Summary
המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.
Introduction
ההצטברות של מוטציות גנטיות בגנים רגולטורי מפתח משנה תיכנות תא נורמליות כמו התפשטות תאים, התמיינות, והישרדות, שמוביל לסרטן 1. מסלול קינאז RAS-RAF-MAP מתווך תגובות הסלולר לאותות צמיחה. מוטציות הסרטניות BRAF יכולות לנבוע ממוטציות נהג בגן BRAF, שעלול לגרום לBRAF oncoprotein להפוך פעיל יתר על המידה 2. מוטציות בגן BRAF גם לגרום לאיתות במורד הזרם פעיל יתר על המידה באמצעות MEK וERK 3, אשר, בתורו, מוביל לצמיחת תאים מופרזת והפצה עצמאית של רגולציה בתיווך גורם גדילת 4-6.
מספר כלים זמינים לפרופיל המוטציה בדנ"א, כגון מוטציות V600E BRAF כמותית בזמן אמת ב, קווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא על ידי ddPCR. ddPCR היא שיטת PCR מבוסס לכימות מוחלטתמציע דיוק גבוה יותר בהשוואה לזמן האמיתי קונבנציונלי PCR (qPCR) 7,8. ddPCR מספק גם גבוה יותר פתרון כוח ודיוק לגילוי מוטציות נדירות בתבניות DNA, המאפשר חקר סרטן יותר אינפורמטיבי ואבחון 9. יתרונות נוספים של ddPCR על qPCR הקונבנציונלי כוללים רגישות משופרת שלה ודיוק כאשר לומדים מספרי עותק תבנית נמוכה 10-12. במסמך זה, באופן אוטומטי לפרוטוקול חילוץ DNA מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטי תא, ואחרי קביעת קיומו או העדרו של מוטציות BRAF V600E ידי ddPCR הוא הוכיח. השימוש בתוכנה לניתוח נתונים וייצוג גרפי של התוצאות גם מתואר. כל ההליך הוא פשוט יחסית ולגמרי תלוי במספר הדגימות שצדודית ומספר מכונות PCR וddPCR קונבנציונליים זמין.
הפרוטוקול הבא מתאר נהלים סטנדרטיים לBR קווי AF-V600E חיובי התייחסות FFPE סטנדרטי תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) מתבצע במכשיר אוטומטי לחלוטין באמצעות פרוטוקול רקמות הכנת המערכת (תב"ע). בהמשך לכך, דגימות DNA מבודדות מנותחות לנוכחות מוטציות BRAF V600E באמצעות מערכת ddPCR. ניתוח מוטציה ממוקד מתבצע לאחר כל הדגימות כבר צדודית ונתונים כבר נטענו לתוך תוכנת ניתוח נתונים. תלוי במספר דגימות / קבוצות למדו, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות. הרכיב הניסיוני של המתודולוגיה דורש דיוק בטיפול ב- DNA ובית דגן מטפטף וPipettors, וידאו חינוך מדע יופיטר להסביר יותר על אודות ההקשר של pipetting "> pipetting לתוך 96 צלחות גם, תוך ניתוח נתונים נעשה באמצעות תוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת DNA משורות תאי FFPE ההפניה תקן
הערה: הליך זה, מיצוי DNA בוצע מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטיים תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) באמצעות ערכת בידוד DNA רקמות FFPE כפי שתואר בפרוטוקול בהמשך. מיצוי DNA אוטומטי הושג על ידי ביצוע הוראות היצרן לסך בידוד DNA.
- באמצעות microtome ולחסום FFPE המקורי, להכין ידני סעיפים טריים לפני מיצוי DNA וניתוח, בהתאם לנהלים שנקבעו. ודא שקלט המדגם לסעיף הרקמות (ים) ניתח אינו עולה על עובי כולל משולב של 10 מיקרומטר וששטחם אינו עולה על 600 מ"מ 2 לסעיף אחד.
