Introduction
नैदानिक प्रासंगिक, नकली मोतियाबिंद सर्जरी, यहाँ वर्णित पूर्व vivo उपकला घाव भरने मॉडल एक चोट के जवाब में उपकला ऊतकों की मरम्मत को नियंत्रित करने वाले तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था। इस मॉडल को बनाने में के लिए उद्देश्य से किया गया है कि मुख्य विशेषताएं, बारीकी से मरम्मत की प्रक्रिया एक संस्कृति की स्थापना, 2), मरम्मत के नियामक तत्व modulating के आराम में लोग घायल हो गए करने के लिए इन विवो प्रतिक्रिया दोहराया और छवि के लिए 3) क्षमता है कि 1) प्रदान शर्तों शामिल वास्तविक समय में अपनी संपूर्णता में। चुनौती है, इसलिए, कोशिकाओं 'देशी microenvironment में, उपकला घाव की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए यह संभव हो गया था, जिसमें एक संस्कृति मॉडल बनाने के लिए, और हेरफेर करने के लिए किया गया था। इस घाव की मरम्मत मॉडल की उपलब्धता की मरम्मत की प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले मैट्रिक्स प्रोटीन, साइटोकिन्स और chemokines से अंतर्जात संकेतन संकेतों की पहचान करने के लिए नई संभावनाओं को खोलता है। इसके अलावा, मॉडल की जांच के लिए आदर्श है कि कैसे एकएन उपकला घाव क्षेत्र 2,3, फिर से epithelialize करने के लिए एक सामूहिक पत्र के रूप में और घायल उपकला 4 की सामूहिक प्रवास के निर्देशन में कार्य करते हैं घाव किनारे पर mesenchymal नेता कोशिकाओं के वंश का निर्धारण करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए सक्षम है। यह मॉडल भी प्रभावी घाव भरने को बढ़ावा देने और न्यायपालिका घाव की मरम्मत 5 रोकने सकता है कि चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने के लिए जो के साथ एक मंच प्रदान करता है।
उपलब्ध घाव की मरम्मत के मॉडल की एक संख्या संस्कृति में है और आज घाव की मरम्मत की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है का सबसे प्रदान की है जो इन विवो, दोनों में पहले से ही कर रहे हैं। ऐसे कॉर्निया 6-12 और त्वचा 13-17 के रूप में पशु चोट मॉडल, में, से योगदान सहित प्रक्रिया में शामिल किया जा सकता है कि सभी की मरम्मत मध्यस्थों, के संदर्भ में लोग घायल हो गए करने के लिए ऊतक की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने का अवसर है vasculature और तंत्रिका तंत्र। हालांकि, अनुभव जोड़ तोड़ करने के लिए सीमाएं हैंvivo में मानसिक स्थिति, और यह लगातार समय के साथ, विवो में मरम्मत प्रतिक्रिया के इमेजिंग अध्ययन का संचालन करने के लिए अभी तक संभव नहीं है। इसके विपरीत, इस तरह के खरोंच घाव के रूप में सबसे इन विट्रो घाव की मरम्मत संस्कृति मॉडल, आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है और समय के साथ पीछा किया, लेकिन इन विवो ऊतक में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए पर्यावरण के संदर्भ की कमी है। पूर्व vivo मॉडल प्रक्रिया में किसी भी समय बिंदु पर मरम्मत की आणविक नियामकों मिलाना करने की क्षमता के साथ युग्मित 'कोशिकाओं microenvironment के संदर्भ में समय के साथ लगातार चोट की मरम्मत की प्रक्रिया का अध्ययन करने का लाभ प्रदान करते हैं, इन फिट है कि कुछ मॉडल हैं पैरामीटर।
