, uno de los pasos más importantes para la aplicación exitosa de este método es la densidad celular óptima en chapado. Esto es principalmente porque mientras que la naturaleza autocrina de una de las señales que inducen (Fgf4 11) requiere que las células están presentes suficientes para permitir viabil óptimadad y la diferenciación, a muy altas densidades de diferenciación se deteriora (posiblemente en parte debido a la producción autocrina de LIF 12). Por ello es importante que la preparación tanto de los medios y chapado celular se realizan con cuidado y consistentemente para asegurar resultados óptimos.
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Protocol
1. Preparación de Medios
NOTA: El protocolo se basa en el uso de una mezcla de dos por separado medios de comunicación: DMEM / F12 suplementado con suplemento N2 modificado y Neurobasal suplementado con suplemento B27, típicamente en una relación 1: 1.
- Preparar el suplemento N2 modificado por mezcla de los componentes en un tubo de 15 ml. No vórtice o filtrar esto; mezclar invirtiendo el tubo hasta que la solución es clara.
- Comience con la pipeta 7,2 ml de DMEM / F12, a continuación, añadir 1 ml de 25 mg / ml de insulina (compuesto en HCl 0,01 M) y mezclar bien invirtiendo el tubo. Se tarda un par de minutos hasta que la solución es clara.
- Añadir 1 ml de 100 mg / ml, apo-transferrina (compuesto en agua), 33 l de 0,6 mg / ml progesternone (compuestos en etanol), 100 l de 160 mg / ml (1 M) putrescina (compuesto en el agua ), 10 l de selenito de sodio 3 mM (compuesto en agua) y 666 l de 7,5% de albúmina de suero bovino y mezclar bien el tubo. Alícuota en 2,5 ml y se almacena a -20 °C durante un máximo de 2 meses.
- Preparar los medios de comunicación.
- Para 250 ml de DMEM / F12 añadir 2,5 ml de N2. Mezclar bien pero no sacuda o filtro.
- Para 250 ml de Neurobasal noticias agregar 5 ml de suplemento de B27. Mezclar bien pero no sacuda o filtro.
- Mezclar los medios de comunicación de los pasos 1.2.1 y 1.2.2 en una proporción de 1: 1. En algunos casos una mezcla 1: 3 puede ser necesaria (complementado como la mezcla 1: 1 en el paso 1.2.4).
- Para la mezcla de añadir 0,5 ml de L-glutamina (concentración final 0,2 mM) y 3,5 l de 2-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM) y mezclar bien sin agitación. Almacene el papel a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y evitar la exposición a la luz. Esta mezcla final se llama N2B27.
- Preparar la solución de gelatina.
- Preparar una solución de gelatina al 1% en agua ultrapura y autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. Es importante que la botella se utiliza para esto es completamente limpio de los detergentes o desinfectantes, por lo que se recomienda que una nueva botella esutilizado para esto y es sólo alguna vez se enjuaga en agua ultrapura entre usos. Alícuota la solución al 1% en 50 ml alícuotas y mantenga a 4 ° C durante meses.
- Calentar una alícuota del 1% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C hasta que se disuelva y añadir a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato caliente (PBS). Mezclar bien y pipetear suficiente para cubrir el fondo de cada pocillo o placa. Permitir la gelatina para recubrir la superficie de al menos 30 minutos.
2. Plating las células
NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC de ratón cultivadas en 10% de suero con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la sustitución de suero con LIF o medio libre de suero con LIF y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) o inhibidores de MEK y GSK3 (medios 2i) con o sin LIF. Sin embargo, el momento y la eficiencia de la diferenciación pueden variar en función de los medios de comunicación y las células (véase la discusión). Para los experimentos que se muestran aquí utilizamos la línea 46C ratón ESC (que tiene un reportero EGFP noqueó en one de los alelos Sox1 endógenos), que se cultiva en GMEM con 10% de suero y LIF. Para obtener resultados óptimos es importante que las células se disocian y se volvieron a sembrar en los medios N2B27; simplemente cambiando de medios de comunicación de GMEM / suero / LIF a N2B27 siempre resulta en una eficiencia de diferenciación reducida en comparación con resiembra las células.
- Cultivar las células en GMEM con 10% de suero, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanol, y 100 unidades / LIF 13 ml. Para conseguir una cultura subconfluente de ratón CES, la placa 1 x 10 6 células en un cultivo en matraz T25 que se llevará a 2-3 días.