1.2 פרוטוקול תב"ע
הערה: הכרכים מוצגים בטבלה 1 מתאים למינימום הנדרש כדי לעבד 48 דגימות, וההליךמוצג הוא בהתאם להנחיות תב"ע. לפני תחילת הניסוי להתיישב דגימות FFPE בדואר הצינור על ידי צנטריפוגה ב 600 XG, כדי למנוע אובדן של דגימות במהלך התכנית האוטומטית.
- הפעל את מכשיר בידוד DNA האוטומטי ומחשב. פתח את תוכנת שליטה על הפעלה ולהכניס מגש עומס אוטומטי לאזור טעינת סיפון תב"ע.
- לוותר ריאגנטים לשקתות המקבילה שלהם כפי שמוצג באיור 1.
- מניחים את 4 הדגימות (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% ו 1%) במדפי ספק מדגם.
- מניחים את תיבות קצה בשקתות בעמודות 2 ו -3 ולבדוק את הטיפים לנוכחות של מסנן אחד או יותר לקצה, אשר לקטוע את המסלול.
- להבטיח ערבוב נכון של מאגר תמוגה ולשטוף חיץ על ידי היפוכם 3-5 פעמים ולטעון אותם לתוך השקתות המתאימות בעמודה 4 (איור 1).
- לאחר היפוך לכמה פעמים או וארט קלexing, לטעון את חיץ elution, חרוזים מגנטיים, וחיץ FFPE בשקתות הקטנות בעמודה 5, משאיר חריץ 1 ריק שבו הצביע (איור 1, לוח 1).
- לטעון צלחת גם עמוקה 2 מיליליטר (DWP) על נושאת הצלחת (איור 1).
- בצע את השלבים הסופיים הבאים לפני שמתחיל לרוץ:
- Uncap כל הצינורות ושקתות מגיב. ודא שקיבולת מספקת זמינה בבקבוק הפסולת הנוזלי. ודא שבקבוק הפסולת המוצק הוא ריק ומרופד בשקית Biohazard. ודא שצלחת הוצאת הקצה מרוכזת בהרכבת הפסולת.
- סגור את המכסה הקדמי.
- הפעל את התוכנה. פתח את קובץ NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- לחץ על "התחל". מצב המכשיר יעבור ממצב המתנה להפעלה.
- הזן את מספר הדגימות לריצה זו. בחר את השיטה הרצויה לטווח זה (דנ"א = 0). הזן את העמדה הגבוהה כרך הראשוןUme קצה, בחירה "1" אם כל המגשים מלא. הזן את העמדה של קצה הנפח הסטנדרטי הראשון, בחירה "1" אם כל המגשים מלא.
הערה: אז המכשיר יפעל באמצעות צעדים אוטומטיים ללא התערבות משתמש. עבודה מפורטת מוצגת באיור 2. ברגע שהניסוי נגמר, פסולת מגיב וטיפים מוזרקים להרכבת הפסולת. - לכמת DNA הגנומי המטוהר באמצעות שיטת fluorometric.
הערה: דגימות DNA המכילות ריכוז מינימאלי של 3.3 ng / μl נתונים לניתוח ddPCR (סעיף 2).
2. DNA מוטצית פרופיל: ddPCR פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול לפרופיל ה- DNA מוטציה כולל 3 שלבים עיקריים: 1) דור אגל, 2) הגברה הקונבנציונלית PCR, 3) קריאת אגל ו4) פרופיל המוטציה בדנ"א.
2.1. דור אגל
הערה: Supermix ddPCR הואמומלץ לddPCR, כמו זה תערובת מכילה חומרים כימיים הנדרשים לדור אגל.
- כדי למנוע זיהום, בצע את אמצעי זהירות סטנדרטית, כגון כפפות, באמצעות מכסה המנוע נקי PCR, pipets הנקי, וצינורות נמוכים מחייב חלבון.
