Protocol
1. הכנת תרבות מדיה, אנטיביוטיקה, ו2- [2-ניטרו-4 (trifluoromethyl) נזואיל] -1,3-cyclohexanedione (טיפול עם NTBC)
- הפוך מרק LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl בH 2 O) וaliquot לתוך כרכים מתאימים. לעקר על ידי החיטוי. לאחסן בטמפרטורת חדר.
- הפוך 100 מיליליטר אגר LB (tryptone 1%, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl, אגר 1.5% בH 2 O) ב 250 מיליליטר צלוחיות. לעקר על ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת חדר. ודא שאגר הוא נמס לפני המזיגה לצלחות.
הערה: צלוחיות המכילות אגר LB 100 מיליליטר יניב 4 צלחות. הסכום של אגר LB ניתן לשנות למתאים למספר הצלחות הדרושות עבור assay. - הפוך PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 2 מ"מ KH 2 PO 4) 16. לעקר על ידי החיטוי או סינון ולאחסן בטמפרטורת חדר.
- הכן את פתרונות מניות האנטיביוטיקה לגנטמיצין, kanamycin,tobramycin ד.
- הכן ריכוזי המניה אנטיביוטיים מתאימים לפ זני aeruginosa המכילים 100 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין, 30 מ"ג / מיליליטר kanamycin, ו -10 מ"ג / מיליליטר tobramycin. ממיסים את האנטיביוטיקה במים, סנן לעקר (0.2 מיקרומטר), וחנות על 4 מעלות צלזיוס. לשנות את האנטיביוטיקה וריכוזים בהתאם לחיידק למד.
- הכן את פתרונות מניות הטיפול עם NTBC. ממיסים 10 מ"ג בטיפול עם NTBC ב400 μl של DMSO. זה מניב ריכוז של 75.9 מ"מ טיפול עם NTBC. פתרונות מניות טיפול עם NTBC חנות ב -20 ° C. פתרונות הפשרה בטמפרטורת חדר כנדרש.
יש מקורות שונים בטיפול עם NTBC הבדלים במסיסות: הערה. לקבוע את הרכב המתאים שבי לפזר את הטיפול עם NTBC מבוסס על המלצות היצרן ולהתאים שלב 1.5 בהתאם.
2. טיפול עם NTBC titrations של זני חיידקים
- תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק. הוסף 2 מבחנת מרק 16 x 150 מ"מ מיליליטר LBים (אחד לכל זן) ולחסן עם 1 מושבה מבודדת מכל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור על הכתף תרבית רקמה בחממת אוויר.
- למחרת, להכין titrations בטיפול עם NTBC במרק LB. השתמש במגוון ראשוני 0-900 מיקרומטר טיפול עם NTBC מאז יש לי זנים שונים הבדלים ברגישות לטיפול עם NTBC.
- הוסף 1 מיליליטר מרק LB ל4 עד 5 מבחנות (16 x 150 מ"מ) לכל זן.
- מוסיף את פתרון הטיפול עם NTBC המניות (75.9 מ"מ) למבחנות (16 x 150 מ"מ) בטווח של ריכוזים. ראה טבלת 1 לריכוזי טיפול עם NTBC וכרכי המניה מקביל להוסיף 1 מיליליטר של מרק LB.
- מדוד את OD 600 של תרבויות הלילה. לשטוף תרבויות לפני נטילת OD 600 קריאות לחיסול pyomelanin נוכחי בתקשורת.
- שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant וכל תאים באופן רופף טבליות עםmicropipettor וresuspend תא גלולה המוצק ביטראות 1 מיליליטר
- לחסן צינורות טיטרציה בOD 600 0.05. לחשב את הסכום של תרבות שטפה הדרוש כדי לחסן את הצינורות.
