Introduction
La clinicamente rilevante, la chirurgia della cataratta finto, ex vivo epiteliale modello guarigione delle ferite qui descritto è stato sviluppato per fornire uno strumento per indagare i meccanismi che regolano la riparazione dei tessuti epiteliali in risposta ad un infortunio. Le caratteristiche principali che sono state finalizzate per nella creazione di questo modello inclusi 1) creare condizioni che strettamente replicato la risposta in vivo a ferire in un ambiente culturale, 2) la facilità di modulare gli elementi regolatori di riparazione, e 3) capacità di immagine il processo di riparazione, nella sua interezza, in tempo reale. La sfida, quindi, è stato quello di creare un modello di cultura in cui è stato possibile studiare e manipolare, riparazione della ferita epiteliale in microambiente nativo delle cellule. La disponibilità di questo modello ferita riparazione apre nuove possibilità per individuare gli spunti di segnalazione endogeni di matrice proteine, citochine e chemochine che regolano il processo di riparazione. Inoltre, il modello è ideale per l'esame come unn epitelio è in grado di muoversi come un foglio collettivo per ri-epithelialize della ferita 2,3, e per la determinazione della stirpe di cellule mesenchimali capo sul bordo della ferita che funzionano nel dirigere la migrazione collettiva dell'epitelio feriti 4. Questo modello offre anche una piattaforma con cui identificare terapie che potrebbero promuovere efficace la guarigione delle ferite e prevenire ferita aberrante riparazione 5.
Ci sono già un certo numero di modelli disponibili ferita riparazione, sia nella cultura e in vivo, che hanno fornito la maggior parte di ciò che si conosce il processo di riparazione delle ferite oggi. In modelli animali di lesioni, come cornea 6-12 e 13-17 della pelle, vi è la possibilità di studiare la risposta del tessuto al ferimento nel contesto di tutti i mediatori riparazione che potrebbero essere coinvolti nel processo, compresi i contributi dal vascolarizzazione e del sistema nervoso. Tuttavia, vi sono limitazioni per manipolare il expericondizioni mentali in vivo, e non è ancora possibile condurre studi di imaging della risposta di riparazione in vivo, continuamente nel tempo. Al contrario, la maggior parte dei modelli di coltura in vitro ferita riparazione, come la ferita graffiatura, possono essere facilmente manipolati e seguiti nel tempo ma mancano contesto ambientale di studiare guarigione delle ferite nel tessuto in vivo. Mentre ex vivo modelli offrono il vantaggio di studiare il processo di riparazione pregiudizio continua nel tempo nel contesto del microambiente delle cellule associata alla capacità di modulare i regolatori molecolari di riparazione in qualsiasi punto di tempo nel processo, ci sono alcuni modelli che si adattano questi parametri.
Qui è descritto una procedura per generare altamente riproducibile ex vivo epiteliali guarigione della ferita culture che riproducono la risposta di un tessuto epiteliale di un ferimento fisiologico. Utilizzando la lente pulcino embrione come fonte di tessuto, un ex vivo mocviene eseguita la chirurgia della cataratta k. L'obiettivo è un tessuto ideale da utilizzare per questi studi dal momento che è indipendente all'interno di una spessa capsula membrana basale, avascolare, non è innervato, e priva di qualsiasi stroma associato 18,19. Nella malattia umana, chirurgia della cataratta Indirizzi perdita della vista a causa opacizzazione della lente, e comporta la rimozione della massa cellulare fibre lente, che comprende la maggior parte della lente. Dopo visione chirurgia della cataratta viene ripristinata mediante l'inserimento di una lente intraoculare artificiale. La procedura di chirurgia della cataratta, attraverso la rimozione di cellule di fibre, induce una risposta lesioni nell'epitelio lente adiacente, che risponde riepitelizzazione dell'area posteriore della capsula del cristallino che era stato occupato dalle cellule della fibra. Nella chirurgia della cataratta, come nella maggior parte delle risposte di riparazione della ferita, si verifica talvolta un esito fibrotico aberrante risposta guarigione della ferita, associata alla comparsa di miofibroblasti, che nella lente è noto come posteriore capsule opacizzazione 20-22. Per generare il modello guarigione delle ferite chirurgia della cataratta, una procedura di chirurgia della cataratta è imitato in lenti rimosso dall'occhio pulcino embrione per produrre una lesione fisiologica. Rimozione microchirurgica delle fibre lente risultati cellule in