यहाँ एक शारीरिक लोग घायल हो गए करने के लिए एक उपकला ऊतक की प्रतिक्रिया को पुन: पेश संस्कृतियों है कि चिकित्सा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पूर्व vivo उपकला घाव उत्पन्न करने के लिए एक प्रक्रिया में वर्णित है। एक ऊतक स्रोत, एक पूर्व vivo एमओसी के रूप में लड़की भ्रूण लेंस का प्रयोगकश्मीर मोतियाबिंद सर्जरी प्रदर्शन किया है। लेंस avascular, innervated, और कोई भी संबद्ध स्ट्रोमा 18,19 से मुक्त नहीं है, यह आत्म निहित एक मोटी तहखाने झिल्ली कैप्सूल के भीतर है के बाद से इन अध्ययनों के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श ऊतक है। मानव रोग में मोतियाबिंद सर्जरी की वजह से लेंस की अपारदर्शन को दृष्टि हानि के पते, और लेंस के थोक शामिल हैं जो लेंस फाइबर सेल जन, को हटाने शामिल है। बाद मोतियाबिंद सर्जरी दृष्टि एक कृत्रिम intraocular लेंस की प्रविष्टि के माध्यम से बहाल है। मोतियाबिंद सर्जरी प्रक्रिया, फाइबर कोशिकाओं को हटाने के माध्यम से, फाइबर कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया गया था कि लेंस कैप्सूल के पीछे क्षेत्र के फिर से epithelialization से प्रतिक्रिया करता है जो आसन्न लेंस उपकला में एक चोट प्रतिक्रिया लाती है। मोतियाबिंद सर्जरी में, सबसे घाव की मरम्मत प्रतिक्रियाओं के रूप में, कभी कभी लेंस में पीछे Capsu के रूप में जाना जाता है जो myofibroblasts के उद्भव के साथ जुड़ा हुआ घाव चिकित्सा प्रतिक्रिया करने के लिए एक न्यायपालिका तंतुमय परिणाम, वहाँ होती हैLe अपारदर्शन 20-22। मोतियाबिंद सर्जरी के घाव भरने मॉडल उत्पन्न करने के लिए, एक मोतियाबिंद सर्जरी प्रक्रिया एक शारीरिक चोट का उत्पादन करने के लिए लड़की भ्रूण आंख से हटा लेंस में मजाक उड़ाया जाता है। लेंस उपकला कोशिकाओं से घिरा हुआ एक बहुत ही संगत परिपत्र घाव क्षेत्र में लेंस फाइबर कोशिकाओं के परिणामों के microsurgical हटाने। इस सेल की आबादी मजबूती से लेंस तहखाने झिल्ली कैप्सूल के साथ जुड़ा रहता है और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया से घायल हो गया है। उपकला कोशिकाओं नेता कोशिकाओं के रूप में 1 की मरम्मत की प्रक्रिया में जाना जाता vimentin अमीर mesenchymal कोशिकाओं की आबादी के नेतृत्व में घाव, चंगा करने के लिए अंतर्जात तहखाने झिल्ली के denuded क्षेत्र पर आ जाते हैं। इस मॉडल के साथ चोट करने के लिए एक उपकला की प्रतिक्रिया आसानी से देखे जा सकते हैं और कोशिकाओं 'microenvironment के संदर्भ में समय के साथ पीछा किया। कोशिकाओं अभिव्यक्ति या घाव की मरम्मत में एक भूमिका निभाने की उम्मीद अणुओं की सक्रियता का संशोधन करने के लिए आसानी से सुलभ हैं। वें में से एक शक्तिशाली सुविधामॉडल अलग है और घाव भरने के ढांचे में माइग्रेशन-विशिष्ट परिवर्तनों का अध्ययन करने की क्षमता है। अध्ययन के लिए आयु वर्ग के मिलान किया पूर्व vivo घाव भरने संस्कृतियों की बड़ी संख्या को तैयार करने की क्षमता इस मॉडल का एक और फायदा है। इस प्रकार, इस मॉडल प्रणाली घाव भरने की प्रक्रिया पर उनके प्रभाव के लिए घाव की मरम्मत के तंत्र और परीक्षण चिकित्सा विज्ञान के अलावा तंग करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। पूर्व vivo नकली मोतियाबिंद सर्जरी मॉडल चोट की मरम्मत के तंत्र के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन उपलब्ध कराने के व्यापक लागू होने की संभावना है।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के साथ और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के अनुरूप है।