- ודא שהריכוז המינימאלי של דגימת DNA הגנומי אנושית הוא 3.3 ng / μl. הערה: כמות ריכוז דגימת DNA מטוהר תשתנה בהתאם לניתוח של זיהוי תדירות מוטציה%.
- להרכיב תערובות תגובה בצלחות PCR 96-היטב. להפשיר ולאזן את מרכיבי התגובה לRT. הכן PCR תגובות על ידי שילוב של Supermix 2X ddPCR (10 μl) ו -20 פריימרים (קדימה הפוכים, 900 ננומטר) ובדיקה (250 ננומטר) עם כל דגימת DNA מטוהרת (66ng / 2 μl) לעשות עד 20 μl עם מים מזוקקים (כ לגנרטור אגל הפרוטוקול)
- מערבולת לערבב ביסודיות כדי להבטיח צנטריפוגות הומוגניות ובקצרה לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינור לפני מחלק. עומס 20 & #181; l על המחסנית להיווצרות טיפה.
- מבצע של גנרטור אגל, לפרוטוקול המומלץ של היצרן
- הכנס את המחסנית לתוך המחזיק עם החריץ במחסנית ממוקמת בצד השמאלי העליון של בעל. הוסף 20 μl של תערובת תגובה המכילה דגימות למרכז הרחבה, ו -70 μl של גנרטור שמן לתוך הבארות התחתונה.
- צרף את האטם לרוחב החלק העליון של המחסנית. ודא שהאטם הוא מאובטח מכור בשני קצותיו של בעל; אחרת, לחץ מספיק לדור אגל לא יושג.
- פתח את מחולל אגל על ידי לחיצה על הכפתור הירוק בחלק העליון של המכשיר והכנס את המחסנית. כאשר בעל הוא במיקום הנכון, גם את הכח (משמאל מימין) ובעל (מימין באמצע) נוריות חיווי ירוקות.
- לחץ על הכפתור העליון במכשיר שוב כדי לסגור את הדלת וליזום דור אגל. הערה: לאחר הלחיצה על Button, סעפת עמדות על עצמו שוב את הבארות לשקע, ציור שמן ודגימות באמצעות ערוצי microfluidic, שבו טיפות נוצרות. טיפות לזרום לתוך אגל גם, שבו הם צוברים. נורית חיווי אגל (מימין) הבזקים ירוקים לאחר 10 שניות כדי לציין שדור רביב הוא בהתקדמות.
- כאשר דור רביב הוא מלא, כל 3 נוריות החיווי ישתנו לצבע ירוק מוצק; לפתוח את הדלת על ידי לחיצה על הכפתור, ולהסיר את בעל מהיחידה. הסר את האטם חד פעמי מהמחזיק וזורקים אותו. הערה: הבארות העליונה של המחסנית מכילות טיפות, ובארות אמצע ונמוכות הן כמעט ריקות, עם כמות קטנה של שמן שיורי.
2.2. הכנה לPCR
- עבור כל דגימה, pipet את 40 μl של תוכן הטיפה מהחלק העליון גם המחסניות לתוך באר בודד של צלחת 96-היטב PCR מומלץ כפי שצוין בפרוטוקול המכשיר של היצרן. לאטה: בעזרת פיפטה רב-ערוצים הוא אידיאלי להעברת תחליבי טיפות. שאיפה איטית ועדינה של טיפות מומלץ למזער גז אגל במהלך העברה.
- חותם את צלחת PCR עם רדיד מייד לאחר העברת טיפות, כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת נייר כסף לנקבה שתואמות את אוטם צלחת PCR והמחטים בקורא הטיפה. בצע את ההוראות במדריך הוראות אוטם צלחת PCR.
- הגדר את טמפרטורת אוטם צלחת 180 ° C וזמן 5 שניות.
- גע בחץ כדי לפתוח את דלת המגש. מקם את בלוק התמיכה על המגש עם צד 96-גם פונה כלפי מעלה. מניחים את צלחת 96-גם על לחסום את התמיכה ולהבטיח כי כל בארות הצלחת מיושרות עם בלוק התמיכה.