הערה: השתמש בתרבויות נשטפו לחיסונים מאז pyomelanin לא צריך להיות נוכח. - דגירה צינורות טיטרציה לכ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
- לצלם את צינורות טיטרציה ולהשוות ייצור פיגמנט בתוך ובין הזנים לקבוע את הסכום בטיפול עם NTBC להשתמש עבור מבחני MIC וסטרס חמצונים. השתמש OD 600 קריאות על מנת לקבוע את הסכום של pyomelanin בsupernatant התרבות החופשי תא ולקבוע צפיפות תאים.
הערה: OD 600 היחס של pyomelanin בsupernatant התרבות לתאים ניתן לחשב לכמת הבדלים בייצור pyomelanin לאחר טיפול בטיפול עם NTBC.
3. אנטיביוטיקה מינימאלית מעצוריםריכוז Assay הטורים (MIC) בצלחות 96-היטב
- תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC.
הערה: פרוטוקול זה מתואר באמצעות רמת הנציג של 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC. הרמה המתאימה של טיפול עם NTBC לשמש נקבעה בשלב 2.6.- להוסיף 300 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר ליטראות הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB למצב לא טיפול עם NTBC.
- שימוש בקיסמי סטרילי, לחסן צינורות עם מושבה מבודדת אחד של חיידקים. יהיה תרבות אחת עם טיפול עם NTBC ותרבות אחת ללא טיפול עם NTBC עבור כל זן. דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה בחממת אוויר.
- למחרת, להפוך את LB + טיפול עם NTBC ופתרונות אדון LB + DMSO להקמת assay MIC. להוסיף טיפול עם NTBC בריכוז של 600 מיקרומטר כזה יהיה מדולל שני פי כאשר הבידוד נוסף, מניב ריכוז סופי של 300 מיקרומטר.
- כדי לבדוק antibi אחדotic לזן אחד, להוסיף 600 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך את פתרון אדון הטיפול עם NTBC. הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך אין פתרון אדון טיפול עם NTBC. השתמש בפתרונות אלה ליצירת פתרונות מניות אנטיביוטיות, כמו גם להקמת סדרת הדילול ב96-גם צלחות.
הערה: הניסוחים פתרון האדון יניבו פתרון נוסף כדי להסביר שגיאות pipetting. ניתן לשנות את פתרונות שהאדון למעלה או למטה, כנדרש בהתאם למספר של אנטיביוטיקה וזנים שנבדק.
- כדי לבדוק antibi אחדotic לזן אחד, להוסיף 600 מיקרומטר טיפול עם NTBC 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך את פתרון אדון הטיפול עם NTBC. הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) 2 מיליליטר LB ולערבב כדי להפוך אין פתרון אדון טיפול עם NTBC. השתמש בפתרונות אלה ליצירת פתרונות מניות אנטיביוטיות, כמו גם להקמת סדרת הדילול ב96-גם צלחות.
- הכן את הפתרונות אנטיביוטיים בפתרונות אדון LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
הערה: ריכוז האנטיביוטיקה בפתרונות אלה צריך להיות כפולים הריכוז הרצוי הסופי. פתרון מספיק צריך להיעשות כדי להעביר 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב.- הכן גנטמיצין +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 64 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.288 μl של מניית גנטמיצין (100 מ"ג / מיליליטר) עד 450μl LB + טיפול עם NTBC או פתרון אדון LB + DMSO.
הערה: הריכוז המרבי של גנטמיצין לפ aeruginosa PAO1 הוא 32 מיקרוגרם / מיליליטר. - הפוך kanamycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 256 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 3.84 μl של מניית kanamycin (30 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
הערה: הריכוז המרבי של kanamycin לפ aeruginosa PAO1 הוא 128 מיקרוגרם / מיליליטר. - הכן tobramycin +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 8 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.36 μl של מניית tobramycin (10 מ"ג / מיליליטר) לפתרונות אדון 450 μl LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
הערה: לפ aeruginosa PAO1, את הריכוז המרבי של tobramycin הוא 4 מיקרוגרם / מיליליטר.
הערה: ניתן להתאים האנטיביוטיקה והריכוזים לחיידקים להיבדק.