पूर्व vivo घाव संस्कृति के लिए लेंस के 1. सेटअप और तैयारी
- एक बाँझ, लामिना का प्रवाह हुड में तीन 100 मिमी पेट्री डिश में रखें। आरटी पर, आधे रास्ते Tris / Dextrose बफर के साथ पेट्री डिश में से दो (140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 0.7 मिमी ना 2 पीओ 4, 5 मिमी डी ग्लूकोज, 8.25 मिमी Tris बेस, एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को टीडी बफर) भरें , तीसरे खाली छोड़कर। पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया 37 ओ सी के लिए (मीडिया 199, 1% एल glutamine और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)
नोट: इन विवो में होता है के रूप में संस्कृति मीडिया चिकित्सा मानक घाव, सीरम मुक्त है; हालांकि, घाव की मरम्मत संस्कृतियों सीरम या अन्य कारकों में शामिल हैं कि परिभाषित मीडिया की स्थिति में सफलतापूर्वक उगाया जा सकता है। - उपजाऊ भ्रूण डी निकालेंप्र इनक्यूबेटर से 15 सफेद लिवोमो लड़की अंडा (कोमल कमाल के साथ 37.7 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित)
- एक धोने की बोतल से लामिना का प्रवाह हुड और 70% इथेनॉल के साथ खोल से साफ बाहर में चयनित अंडा रखें। बाँझ समाधान और उपकरणों का उपयोग कर, लामिना का प्रवाह हुड में सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत नीचे सभी प्रक्रियाओं का संचालन।
- खाली 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे और जगह सामग्री क्रैक। मानक संदंश और ठीक कैंची का उपयोग भ्रूण सिर काटना। टीडी बफर युक्त एक पेट्री डिश में लड़की भ्रूण सिर प्लेस और ठीक से भ्रूण के शेष के निपटान के। वैकल्पिक रूप से 15 मिनट से अधिक समय नहीं, समय की एक छोटी अवधि के लिए टीडी बफर में लड़की भ्रूण सिर रखने के लिए।
- एक पेट्री डिश के ढक्कन पर लड़की भ्रूण सिर रखें। उच्च परिशुद्धता संदंश का प्रयोग, निम्न क्रम में आंख से अपनी संलग्न शीशे हास्य के साथ-साथ लेंस को हटा दें। आँख के पीछे एक छोटे से खोलने बनाने के लिए संदंश के साथ आंखों के पीछे चुटकी।
- फिर, डब्ल्यू शीशे हास्य काबूith संदंश और धीरे से एक रोलिंग गति के साथ कांच पर tug, संलग्न लेंस के साथ कांच का आंख से उखाड़ फेंकना किया जाएगा। टीडी बफर युक्त शेष पेट्री डिश में कांच का स्थान लेंस /। लेंस अब से 30 मिनट के लिए टीडी बफर में रहने की अनुमति दें।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक नया पेट्री डिश ढकने के लिए लेंस ले जाएँ। इस बात पर से एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन करते हैं। उच्च परिशुद्धता संदंश ध्यान से लेंस के ऊतकों को नुकसान नहीं सावधानी ले रही है, संदंश के किनारे का उपयोग कर लेंस के साथ उखाड़ फेंकना गया है कि किसी भी सिलिअरी शरीर (pigmented कोशिकाओं) दूर ब्रश के साथ।
नोट: सिलिअरी शरीर को निकाला जा रहा लेंस करने के लिए अंतर्जात नहीं कर रहे हैं कि सेल प्रकार घाव की मरम्मत संस्कृति में शामिल नहीं हैं जो यह सुनिश्चित करता है। - पीछे लेंस कैप्सूल के साथ अपने सहयोग से कांच का शरीर बंद बन्द रखो द्वारा उच्च परिशुद्धता संदंश के साथ कांच का हास्य से लेंस अलग करें।
- उच्च परिशुद्धता का उपयोग कर एक छोटी सी बूंद में लेंस हस्तांतरण संदंशएक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में टीडी बफर (लगभग 200 μl) के।
2. प्रदर्शन मॉक मोतियाबिंद सर्जरी
- सामना करना पड़ रहा लेंस के पूर्वकाल पहलू के साथ 35 मिमी डिश में टीडी बफर के ड्रॉप में लेंस उन्मुख।