una ferita circolare molto consistente circondata dalle cellule epiteliali lente. Questa popolazione di cellule rimane fermamente attaccata alla membrana capsula del cristallino seminterrato ed è ferito dalla procedura chirurgica. Le cellule epiteliali migrano sulla zona dissodata della membrana basale endogena per guarire la ferita, guidata da una popolazione di cellule mesenchimali ricche di vimentina noti nel processo di riparazione come cellule capo 1. Con questo modello la risposta di un epitelio di lesione può essere facilmente visualizzata e seguita con il tempo nel contesto del microambiente delle cellule. Le cellule sono facilmente accessibili per le modifiche dell'espressione o l'attivazione di molecole che dovrebbero svolgere un ruolo nella riparazione delle ferite. Una potente funzione di thè il modello è la capacità di isolare e studiare i cambiamenti specifici di migrazione nel quadro di guarigione della ferita. La capacità di preparare un gran numero di ex vivo cicatrizzanti culture abbinati invecchiato per studi è un altro vantaggio di questo modello. Così, questo modello di sistema offre l'opportunità unica di prendere in giro a parte i meccanismi di riparazione delle ferite e terapie di prova per il loro effetto sul processo di guarigione delle ferite. Il finto modello ex vivo chirurgia della cataratta dovrebbe avere ampia applicabilità, fornendo una risorsa fondamentale per lo studio dei meccanismi di riparazione del pregiudizio.
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Protocol
Il seguente protocollo è conforme alle Istituzionale Animal Care and Use Committee linee guida Thomas Jefferson University e con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Vision Research.
1. Configurazione e preparazione di lenti per la Cultura Ex Vivo Wound
- Mettere tre 100 piatti mm Petri in una, cappa a flusso laminare sterile. Riempire due dei piatti petri metà con tampone Tris / destrosio (buffer TD; 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-glucosio, 8,25 mM Tris Base, pH a 7,4 con HCl) a RT , lasciando il terzo vuoto. Terreni di coltura pre-caldo (Media 199 integrato con, 1% di L-glutamina e 1% di penicillina / streptomicina) a 37 ° C.
Nota: La ferita norma di guarigione di coltura è senza siero, come avviene in vivo; tuttavia, le culture ferita di riparazione possono essere coltivate con successo in condizioni di media definiti che includono siero o altri fattori. - Rimuovere fertile d embrionaleay 15 bianco Livorno pulcino uovo da incubatrice (tenutasi a 37,7 ° C, con dolce dondolio)
- Inserire uovo selezionato nella cappa a flusso laminare e pulita all'esterno della scocca con etanolo al 70% da una bottiglia di lavaggio. Condurre tutte le procedure qui di seguito, in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare, con soluzioni e strumenti sterili.
- Crack uova e posizionare il contenuto in 100 millimetri Petri vuota. Decapitare embrione con pinze standard e forbici sottili. Mettere la testa pulcino embrione in una capsula di Petri contenente tampone TD e smaltire il resto dell'embrione. Opzionalmente evitare che le testine di embrione di pollo in tampone TD per un breve periodo di tempo, non più di 15 min.
- Mettere la testa embrionali di pollo su un coperchio capsula di Petri. Utilizzando pinze alta precisione, rimuovere l'obiettivo insieme al suo vitreo allegata dall'occhio nella seguente sequenza. Pizzicare la parte posteriore dell'occhio con la pinza per creare una piccola apertura nella parte posteriore dell'occhio.
- Quindi, cogliere l'umore vitreo wesimo pinze e tirare delicatamente il vitreo, con un moto di rollio, il vitreo con l'obiettivo montato saranno sloggiati dall'occhio. Luogo obiettivo / vitreo nella capsula di Petri rimanente contenente tampone TD. Lasciare le lenti di rimanere in tampone TD per non più di 30 minuti.
- Spostare la lente per un nuovo coperchio Petri sotto un microscopio da dissezione. Da questo punto in poi eseguire tutti i passaggi sotto un microscopio da dissezione. Con pinze ad alta precisione lavarsi attentamente tutta corpo ciliare (cellule pigmentate) che sono stati sloggiato con la lente utilizzando il bordo della pinza, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto dell'obiettivo.
Nota: Rimozione del corpo ciliare assicura che i tipi di cellule che non sono endogeni alla lente non sono inclusi nella cultura riparazione della ferita. - Separare l'obiettivo dalla vitreo con una pinza ad alta precisione pizzicando fuori dal corpo vitreo dalla sua associazione con la capsula posteriore.