- הכן גנטמיצין +/- פתרון מניות בטיפול עם NTBC 64 מיקרוגרם / מיליליטר. כדי להפוך את הפתרון הזה, להוסיף 0.288 μl של מניית גנטמיצין (100 מ"ג / מיליליטר) עד 450μl LB + טיפול עם NTBC או פתרון אדון LB + DMSO.
- להוסיף לכל פתרון אנטיביוטי 2x 100 μl לארבע בארות בצלחת 96-היטב. מניחים את הפתרונים הללו בא השורה לexamplדואר, גנטמיצין צריך להיות ממוקם בA1 דרך A4, kanamycin צריך להיות ממוקם בA5 דרך A8, וtobramycin צריך להיות ממוקם בA9 דרך A12. ראה איור 1 א לתרשים של צלחת 96-היטב להגדיר.
הערה: ניתן לבדוק אנטיביוטיקה מרובה בצלחת אחת, אבל רק אחת מתח צריך להיבדק לכל צלחת לחסל את הפוטנציאל לזיהום צולב מזנים אחרים. - הוסף 50 μl של פתרון אדון LB + הטיפול עם NTBC או LB + DMSO לשורות 'עד ח' לצלחת 96-היטב. ודא שצלחת אחת הוא LB + טיפול עם NTBC וצלחת אחת היא LB + DMSO. ראה איור 1 א.
- השתמש LB + טיפול עם NTBC לאנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC. השתמש LB + DMSO לאנטיביוטיקה בLB + DMSO.
- שימוש micropipettor לבצע שני דילולים סדרתי של פי האנטיביוטיקה על ידי העברת 50 μl של הפתרון משורה לשורה ב מערבבים את הפתרון, לשנות את הטיפים pipet, ולהעביר 50 μl של הפתרון מהשורה B לחתור חזור ג ל remainiשורות ng. לאחר דילול השורה G, להסיר 50 μl של הפתרון שמהשורה ופסולה. השתמש H שורה כמו אין שליטת אנטיביוטיקה להתפתחות חיידקים. ראה איור 1.
הערה: כל גם בשורות באמצעות G מכילה כעת 50 μl של אנטיביוטיקה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ב2X הריכוז הרצוי הסופי. שורת H מכיל LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה. - מדוד את OD 600 של תרבויות הלילה. לשטוף את כל התרבויות לפני נטילת OD 600 קריאות לחיסול pyomelanin הנוכחי בתקשורת.
- שטוף את התרבויות על ידי צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות בmicrocentrifuge ב16,000 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant עם micropipettor וresuspend התא גלולה ביטראות 1 מיליליטר
- לדלל את תרבויות הלילה ל2.75x10 5 / מיליליטר CFU ביטראות
הערה: תניח שיחידה אחת OD 600 היא המקבילה של 1x10 9 CFU / ml לפ aeruginosa. OD לCFU / המרות מיליליטר ניתן הייתifferent בחיידקים אחרים. - הוסף 50 μl של תרבות חיידקים בדילול ולמתאים.
הערה: תרבויות גדלו בטיפול עם NTBC יש להוסיף לבארות המכילות טיפול עם NTBC ותרבויות גדלו בDMSO יש להוסיף לבארות המכילות DMSO. ראה איור 1.- להוסיף חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסף 50 μl של LB ולרביעי לפעול כביקורת לזיהום חיידקים. ראה איור 1.
- השתמש micropipettor רב-ערוצים לחסן את הבארות. ודא שpipet טיפים הם קרובים לתחתית של הבארות בעת הוספת הבידוד על מנת למנוע זיהום של בארות הסמוכות.
הערה: הוספת תרבית חיידקים לבארות יהיה לדלל את ריכוזי אנטיביוטיקה וטיפול עם NTBC שני קיפול.
- מכסה את 96-גם הצלחות עם parafilm ודגירה כ 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. דגירה 96-גם צלחות באופן סטטי, בחממת אוויר.
- בדוקהצלחות להתפתחות חיידקים בבארות. MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבאין צמיחת חיידקים נתפסת לכל שלושת משכפל של כל זן.