नोट: लेंस के पूर्वकाल आसानी से लेंस उपकला के पूर्वकाल और भूमध्य क्षेत्र के बीच सीमा नोटों कि ऊतक में एक घने अंगूठी की मौजूदगी से पहचाना जाता है। इसके विपरीत, लेंस फाइबर कोशिकाओं से जुड़े होते हैं, जो करने के लिए लेंस कैप्सूल के पीछे पर चिह्नों का अभाव है। - , एक हाथ में एक संदंश के साथ ऊतक लोभी द्वारा दो उच्च परिशुद्धता संदंश पूर्वकाल लेंस कैप्सूल, लेंस ऊतक है कि चारों ओर मोटी तहखाने झिल्ली, और उसके संबंधित पूर्वकाल लेंस उपकला के बीच में एक छोटा सा चीरा (लगभग 850μm) बनाने का प्रयोग और धीरे का विरोध दिशाओं में tugging।
- लेंस के ऊतक, dislod के थोक बनाता है जो फाइबर सेल जन, निकालेंलेंस उपकला करने के लिए अपने अनुलग्नकों से यह ging और (चित्रा 1 ए में मॉडलिंग की क्लासिक मोतियाबिंद सर्जरी में इस्तेमाल एक दृष्टिकोण) पन क्षालन द्वारा लेंस कैप्सूल आसपास के।
- टीडी बफर के 300 μl के साथ एक 27.5 जी सुई की नोक के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें। पूर्वकाल लेंस कैप्सूल में किए गए चीरा में सुई की नोक डालें, और के बारे में आधे रास्ते के लेंस में।
- धीरे लेंस फाइबर सेल मास में टीडी बफर इंजेक्शन लगाने सिरिंज दबाना। 50 और 200 के बीच μl टीडी, और कभी 300 से अधिक μl इंजेक्षन। उपकला और लेंस कैप्सूल से ही ढीला फाइबर सेल जन को ध्यान से देखें।
- उच्च परिशुद्धता संदंश का प्रयोग, पूर्वकाल चीरा साइट के माध्यम से लेंस से ढीला फाइबर सेल जन को हटा दें।
नोट: यह प्रक्रिया इस साइट के निकट फाइबर कोशिकाओं जुड़ी कोशिकाओं के denuded किया गया था, जो करने के पीछे लेंस तहखाने झिल्ली कैप्सूल, और एक घायल लेंस उपकला छोड़ देता है।
3. Preparinपूर्व vivo संस्कृति के लिए जी घायल लेंस
- सम्पुटी बैग के पूर्वकाल पहलू में पांच कटौती करके, संस्कृति डिश पर ऊपर वर्णित मोतियाबिंद सर्जरी, सेल की ओर से यह परिणाम है कि लेंस सम्पुटी बैग समतल।
- लेंस की भूमध्य रेखा के माध्यम से मूल चीरा साइट सीधा करने के लिए कट। नीचे संस्कृति डिश कैप्सूल तरफ संलग्न उपकला, सेल पक्ष के साथ लेंस कैप्सूल के एवज में पांच "फ्लैप" समतल। एक सितारा या flowerlike आकार (चित्रा 1 बी देखें) पर ले जाना चाहिए अब पूर्व vivo घायल लेंस ध्यान दें।
- स्टार के प्रत्येक बिंदु पर धीरे नीचे संदंश के साथ, डिश के लिए प्रेस कैप्सूल सुरक्षित। इस explant के पांच सबसे बाहर सुझावों पर एक छोटे खरोज बनाने के लिए और डिश के लिए निरंतर लगाव का परिणाम देगा।
नोट: यह इस प्रक्रिया के दौरान कैप्सूल को नुकसान करने के लिए संभव है और इसलिए यह fla के सुझावों के करीब के रूप डिश के लिए कैप्सूल सुरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैसंभव के रूप में पी एस, के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में हासिल अंकों की कम से कम राशि बनाने के लिए (आमतौर पर दो, फ्लैप प्रति तीन की अधिकतम)। - 35 मिमी पकवान से टीडी बफर निकालें और पूर्व गर्म मीडिया के 1.5 मिलीलीटर के साथ बदलें। इनक्यूबेटर में अपनी ढक्कन और जगह के साथ 35 मिमी पकवान कवर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
पोस्टीरियर कैप्सूल के घायल क्षेत्र के पुन: epithelialization मात्रात्मक विश्लेषण के लिए लेंस उपकला कोशिकाओं के मूल अनुलग्नक क्षेत्र (OAZ) से होती है, जहां केन्द्रीय प्रवासन क्षेत्र (CMZ), 4. पृथक्करण।