- Usando l'alta precisione Pinza trasferire l'obiettivo in una piccola gocciadi tampone TD (circa 200 ml) in un piatto di coltura di tessuti 35 mm.
2. Esecuzione Mock chirurgia della cataratta
- Orientare la lente nella goccia di tampone TD nel piatto da 35 mm, con la faccia anteriore della lente rivolta verso l'alto.
Nota: Il anteriore della lente è facilmente identificabile dalla presenza di un anello denso nel tessuto che rileva il confine tra anteriore e regione equatoriale dell'epitelio lente. Al contrario, vi è una mancanza di marcature sul posteriore della capsula del cristallino a cui le cellule di fibre lente sono allegati. - Utilizzando due pinze alta precisione fanno una piccola incisione (circa 850μm) al centro della capsula anteriore della lente, la membrana basale spessa che circonda il tessuto dell'obiettivo, e la sua associata epitelio della lente anteriore, afferrando il tessuto con una pinza in ogni mano e tirando delicatamente in direzioni opposte.
- Rimuovere la massa cellulare fibra, che costituisce la maggior parte del tessuto dell'obiettivo, dislodging dai suoi allegati al epitelio lente e circostante capsula del cristallino da idro-eluizione (un approccio utilizzato nella chirurgia della cataratta classico, modellato in Figura 1A).
- Riempire una siringa da 1 ml con una punta dell'ago 27,5 G con 300 ml di tampone TD. Inserire la punta dell'ago nella incisione fatta nella capsula anteriore del cristallino, e circa a metà strada nella lente.
- Deprimere delicatamente la siringa per iniettare il buffer di TD nella massa cellulare fibra lente. Iniettare fra 50 e 200 microlitri TD, e mai più di 300 microlitri. Osservare la massa cellulare fibra stessa allentando dalla capsula epitelio e la lente.
- Utilizzando pinze ad alta precisione, rimuovere la massa cellulare fibra allentato dalla lente attraverso il sito di incisione anteriore.
Nota: Questa procedura lascia il posteriore della lente membrana basale capsula per cui le cellule della fibra erano stati allegati denudati delle cellule, e di un epitelio lente infortunato proprio adiacente a questo sito.
3. Preparing dell'obiettivo Ferito per Ex Cultura Vivo
- Appiattire il sacco capsulare obiettivo che risulta dalla chirurgia della cataratta sopra descritto sul piatto di coltura, lato della cella su, facendo cinque tagli nella faccia anteriore del sacco capsulare.
- Tagliare perpendicolare al sito di incisione originale attraverso all'equatore della lente. Appiattire le risultanti cinque "sportelli" di capsula del cristallino con epitelio attaccato sul lato cultura piatto capsula giù, cellula verso l'alto. Nota la lente ex vivo ferito ora dovrebbe assumere una stella o una forma a fiori (vedi Figura 1B).
- Per fissare la capsula al piatto, premere dolcemente con le pinze in ogni punto della stella. Questo farà una piccola rientranza a cinque punte più esterne del espianto e il risultato in attacco sostenuto al piatto.
Nota: È possibile danneggiare la capsula durante questa procedura e quindi è importante garantire la capsula al piatto più vicino alle punte del flaps possibile, così da rendere il minor numero di punti di fissaggio come possibile (in genere due, massimo di tre per falda). - Rimuovere il buffer TD dal piatto 35mm e sostituirlo con 1,5 ml di mezzi di pre-riscaldato. Coprire il piatto 35 millimetri con il suo coperchio e posto in incubatrice (37 ° C, 5% di CO 2).
4. Separazione della centrale migrazione Zone (CMZ), dove riepitelizzazione dell'Area ferito della capsula posteriore si verifica, dal Attachment Originale della Zona (OAZ) delle cellule epiteliali lente, per l'analisi quantitativa.
Nota: le cellule iniziano a muoversi nella regione CMZ immediatamente in risposta al danno. Di giorno una cultura abbastanza cellule migrano attraverso la CMZ per l'analisi molecolare e biochimica, dopo la separazione della CMZ e la OAZ da micro-dissezione 23. Questo protocollo comporta la rimozione di un lembo (OAZ) alla volta dalla zona ferita della capsula.