- מבחינה ויזואלית לבחון את הצלחת לצמיחה או לקרוא באמצעות קורא צלחת קבוצה לOD 600.
Assay פלייט 4. ספוט לתגובה לחץ חמצוני
- תרבויות לילה הוקמו של הזנים להיבדק בLB עם ובלי טיפול עם NTBC כמתואר בשלב 3.1.
- למחרת, להכין צלחות אגר LB המכילות H 2 O 2 כלחץ חמצוני. מגוון של H 2 O 2 ריכוזים 0-1 מ"מ הוא נקודת התחלה טובה.
- ממסים את צלוחיות אגר LB. תקשורת מגניב כ 50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת חדר.
- להוסיף H 2 O 2 ישירות לתקשורת מקוררת בריכוזים הרצויים. צלוחיות מערבולת לערבב. ראה טבלה 2 לריכוזים של H 2 O 2וכרכים של H 2 O 2 המרוכז להוסיף. ערכים אלה מבוססים על של אגר LB 100 מיליליטר.
- יוצקים צלחות מייד לאחר הוספת H 2 O 2 ולהבת פני השטח כדי להסיר בועות. התשואה היא 4 צלחות לשל אגר LB 100 מיליליטר. סמן את הצלחות עם ריכוז H 2 O 2.
- מקם את הצלחות שנחשפו בזרימה מכסה המנוע ביולוגי עם המאוורר פועל למשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות.
הערה: השתמש בצלחות באותו היום הם מוכנים. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לנתונים לא עקביים.
הערה: לחץ חמצוני כגון paraquat ניתן להחליף לH 2 O 2 בassay זה. הריכוזים המשמשים לגורמי דחק חמצוני אחרים עשויים להיות שונים מאלה ששימשו לH 2 O 2.
- לשטוף ולמדוד את OD 600 של תרבויות הלילה כמתואר בשלב 3.7.
- לנרמל את OD 600 של כל מ"ק הלילהltures לערך הנמוך ביותר לקבוצה של זנים שנבדק. פ aeruginosa בדרך כלל יש OD 600 של כ 2.5 כאשר גדלו הלילה בLB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO.
- לקבוע את עוצמת הקול של התרבות צריכה לדלל את התרבות לOD הנמוך ביותר 600 בהיקף כולל של 1 מיליליטר. לדוגמא, אם יש תרבות OD 600 של 3 וOD הנמוך ביותר 600 לקבוצה של זנים הוא 2.5, לבצע את החישוב הבא: (2.5) (1 מיליליטר) = (3) (x). x = .833 מיליליטר. .833 מיליליטר של התרבות יוצב בצינור microfuge.
- לחשב את הסכום של LB + טיפול עם NTBC (300 מיקרומטר) או LB + DMSO צריך להביא את תרבות נפח 1 מיליליטר. לדוגמא בשלב 4.4.1, הסכום של LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO הוסיף לתרבות יהיה .167 מיליליטר (1 מיליליטר נפח כולל - .833 מיליליטר תרבות). הפוך פתרונות מניות של LB + טיפול עם NTBC וLB + DMSO לשימוש עבור דילולים אלה בהתבסס על הנפח הדרוש לדילול כל הזנים.
- מערבבים את התרבות וLB + NTBC או LB + DMSO ידי vortexing.
- כדי לשמור על תרבויות בריכוז קבוע בטיפול עם NTBC או DMSO, לבצע עשרה דילולים סדרתי של פי תרבויות הלילה המנורמלת בPBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO.
- הפוך פתרונות מניות של PBS + טיפול עם NTBC וPBS + DMSO. לקבוצה אחת של דילולים לזן אחד, לערבב טיפול עם NTBC מיקרומטר 300 או נפח שווה של DMSO עם PBS להניב בנפח כולל של 720 μl. קנה מידה של מניות אלה למעלה או למטה, תלוי כמה זנים נבדקים.