नोट: कोशिकाओं की चोट के जवाब में तुरंत CMZ क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए शुरू करते हैं। संस्कृति में एक दिन के द्वारा काफी कोशिकाओं सूक्ष्म विच्छेदन 23 से CMZ और OAZ की जुदाई के बाद, आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए CMZ भर में पलायन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल कैप्सूल के घायल क्षेत्र से एक समय में एक फ्लैप (OAZ) को हटाने शामिल है।
- एक Demar का निरीक्षणकेशन, OAZ और CMZ के बीच, विदारक माइक्रोस्कोप के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई (2A चित्रा देखें)। दो उच्च परिशुद्धता संदंश का प्रयोग, रेखा के दोनों तरफ, OAZ / CMZ लाइन, अन्य के निकट एक के किनारे पर दोनों संदंश के साथ समझ (2A चित्रा, बी, तीर देखें)।
- एक हाथ का उपयोग / CMZ पक्ष पर एक संदंश दूसरी ओर / संदंश के साथ, धीरे OAZ / CMZ रेखा के साथ OAZ खींच, जबकि घायल संस्कृति पर पकड़ जारी है। CMZ आसानी से इस रेखा के साथ OAZ से अलग करती है। दोनों क्षेत्रों के लिए पूरी तरह से अलग हो रहे हैं जब तक पूरी संस्कृति के आसपास इस रेखा के साथ जारी रखें।
- इस तरह के पश्चिमी धब्बा या सह immunoprecipitation 23,25 के रूप में इस तरह के शाही सेना Seq 24 या जैव रासायनिक विश्लेषण के रूप में आणविक विश्लेषण के लिए अलग OAZ और CMZ भिन्न के अध्ययन करें।
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Representative Results
पूर्व vivo मॉडल 'कोशिकाओं देशी microenvironment में घाव भरने की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए बनाया
'कोशिकाओं देशी microenvironment के भीतर एक उपकला के घाव भरने के विनियमन में शामिल तंत्र की जांच करने के लिए, एक नैदानिक प्रासंगिक पूर्व vivo नकली मोतियाबिंद सर्जरी मॉडल बनाया गया था। इस मॉडल की वजह से अपनी आंतरिक गुणों के लिए कई लाभ प्रदान करता है जो लेंस के ऊतकों से बनाया जाता है: 1) लेंस लेंस कैप्सूल नामक एक मोटी तहखाने झिल्ली से घिरा हुआ एक आत्म निहित अंग है; 2) यह avascular, 3) innervated नहीं और 4) जुड़े स्ट्रोमा से मुक्त है। इसलिए, जांच की मरम्मत की प्रक्रिया उचित लेंस को सहज हैं कि कोशिकाओं तक सीमित है। इस मॉडल बनाने के लिए, लेंस एक भ्रूण (ई) दिन 15 लड़की भ्रूण (चित्रा 1 ए) से हटा रहे हैं। एक छोटा सा चीरा लेंस फाइबर सेल जन निकाल दिया जाता है, जिसके माध्यम से पूर्वकाल लेंस कैप्सूल और उसके संबंधित लेंस उपकला कोशिकाओं में किया जाता हैपन क्षालन, एक physiologically प्रासंगिक लोग घायल हो गए (चित्रा 1 ए) बनाता है एक क्लासिक मोतियाबिंद प्रक्रिया द्वारा। vimentin अमीर mesenchymal मरम्मत सेल पूर्वज 1 की अपनी अंतर्जात आबादी के साथ फाइबर सेल जन, आसपास के पूर्वकाल साथ कोशिकाओं और लेंस कैप्सूल की इक्वेटोरियल पहलुओं में से एक सतत monolayer के रूप में मौजूद है जो लेंस उपकला, के दौरान लेंस में रहना फाइबर कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) के निष्कर्षण। फाइबर सेल जन को निकालने के बाद, पांच कटौती लेंस कैप्सूल के पूर्वकाल पहलू में बना रहे हैं और उपकला मध्यम सामना करना पड़ रहा है, ऊपर सेल साइड चपटा। इस प्रक्रिया के समय चूक माइक्रोस्कोपी (1 वीडियो) सहित विभिन्न सूक्ष्म दृष्टिकोण से घायल उपकला की प्रतिक्रिया के इमेजिंग सक्षम बनाता है। पूर्वकाल लेंस कैप्सूल में इन अतिरिक्त कटौती केंद्रों में फाइबर सेल जन को हटाने के द्वारा बनाई गई परिपत्र घाव के साथ घायल लेंस के एक स्टार के आकार explant बनाexplant (चित्रा 1 बी) के आतंकवाद। पोस्ट-मोतियाबिंद सर्जरी और ऊतक के सपाट, घायल उपकला मूल अनुलग्नक क्षेत्र (OAZ) के रूप में जाना जाता है, जो स्टार के अंक में स्थित है (चित्रा 1 ए, बी)।