- Observar las células bajo el microscopio de campo claro. Cuando las células son subconfluent y listo para pasaje, enjuagarlos dos veces en PBS. Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células y volver a la incubadora durante 2 - 5 min. Aunque la tripsina y otras enzimas también pueden ser utilizados para la disociación celular, que pueden tener un impacto negativo en la unión de células de modo que las densidades de chapado tendrán que ser Adjusted.
- Una vez que las células están empezando a levantar de la placa, toque el recipiente para desalojar en una sola suspensión celular. Recoger las células en un total de 10 ml de medios de comunicación y de disociación celular reactivo y pipeta en un tubo de centrífuga de 15 ml.
- Girar las células a 300 xg durante 3 min a TA.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado N2B27 pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. Cuando pipeteando la suspensión hacia abajo, pipeta contra el lado del tubo para evitar la creación de burbujas. Contar las células con un contador de células automatizado o un hemocitómetro y registrar la concentración.
- Preparar una suspensión de células que contiene el número deseado de células por unidad de volumen que se plateado por pocillo en pre-calentado N2B27. Una densidad de 10.500 células por cm 2 en una placa de 6 pocillos (es decir, 1 x 10 5 células por pocillo de una placa de 6 pocillos) es óptima. Ver Tabla 1 para sugerido número de células por cm 2 y plavolúmenes de medios ting para una variedad de recipientes de cultivo celular.
- Aspirar la gelatina del recipiente de cultivo y la placa la suspensión celular de acuerdo con la densidad y el volumen sugerido en la Tabla 1. No agitar las placas ya que esto concentrar las células hasta el centro. Coloque las culturas en una incubadora húmeda a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cambie medios cada 1 - 2 días reemplazando todos los medios de comunicación con N2B27 fresco. Pipeta suavemente como el lavado de las células podría afectar la densidad y disminuir la eficiencia de la diferenciación en los siguientes días. Dónde viabilidad inicial después de la siembra es pobre, la placa de las células en una mezcla 1: 3 de los medios de comunicación N2 y complementados-B27 y cambiarlo a N2B27 después de los dos primeros días. Las células se empiezan a diferenciar y deben mostrar la expresión Sox1 (visible por fluorescencia verde del reportero en la línea celular 46C utilizado aquí) dentro de 4-6 días.
3. La tinción de inmunofluorescencia
NOTE: El protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de recipiente. El volumen de cada reactivo se describe por pocillo de placa de 6 pocillos y se puede escalar a cualquier superficie. Replating no se recomienda debido a la viabilidad baja después.
- Quitar medio de diferenciación y fijar las células mediante la adición de 500 l de 4% (v / v) paraformaldehído, dejar durante 15 min.
- Lavar y permeabilizar las células con 2 ml de PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con 0,5% (v / v) de Tween-20) dos veces. Las células se pueden mantener en PBS-T para un máximo de 2 meses a 4 ° C.
- Reemplazar PBS-T con 1 ml de PBS-T con 10% (v / v) de suero (de la misma especie que el anticuerpo secundario). Incubar 1 hora en el balancín placa a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión no específica.
- Después de 1 hora, se lavan las células dos veces con 2 ml de PBS-T, y se incuban en 500 l de IgG de ratón contra βIII-tubulina (diluido 1: 1000 en PBS-T con 10% de suero). Poner en el plato oscilante, y dejar de O / N a 4 ° C.
- Desde este paso, siempre proteger el buquede la luz. Lavar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia (diluido a 2 g / ml en PBS-T con 10% de suero). Póngalo en la placa oscilante durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Enjuagar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de DAPI (diluido a 0,5 mg / ml en PBS-T) y se deja durante 5 min.
- Lavar las células de nuevo y mantenerlos en PBS-T. Las células están listas para ser fotografiados y se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a 4 ° C. Tenga en cuenta que la señal de las buenas prácticas agrarias se desvanece con el tiempo por lo que es inapropiado comparar la intensidad de las buenas prácticas agrarias de células fijadas y en directo o de células fijadas en diferentes momentos.