- צינורות microfuge תווית עבור 10 -1 בדילולים 10 -7 סידוריים. להוסיף 90 μl של PBS + טיפול עם NTBC או PBS + DMSO לצינורות המתאימים. השתמש PBS + טיפול עם NTBC לזנים גדלו בLB + טיפול עם NTBC ולהשתמש PBS + DMSO לזנים גדלו בLB + DMSO.
- הוסף 10 μl של תרבות לצינור הדילול המתאים 10 -1. מערבבים על ידי vortexing ולהעביר 10 μl של דילול 10 -1 לצינור דילול 10 -2. חזור על פעולה עד כל דילולים היו performed. לשנות טיפים pipet בין דילולים.
- 5 μl ספוט של 10 -3 דרך 10 -7 דילולים על 2 O 2 צלחות LB + H בשני עותקים עבור כל זן. השתמש בקצה pipet אחד אם כתמים הם מצופים מרוב לדלל לדלל לפחות (10 -7 עד 10 -3). לא להטות או להטות את הצלחת עד שהנוזלים התייבשו לתוך הצלחת.
- דגירה הצלחות במשך 24-48 שעות על 37 מעלות צלזיוס (חממת אוויר), בהתאם לזן.
הערה: פ aeruginosa PAO1 תהיה מושבות בגודל טובות על LB לאחר 24 שעות של דגירה. דגירה זנים עד שיש להם מושבות בערך באותו הגודל כמו PAO1. - לצלם את הצלחות באמצעות מצלמת CCD מעל transluminator. לחלופין, לערוך את התמונות לניגוד ויבול באותו הגודל. לספור את מספר המושבות בכל מקום כדי לקבוע שינויים ברגישות ללחץ חמצוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
titrations טיפול עם NTBC
Titrations הטיפול עם NTBC שימש כדי לקבוע אם הטיפול עם NTBC היה מסוגל להפחית את ייצור pyomelanin בפ aeruginosa, וגם לזהות את הריכוז בטיפול עם NTBC שמבטל או מקטין pyomelanin ייצור לשימוש במבחנים נוספים. ייתכנו שינויים ברמות של pyomelanin מיוצר בחזרות שונות, אבל מגמות כלליות יישארו קבועות. Assay טיטרציה הטיפול עם NTBC גם יכול להיות שונה כדי לבדוק את תרכובות אחרות שעשוי להשפיע על ייצור הפיגמנט בחיידקים אחרים. זה רק יעבוד, עם זאת, אם יש שינוי פנוטיפי שניתן לקבוע או לכמת מבחינה ויזואלית.
טיפול של זני pyomelanin ייצור של פ aeruginosa עם טיפול עם NTBC הביא לירידה תלויה מינון בייצור הפיגמנט 12. איור 2 מראה כי זנים שונים של פ יש לי aeruginosa הבדלים ברגישות לטיפול עם NTBC, כפי שצוין על ידי רמות של Pyoייצור מלנין. ריכוזים גבוהים יותר בטיפול עם NTBC נדרשו להפחית pyomelanin ייצור בPA1111 הקליני המבודד 17 (המתקבל מדארה פרנק) בהשוואה לזן המעבדה hmgA :: TN 18 (transposon PAO1 אוניברסיטת וושינגטון ספריית מוטציה). זנים שאינם מייצרים [PAO1 (המתקבל מקארי הארווד) וHPD :: TN 18 (ספריית המוטציה transposon PAO1 אוניברסיטת וושינגטון)] pyomelanin לא הראו שום שינוי בפיגמנטציה עם טיפול טיפול עם NTBC. החלטנו להשתמש בטיפול עם NTBC 300 מיקרומטר למבחנים שלנו, כי pyomelanin ייצור צומצם באופן משמעותי בhmgA זן מעבדה :: TN באמצעות ריכוז ש( השווה 300 מיקרומטר מיקרומטר לטיפול עם NTBC 0). כל הזנים המשמשים במחקר זה היו מאוחסנים ב -80 ° C בגליצרול 15%.