पीछे लेंस कैप्सूल पर अपने लगाव साइट से फाइबर सेल जन को हटाने के घायल उपकला से घिरा हुआ तहखाने झिल्ली पर एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाव क्षेत्र बनाता है, (चित्रा 1 बी, सी)। फाइबर कोशिकाओं जुड़े थे जहां के निकट लेंस इक्वेटोरियल उपकला के उजागर धार, घाव के अग्रणी धार है। इसके तत्काल बाद चोट के बाद, vimentin अमीर mesenchymal कोशिकाओं की मरम्मत के लिए एक उप-जनसंख्या सक्रिय है और उपकला 1 के घाव किनारे करने के लिए migrates। लेंस उपकला, उनके अग्रणी धार पर इन mesenchymal कोशिकाओं की मरम्मत के साथ तेजी से अंतर्जात बी के सेल मुक्त क्षेत्र पर चालेंasement झिल्ली कैप्सूल, सेंट्रल प्रवासन क्षेत्र (CMZ), घाव भरने शुरू करने के लिए। लेंस उपकला कोशिकाओं सब्सट्रेट साथ protrusions के विस्तार और घाव भरने की प्रक्रिया प्रत्यक्ष जो mesenchymal नेता कोशिकाओं 1, के नेतृत्व में CMZ में, एक पत्र के रूप में, सामूहिक रूप से ले जाने के (एफ -1 डी, वीडियो 1 igure)। घाव भरने संस्कृति में 1 दिन से घाव (67%) (चित्रा 1C) का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र को कवर, प्रगति, और आम तौर पर संस्कृति में 3 दिन (चित्रा 1 बी, सी) के भीतर पूरा हो गया है।
एक स्पष्ट शारीरिक गौरव के रूप में जल्दी इन दो क्षेत्रों (2A चित्रा, तीर) के बीच एक क्रीज या शिकन के रूप में चिन्हित किया गया है, जो 1 दिन, के रूप में OAZ और CMZ क्षेत्रों के बीच बनाया जा सकता है। इस घटना में इन क्षेत्रों को अलग करने की है जिसके द्वारा एक दिशानिर्देश प्रदान करता है घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु। एक ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, संस्कृतियों SEPAR के लिए माइक्रो-विच्छेदित किया जा सकता हैये अलग क्षेत्रों (चित्रा 2 बी) के बीच आणविक अंतर का विश्लेषण करने के क्रम में OAZ और CMZ क्षेत्रों खा लिया। इस घाव की मरम्मत के साथ जुड़े माइग्रेशन-विशिष्ट परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक शक्तिशाली तरीका है। इससे पहले, यह प्रक्रिया 5 घाव भरने के दौरान पूर्व vivo घायल संस्कृतियों में फोकल आसंजन kinase (FAK) सक्रियण में वृद्धि हुई है कि पाया गया था। FAK सेल प्रवास 26-29 में एक अच्छी तरह से स्थापित भूमिका है। CMZ अब FAK सक्रियण में इस वृद्धि के प्रवास-विशिष्ट CMZ क्षेत्र के लिए विशिष्ट है कि क्या जांच करने के लिए यह संभव बना दिया बनाम क्षमता OAZ के लिए समृद्ध करने के लिए। (घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान) 3 और FAK सक्रियण (FAK pY397) में जैव रासायनिक परिवर्तन के लिए विश्लेषण - इस अध्ययन के लिए, OAZ और CMZ क्षेत्रों 1 दिन पर अलग हो गए थे। परिणामों FAK सक्रियण में वृद्धि प्रवास-विशिष्ट CMZ क्षेत्र (चित्रा -2) के साथ जुड़े थे कि प्रदर्शन किया।यहाँ वर्णित पूर्व vivo मॉडल प्रणाली घाव की मरम्मत की प्रक्रिया के समन्वय में शामिल आणविक कार्यक्रमों की जांच करने के लिए एक अनोखी और अमूल्य अवसर प्रदान करता है।