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Representative Results
En este experimento, se utilizó la línea celular 46C 14, las células madre embrionarias de ratón con un reportero Sox1-GFP endógeno, para rastrear la diferenciación neuronal. Mediante el uso de esta línea celular, la expresión de Sox1, un marcador de progenitor neural, puede ser detectado por fluorescencia verde. Revestimiento de densidad es un factor crítico para lograr la diferenciación neuronal. Las células madre embrionarias de ratón se sembraron en placa de 6 pocillos a diferentes densidades que varían de 10.500 a 88.500 células / cm 2. Figura 1A muestra la eficiencia de diferenciación alcanzados por diferentes densidades de chapado en una placa de 6 pocillos. En el día 6 de la diferenciación, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y se tiñeron para el marcador neuronal βIII-tubulina. En la densidad óptima (10.500 células / cm 2), células diferenciadas a los progenitores neuronales y neuronas. Esto fue observado por la señal fluorescente verde de reportero-Sox1 GFP y de inmunofluorescencia contra el marcador neuronal, βIII-tubulina. A lower densidad de placas llevó a la muerte celular dentro de 3 días. Sin embargo, chapado en demasiado alta densidad (> 36.500 células / cm 2) resultó en la disminución de la proporción de células verdes y células positivas βIII-tubulina. La Figura 1B muestra un experimento realizado en una placa de 96 pocillos que requirió aproximadamente 10 veces superior a la densidad celular llegar a la óptima (155.000 células / cm 2) y el demasiado confluente (362.500 células / cm 2) nivel.
Densidad óptima puede ser diferente entre las preparaciones de medios, componente de medios y los lotes de células, tipos de células, o condiciones de cultivo anteriores. Se recomienda para optimizar densidad de placas para cada experimento. La Tabla 1 proporciona rangos de densidades de chapado eficaces en distintas plataformas que deben ser incluidos en el paso de optimización. Dentro de este rango, debe ser posible conseguir una densidad que da una buena eficiencia de diferenciación dentro de 4 - 6 días.
Durante la diferenciación ESC de cambiar gradualmente su morfología. Figura 2 muestra la morfología celular y la colonia del día 1 al día 6 después de la siembra en placa de 6 pocillos a 10.500 células / cm 2. Las células fueron cultivadas en condiciones de diferenciación y se fotografiaron cada día. No es raro ver a la muerte celular significativo en los primeros días debido al cambio extremo en condiciones de cultivo. Sin embargo, las células restantes son todavía capaces de diferenciarse. En el día 4, las células comenzaron a ser progenitores neurales como señal fluorescente verde de reportero Sox1-GFP apareció en primer lugar. Sin embargo, incluso en días 6, no todas las células son Sox1-positivo. Se espera Existencia de algunas células no neuronales, sin embargo, en las condiciones adecuadas, la mayoría de las células será neural.
Figura 1. El efecto de la densidad de placas en la eficiencia de diferenciación. Dos diferentesdensidades de células reportero-Sox1 GFP (46C) se sembraron y diferenciados según el protocolo durante 6 días. (A) La diferenciación en una placa de 6 pocillos. (B) Diferenciación en una placa de 96 pocillos. Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. morfologías celular durante el proceso de diferenciación. 46C ESC se diferenciaron en 10500 células por cm 2 en una placa de cultivo de 6 pocillos y se fotografiaron diariamente para observar los cambios en la morfología celular. Barra de escala:. 300 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Plataforma | Rango de densidad efectiva (células / cm 2) | Rango del número de células a la placa | Volumen de medios inicial sugerido (l) | Sugerido volumen de medios de comunicación tras día 1 (l) |
| Placa de 6 pocillos | 10500 - 36500 | 99750 - 346750 | 1000 | 2000 |
| Placa de 24 pocillos | 15600 - 46800 | 29640 - 88920 | 500 | 1000 |
| Placa de 96 pocillos | 103500 - 260000 | 33120 - 83200 | 100 | 200 |
Tabla 1. sugerido chapado densidades y volúmenes de los medios de comunicación para los diferentes tamaños de los buques. Las densidades de chapado en esta tabla se determinaron utilizando la línea celular de 46C. Para obtener resultados óptimos la densidad de placas de cada línea individual puede tener que ser adjUsted.
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Discussion
El protocolo de diferenciación neural monocapa ha estado en uso durante más de una década 6. El protocolo es altamente eficiente, compuesto de medio definido, y hecho en un sistema monocapa que hace que el sistema sea más aplicable para preclínica (por ejemplo, detección de drogas) utiliza. Sin embargo, hay algunos factores críticos que determinan la eficiencia de diferenciación. Este artículo señala los factores y la solución para cada obstáculo.
Densidad de las células después de la siembra en la condición de diferenciación es quizás el factor más crítico. Plating las células a demasiado alta densidad reduce la eficiencia de diferenciación, mientras chapado en demasiado baja densidad conduce a la muerte celular. Este fenómeno es debido probablemente a la señalización del factor de crecimiento autocrino. Fgf4 es un factor de crecimiento autocrino que activa la cascada de MAPK y conduce ESC diferenciación 11. LIF es otra citoquina producida por ESC. Se activa la vía STAT3 y promueve la auto-renovación <sup> 15. Este protocolo utiliza N2B27 para hacer células neuronales. N2B27 contiene diversos factores que permiten la supervivencia ESC y promueve el crecimiento celular neural, y no contiene ya sea LIF o BMP4 que inhiben la diferenciación neural 6. En la densidad apropiada, se mantiene un equilibrio adecuado de la señalización de Fgf4 y LIF que permite ESC para diferenciar. En alta densidad, cantidad excesiva de LIF autocrina y BMP diferenciación de inhibición. En contraste, las células en demasiado baja densidad han deteriorado la supervivencia en estos medios de comunicación bastante mínimos. Por lo tanto, cuando aparecen grandes números de células sin diferenciación en el número de placas debe reducirse, mientras que se requiere un aumento del número de células de chapado si se observa una muerte celular significativa.