מיקרופוני אנטיביוטיקה
ניתן לבדוק מיקרופונים אנטיביוטיים באמצעות מספר שיטות שונות. שיטת צלחת microtiter המתוארת כאן תאפשר השימושr לבחון מגוון של ריכוזי אנטיביוטיקה ושימוש מינימאלי של משאבים. תוצאות משוכפלות בקלות וassay יכול להיות שונה כדי לאפשר להבדלים ברגישות לאנטיביוטיקה של האורגניזם להיבדק. וריאציה מסוימת ניתן לראות בין ניסויים בלתי תלויים, אך מגמות הן עקביות למדי. משכפל טכני צריך להפגין את אותה MIC.
טבלה 3 מציגה את התוצאות עבור פ שונה זני aeruginosa טופלו עם ובלי טיפול עם NTBC ואנטיביוטיקה aminoglycoside שונים. שלוש מושבות עצמאיות נבדקו בשלושה עותקים הבאים השיטה המתוארת. מיקרופונים נרשמו כריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שעכב התפתחות חיידקים בכל שלושת משכפל הטכני. היה לי טיפול טיפול עם NTBC אין כל השפעה על מיקרופוני aminoglycoside לזנים שנבדקו.
assay צלחת מקום סטרס החמצונים
Assay צלחת המקום לסטרס חמצוני בדיקות נותן reproduciblתוצאות דואר באמצעות רמות נמוכות יותר של H 2 O 2 מאלה ששימשו במבחנים אחרים. הצלחת ללא H 2 O 2 היא צלחת שליטה כדי לקבוע את רמת הדיוק של סדרת הדילול עבור כל זן, כמו גם לקבוע את גודל מושבה ומספר מושבות בכל מקום ללא חשיפת התאים לחמצוני לחץ. בסדרת דילול נכונה, הנקודה הסופית צריכה להיות מעט מאוד מושבות, ואילו במקום הראשון יהיה מספר אינספור של מושבות על H 2 O 2 תקשורת חופשית. לא צריך להיות הבדל של פי עשרה במספר המושבות בכל מקום בתוך סדרת דילול. לכל הזנים שנבדקו, מספר דומה של מושבות יש לראות באותו הדילול על 2 O 2 צלחת השליטה החופשית H.
כזנים שונים של חיידקים עשויים להיות רגישויות שונות ללחץ חמצוני, מגוון של H צריכים להיבדק 2 O 2 ריכוזים. הגדלת ריכוזים של H 2 O
איור 3 מראה assay צלחת מקום של זני pyomelanin ולא pyomelanin ייצור של פ aeruginosa טופל עם ובלי טיפול עם NTBC ונחשף לH 2 O 2 סטרס חמצונים מושרה. יש differe ברורNCE ברגישות ללחץ חמצוני כאשר pyomelanin ייצור חיידקי מטופלים בטיפול עם NTBC, וגם בין חיידקים שאינם מייצרים pyomelanin בהשוואה לאלו שעושים לייצר פיגמנט. זנים שלא לייצר pyomelanin, באופן טבעי או בשל טיפול טיפול עם NTBC, היו רגישים יותר לעקה חמצונית מאשר זנים שהופקו pyomelanin.
איור 1:. סכמטי של צלחת 96-היטב assay MIC אנטיביוטיקה להגדיר (א) לאנטיביוטיקת 2x של הריכוז הגבוה ביותר ההתחלה 100 μl נמצאים בשורות א 'שורה' עד ח מלאים 50 μl של שני LB + טיפול עם NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה. שני דילולים סדרתי של פי (ב ') מבוצעים בשורות עד G, וכתוצאה מכך 50 μl של אנטיביוטיקה בדילול מלאה בכל הטוב ב2x ריכוז רצוי הסופי. H השורה היא שליטה גם לבצמיחת acterial ללא אנטיביוטיקה. 50 μl של LB או הבידוד נוסף לבארות המתאימות, דילול האנטיביוטיקה שני לקפל לריכוז הסופי. LB משמש כשליטה לזיהום חיידקים באנטיביוטיקה. GM, גנטמיצין; קילומטר, kanamycin; Tob, tobramycin.