चित्रा 1. एक शारीरिक लोग घायल हो गए के जवाब में 'कोशिकाओं देशी माइक्रोएन्वायरमेंट भीतर घाव भरने की प्रक्रिया का अध्ययन करने में जो एक पूर्व vivo मॉडल का निर्माण। मॉक मोतियाबिंद सर्जरी E15 लड़की लेंस पर प्रदर्शन किया गया था। लेंस फाइबर कोशिका द्रव्यमान (सफेद) पन क्षालन द्वारा पूर्वकाल कैप्सूल में एक चीरा के माध्यम से निकाल दिया जाता है। इस प्रक्रिया को लेंस कैप्सूल और कोशिकाओं घाव (ए) को चंगा करने के लिए विस्थापित करेगा जिस पर एक सेल denuded तहखाने झिल्ली (बीएम) को कसकर पक्षपाती रहते हैं कि उपकला कोशिकाओं (हरा) पीछे छोड़ देता है। उपकला के लिए किया जाता पोस्टल कटौती समतल और आकार का पूर्व vivo पंथ एक स्टार बनाने के लिए ure (बी)। स्टार के अंक भरने कि अवशिष्ट लेंस उपकला कोशिकाओं मूल अनुलग्नक क्षेत्र (OAZ) के रूप में भेजा जाता है (ए, बी)। कोशिकाओं सेंट्रल प्रवासन क्षेत्र (CMZ) के रूप में जाना जाता है विस्थापित करेगा जिस पर denuded बीएम (ए, बी)। इसके तत्काल बाद चोट के जवाब में, कोशिकाओं सेल denuded बीएम (बी) पर CMZ क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए शुरू करते हैं। खुला घाव क्षेत्र (सी) में समय के साथ मात्रा निर्धारित है। घाव भरने के लिए आम तौर पर संस्कृति (बी, सी) में डी 3 के साथ पूरा हुआ। (बी, सी) T0 लोग घायल हो गए के समय अर्थ में, D1-3 दिन 1-3 अर्थ। CMZ के भीतर, कोशिकाओं के दो आबादी, सब्सट्रेट (डी) के साथ उभार का विस्तार लेंस उपकला कोशिकाओं और घाव किनारे करने के लिए स्थानीय बनाना कि mesenchymal नेता कोशिकाओं, प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यह आंकड़ा Menko एट अल 23 से reprinted है।लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
OAZ और CMZ क्षेत्रों के चित्रा 2. पृथक्करण घाव भरने के साथ जुड़े माइग्रेशन-विशिष्ट परिवर्तन की पहचान करने के लिए।, OAZ और CMZ क्षेत्रों को एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता 1 दिन से अलग करने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक क्रीज (तीर) द्वारा इन क्षेत्रों (ए)। इस क्रीज पर, ठीक इत्तला दे दी संदंश पकड़ के लिए OAZ / CMZ लाइन के किनारे इस्तेमाल किया जा सकता है। संस्कृति OAZ और CMZ क्षेत्रों (बी) के अलगाव की अनुमति के इस रेखा के साथ अलग किया जा सकता है। माइक्रो-विच्छेदन दैनिक OAZ और CMZ की, दिन 1 (डी 1) से - दिन 3 (डी 3) FAK सक्रियण में माइग्रेशन-विशिष्ट परिवर्तन घाव की मरम्मत के क्षेत्र में पाए जाते हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए किया गया था। प्रत्येक क्षेत्र से lysates FAK सक्रियण के लिए या तो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (pFAK Y39 द्वारा जांच की गई7) या कुल FAK अभिव्यक्ति (सी)। कुल FAK स्तर में थोड़ा परिवर्तन मनाया गया, वहीं FAK सक्रियण में वृद्धि प्रवास-विशिष्ट CMZ क्षेत्र (सी) के साथ जुड़े थे।
वीडियो 1. पूर्व vivo नकली मोतियाबिंद सर्जरी मॉडल में घाव भरने की चोट के बाद घाव क्षेत्र के केन्द्र से देखा जाता है दिन 3. घाव बंद करने के लिए के माध्यम से समय 0 से समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया जाता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
- Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
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