- Osservare una demarcatione, chiaramente visibili al microscopio da dissezione, tra OAZ e CMZ (vedi Figura 2A). Utilizzando due pinze alta precisione, afferrare con entrambe le pinze a bordo della linea OAZ / CMZ, quella appena adiacente all'altra, su entrambi i lati della linea (vedere la Figura 2A, B, freccia).
- Usando una mano / una pinza sul lato CMZ continuano a tenere su la cultura feriti, mentre con l'altra mano / pinza, tirare delicatamente il OAZ lungo la linea OAZ / CMZ. La CMZ separa facilmente dalla OAZ lungo questa linea. Continuare lungo questa linea intorno all'intera cultura finché le due regioni sono completamente separati.
- Studiare i separati OAZ e CMZ frazioni per l'analisi molecolare, come 24 o biochimica analisi di RNA-Seq quali Western Blot o co-immunoprecipitazione 23,25.
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Representative Results
Ex Vivo Modello creato per studiare il processo di guarigione delle ferite nei microambiente nativo le cellule '
Per studiare i meccanismi coinvolti nella regolazione guarigione delle ferite di un epitelio all'interno microambiente nativo delle cellule, un clinicamente rilevante ex vivo finto modello chirurgia della cataratta è stato creato. Questo modello è stato creato da tessuto lente che offre molti vantaggi per le sue proprietà intrinseche: 1) l'obiettivo è un organo indipendente, circondato da una membrana basale spessa chiamata capsula del cristallino; 2) è avascolare, 3) non innervato e 4) senza stroma associato. Pertanto, il processo di riparazione esaminato è limitato alle cellule che sono innate alla lente corretta. Per creare questo modello, le lenti vengono rimosse da un embrionale (E) giorno 15 embrione di pollo (Figura 1A). Una piccola incisione viene fatta nella capsula anteriore del cristallino e le sue cellule epiteliali lente associati attraverso cui la massa cellulare fibra obiettivo viene rimossoda idro-eluizione, una procedura di cataratta classico che crea un ferimento fisiologicamente rilevanti (Figura 1A). L'epitelio lente, che è presente come un monostrato continuo di cellule lungo anteriore e aspetti equatoriali della capsula del cristallino che circonda la massa cellulare fibra, e la sua popolazione endogena di ricco-vimentina progenitori riparazione mesenchimali 1, rimangono nella lente durante la estrazione di cellule fibra (Figura 1A). Dopo la rimozione della massa cellulare fibra, cinque tagli sono fatti nella faccia anteriore della capsula del cristallino e l'epitelio appiattito cellulare rivolta verso l'alto, di fronte al mezzo. Questa procedura permette l'imaging della risposta dell'epitelio feriti da vari approcci microscopici, tra microscopia time-lapse (Video 1). Questi tagli addizionali nella capsula anteriore del cristallino creano un espianto stella-forma della lente feriti con la ferita circolare creato rimuovendo la massa cellulare fibra nel center del trapianto (Figura 1B). Chirurgia post-cataratta e appiattimento del tessuto, l'epitelio feriti si trova nei punti della stella, che è definito come l'allegato originale Zone (OAZ) (Figura 1A, B).
La rimozione delle cellule della massa di fibra dal suo sito di attacco sulla capsula posteriore crea una ferita altamente riproducibili sulla membrana basale, circondato da epitelio feriti (Figura 1B, C). Il bordo esposto della lente equatoriale dell'epitelio, adiacente al quale erano attaccate le cellule della fibra, è il bordo della ferita. Subito dopo una lesione, una sottopopolazione di cellule mesenchimali riparazione ricco-vimentina si attiva e migra verso il bordo della ferita dell'epitelio 1. L'epitelio lente, con queste cellule mesenchimali di riparazione al loro bordo superiore, si sposta rapidamente sulla regione libera-cella del b endogenaasement capsula membrana, la migrazione Zona Media (CMZ), per iniziare la guarigione della ferita. Cellule epiteliali lente si muovono insieme, come un lenzuolo, nella CMZ guidata da cellule mesenchimali capo 1, che si estendono sporgenze lungo il substrato e per il processo di guarigione delle ferite (F IGURA 1D, Video 1). La guarigione delle ferite progredisce, coprendo una significativa area della ferita (67%) per giorno 1 in coltura (Figura 1C), ed è di solito completata entro 3 giorni di coltura (Figura 1B, C).