איור 2: titrations טיפול עם NTBC של יצרני pyomelanin והלא-יצרנים של פ aeruginosa. הטיפול עם NTBC מופחת pyomelanin ייצור באופן תלוי מינון במעבדה ומפיקי pyomelanin קליניים, אך לא הייתה השפעה על ייצור הפיגמנט בזנים שאינם מייצרים pyomelanin. שונה מהתייחסות 12.
איור 3: assay צלחת ספוט לתגובת לחץ חמצוני זני חיידקים היו מהולים.ד לאותו OD 600, סידורי בדילול של פי 10, והבחין בצלחות LB המכילות ריכוזים שונים של H 2 O 2. 0 תוצאות 2 O 2 צלחת מ"מ H הראו כי כל הזנים היו מדוללות כראוי, כפי שצוינו על ידי מספר דומה של מושבות בכל אחד מהמקומות לאותו הדילול לזנים שונים. הצלחות המכילות H 2 O 2 תכנית שהזנים היו רגישים יותר לעקה חמצונית כריכוז של H 2 O 2 מוגברות. זה מסומן על ידי ספירת מושבה ירידה בכתמים בהשוואה למצב לא H 2 O 2, כמו גם הפחתה בגודל מושבה. שונה מהתייחסות 12.
| ריכוז סופי של הטיפול עם NTBC (מיקרומטר) | נפח בטיפול עם NTBC (75.9 מ"מ) להוסיף (μl) |
| 0 | 0 |
| 50 </ Td> | .659 |
| 100 | 1.318 |
| 200 | 2.64 |
| 300 | 3.95 |
| 600 | 7.91 |
| 900 | 11.86 |
טבלת 1: ריכוז טיפול עם NTBC להקמת titrations ביטראות שולחן זה נותן ריכוזי טיפול עם NTBC שונים וכמות המקבילה של מניית הטיפול עם NTBC להוסיף ליטראות 1 מיליליטר
| ריכוז סופי של H 2 O 2 (מ"מ) | הסכום של 9.79 MH 2 O 2 (WT 30%) להוסיף (μl) |
| 0 | 0 |
| 0.2 | 2.04 |
| 0.4 | 4.09 |
| 0.6 | 6.13 |
| 0.8 | 8.17 |
| 1 | 10.21 |
טבלה 2:. ריכוזים של H 2 O 2 כדי להוסיף אגר LB עבור assay צלחת מקום סטרס חמצוני שולחן זה נותן H 2 O 2 השונים ריכוזים וכמות המקבילה של H 2 O 2 מרוכז המניה להוסיף 100 מיליליטר אגר LB.
| PAO1 - טיפול עם NTBC | PAO1 + טיפול עם NTBC | hmgA :: TN - טיפול עם NTBC | hmgA :: TN + טיפול עם NTBC | TN :: HPD - טיפול עם NTBC | HPD :: TN + טיפול עם NTBC | PA1111 - טיפול עם NTBC | L65 "> PA1111 + טיפול עם NTBC||
| גנטמיצין | 1 | 0.5 | 2 | 2 | 1 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| Kanamycin | 16 | 8 | 32 | 32 | 32 | 32 | 16 | 16 |
| Tobramycin | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | 0.5 |
טבלה 3: תוצאות MIC אנטיביוטיות שלוש מושבות עצמאיות נבדקו בשלושה עותקים עבור כל stra.ב. מודפס מחדש באישור התייחסות 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Sigma-Aldrich | SML0269-50mg | Also called nitisinone. Soluble in DMSO. |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 216763-100ML | 30 wt. % in H2O. Stabilized. |
| Gentamicin | Gold Bio | G-400-100 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Soluble in H2O. Filter sterilize. |
References
- Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
- Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
- Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
- Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E.
- Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
- Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
- Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
- Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
- Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
- Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
- Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
- Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
- Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
- Andrews, J. M.
- Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
- Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
- Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
- Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).