Además del número de células hay algunos otros factores que afectan indirectamente densidad de placas. El primer factor es la concentración celular local, dependiendo de la técnica utilizada para distribuir uniformemente las células sobre la superficieárea. Hemos encontrado que girar el bien no es ideal, ya que concentra las células al centro del pozo y hace que la densidad en el centro demasiado alta, mientras que en la periferia de la densidad se convierte en demasiado baja. Se recomiendan otras técnicas de mezcla, por ejemplo, mezclando los medios de comunicación con las células antes de chapado, o balanceo del lado a lado de la placa. Por otra parte, cuando un vaso se coloca en la incubadora, un calentamiento desigual del medio provoca una fuerza de convección que atrae las células al centro del pozo, lo que resulta en la distribución de las células en un patrón de anillo concéntrico. Se recomienda un volumen de soporte inferior en el día de recubrimiento para reducir este efecto. Dejando la placa fuera de la incubadora durante 30 minutos para dejar que las células se unen, así como calentar el medio antes de la mezcla también puede ayudar a alcanzar una densidad de placas homogénea.
En segundo lugar, el tipo de buque también afecta chapado densidad. La Figura 1 muestra claramente que el número de células / pocillo no puede ser linealmente scaconducido a la superficie de diferentes vasos (en otras palabras, el mismo número de células / área de superficie no se puede aplicar a cada tipo de buque). Un recipiente más pequeño (con una relación de mayor volumen / área) se ve más afectado por la tensión superficial medios de comunicación que hace que una superficie cóncava de medio, el llamado menisco. La tensión superficial empuja las células al borde del pozo y disminuye la densidad en el centro. Además, dado que el volumen de los medios de comunicación en la pequeña embarcación es baja, los medios de comunicación se calientan rápidamente, lo que reduce la fuerza de convección. Por lo tanto, las células en una pequeña embarcación se moverán hasta el borde por el efecto de menisco, y no se moverán al centro por las fuerzas de convección. Por lo tanto, cuanto menor sea el recipiente, mayor es la densidad de placas requerida para obtener la densidad óptima en el centro.
En tercer lugar, la condición de las células antes de chapado también afecta indirectamente densidad de placas y la eficiencia de diferenciación. Encontramos una variación de la densidad óptima en algunos experimentos. Los experimentos conmás alta tasa de mortalidad en el primer día necesitaba una mayor densidad de diferenciación eficiente. Culturas ESC en el suero y LIF se componen de una población heterogénea de células pluripotentes ingenuas, las células pluripotentes cebados, e incluso un pequeño número de células diferenciadas 16. Las células de estos tipos tienen diferente capacidad de sobrevivir y diferenciar en condiciones de diferenciación. Dado que el protocolo dicta en el número, pero no el estado de las células, algunos experimentos podrían comenzar con células más diferenciadas que van a morir en los primeros días, lo que lleva a una densidad más baja de lo esperado. Para evitar esta variación, se requiere la cultura consistente de ESC para asegurarse de que se mantiene la proporción constante entre cada estado.
Aparte de la densidad, el tiempo es otro factor para lograr la diferenciación eficiente. En esta publicación, se describe la generación de progenitores neurales dentro de los 6 días. Sin embargo, el tiempo puede ser diferente dependiendo del estado dela cultura ESC de partida. Como se describió anteriormente, los cultivos DESC son poblaciones mixtas que pueden responder de manera diferente a la condición de diferenciación. No sólo la supervivencia de las células sino también el momento de la diferenciación se verán afectados por la composición de cultivo. Este protocolo se puede aplicar a la mayoría ESC condiciones de cultivo, por ejemplo, en medios que contienen N2B27 LIF y BMP4, o 2i y LIF. Sin embargo, si hay más células ingenuas en la cultura, un período más largo podría ser necesario para la diferenciación eficiente. Esto se debe a que las células ingenuas necesitarán más tiempo para cambiar a un estado preparado y luego diferenciarse para progenitores neurales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
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