Una distinzione chiara fisico può essere fatta tra le regioni OAZ e CMZ fin dal giorno 1, che è delimitata da una piega o ruga tra queste due zone (Figura 2A, la freccia). Questo fenomeno offre una linea guida con cui separare queste aree a qualsiasi momento durante il processo di guarigione delle ferite. Utilizzando una pinza sottile a punta, le culture possono essere micro-sezionati per Separmangiato le regioni OAZ e CMZ per analizzare le differenze molecolari tra queste zone distinte (Figura 2b). Questo è un approccio potente che è stato utilizzato per identificare le modifiche specifiche migrazione associati ferita riparazione. In precedenza, si è constatato che vi è un aumento in Focal Adhesion Kinase (FAK) attivazione nelle colture ex vivo feriti durante la ferita processo 5 guarigione. FAK ha un ruolo consolidato nella migrazione delle cellule 26-29. La possibilità di arricchire per la OAZ vs. CMZ ora ha permesso di valutare se questo aumento di attivazione FAK è specifico per la regione CMZ specifica per la migrazione. Per questo studio, le regioni OAZ e CMZ sono stati separati al giorno 1 - 3 (in tutto il processo di guarigione delle ferite) e analizzati per i cambiamenti biochimici nel FAK attivazione (FAK pY397). I risultati hanno dimostrato che l'aumento di attivazione FAK è stata associata con la regione specifica per la migrazione CMZ (Figura 2C). Ilex vivo modello di sistema qui descritto offre un'opportunità unica e preziosa in cui studiare i programmi molecolari coinvolti nel coordinare il processo di riparazione delle ferite.
Figura 1. Creazione di un modello ex vivo in cui studiare il processo di cicatrizzazione all'interno microambiente nativa delle cellule in risposta ad una ferita fisiologica. Chirurgia della cataratta Mock è stata effettuata su lenti pulcino E15. La massa cellulare fibre lente (bianco) viene rimosso attraverso un'incisione nella capsula anteriore da idro-eluizione. Questo processo lascia dietro cellule epiteliali (verdi) che rimangono strettamente aderente alla capsula del cristallino e una membrana basale cell-denudato (BM) su cui le cellule migreranno a guarire la ferita (A). Cinque i tagli sono fatti per l'epitelio ad appiattirsi e creare una star di culto a forma di ex vivo ure (B). Le cellule epiteliali lente residue che riempiono le punte della stella sono indicati come l'allegato originale Zone (OAZ) (A, B). La BM denudato su cui le cellule migrano si riferisce a come la migrazione Zona Media (CMZ) (A, B). Immediatamente in risposta al danno, le cellule cominciano a muoversi nella regione CMZ sul BM cellule spoglia (B). L'area ferita aperta è quantificato nel tempo (C). La guarigione delle ferite è in genere completata da D3 nella cultura (B, C). A (B, C) T0 indica il tempo di ferimento, D1-3 denota giorni 1-3. All'interno della CMZ, due popolazioni di cellule possono essere distinti, le cellule epiteliali lente e le cellule mesenchimali che localizzano capo al bordo della ferita, estendentisi sporgenze lungo il substrato (D). Questa cifra è ristampato da Menko et al 23.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Separazione delle regioni OAZ e CMZ identificare modifiche specifiche migrazione connessi con la guarigione della ferita. Di giorno 1, le regioni OAZ e CMZ possono essere distinti l'uno dall'altro da una piega (freccia), che può essere utilizzato come guida per separare queste zone (A). A questo piega, pinza sottile a punta possono essere utilizzati per afferrare il bordo della linea OAZ / CMZ. La cultura può essere separato lungo questa linea che consente l'isolamento delle regioni OAZ e CMZ (B). Micro-dissezione del OAZ e CMZ quotidiano, dal giorno 1 (D1) - giorno 3 (D3) è stato eseguito per determinare se i cambiamenti specifici di migrazione in attivazione FAK si verificano nella regione di riparazione delle ferite. Lisati di ogni regione sono stati esaminati mediante analisi Western Blot sia per l'attivazione FAK (pFAK Y397) o totale espressione FAK (C). Mentre è stato osservato pochi cambiamenti nei livelli di FAK totale, un aumento di attivazione FAK è stato associato con la regione CMZ specifica per la migrazione (C).
Video 1. Ferita guarigione nella finto modello ex vivo intervento di cataratta è seguita da microscopia time-lapse da tempo 0 dopo l'infortunio fino al giorno 3. la chiusura della ferita è visto dal centro della zona ferita.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
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