- מכסה את צלחת 96-היטב עם גיליון 1 של חותם נייר כסף לנקבה. ברגע שצלחת 96-היטב מאובטחת על בלוק התמיכה ומכוסה בנייר כסף את החותם לנקבה, גע בלחצן החותם. המגש ייסגרואיטום חום ייזום.
- כאשר איטום חום הוא מלא, הדלת נפתחת באופן אוטומטי; להסיר את הצלחת מהגוש החום לרכיבת תרמית ולאחר מכן להסיר את הגוש החום.
- ודא שכל הבארות בצלחת חתומות על ידי בדיקה ששקעים בנייר הכסף הם ברורים ממבט על כל טוב. ברגע אטום, הצלחת מוכנה לרכיבת תרמית.
- ברגע שטיפין יוסרו, לחץ על התפסים בבעל המחסנית כדי לפתוח אותו. הסר את המחסנית הריקה וזורקים אותו.
- בצע הגברה PCR קונבנציונלית על ידי ביצוע הפרמטרים מפורטים בטבלה 2.
2.3 קריאת אגל (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן)
שים לב: בעקבות ההגברה PCR של יעד חומצות גרעין בטיפין, מכשיר טיפת קורא מנתח כל טיפה בנפרד באמצעות מערכת זיהוי 2-צבע 13. אנחנו בדרך כלל להגדיר כדי לזהות FAMfluorophores כתב ד ויק.
- לחץ על "מערכת פלאש" לראש קורא הטיפה ולהפוך אותו מוכן לניתוח ddPCR.
- טען את הצלחת לתוך קורא אגל ולחץ על "התחל". קורא אגל aspirates כל דגימה, singulates הטיפות, ונחליהם בקובץ יחיד עבר גלאי 2-צבע. הגלאי קורא את הטיפות למנות דוגמאות חיוביות ושליליות.
- כאשר קריאת רביב היא מלאה, לפתוח את הדלת ולהוציא את בעל צלחת מהיחידה. הסר את צלחת ה- PCR 96-היטב מהבעל וזורקים אותו.
- לתחזוקה נאותה, להחליף את שמן טיפת הקורא ורוקן את פח האשפה במידת צורך. להוסיף 50 מיליליטר של אקונומיקה 10% לבקבוק הפסולת כדי למנוע התפתחותם של חיידקים.
2.4 פרופיל מוטציה בדנ"א (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן)
הערה: טיפות PCR חיוביות והשליליות PCR-נספרות לספק quantific המוחלטני של יעד מוטציות BRAF V600E DNA בצורה דיגיטלית, תוך שימוש בתוכנת ניתוח נתונים.
- לחץ על הגדרה להזין מידע על דגימות, מבחני, וניסויים.
- בחלון ההתקנה, לטעון צלחת (filename.qlp), לאחר מכן לחץ על ניתוח כדי לפתוח ולנתח את הנתונים. ממשק ניתוח הנתונים מופרד לשלושה חלונות: לוח תוצאות, ובכן בורר ו / תצוגה גרפית עיבודים.
- בחלון העיבודים, נתונים ריכוז לכל יעד יופיעו בבארות במפת הצלחת ונספרו בטבלת התוצאות. לחץ ריכוז לדמיין נתונים בחלקות ריכוז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לניתוח ddPCR, למדנו שורות תאי BRAF V600E התייחסות FFPE המוטציה סטנדרטית. קורא הטיפה מתחבר לתוכנת ניתוח נתונים ריצת מחשב נייד. כל טיפה בודדת מוגדרת על הבסיס של משרעת ניאון כמו להיות חיובי או שלילי. התוכנה המסופקת על ידי יצרן גם מאפשרת חיתוך משתמש מוגדר להיות נכנס להגדיר את הסף בין הטיפות החיוביות ושליליות. מספר הטיפות חיוביות ושליליות במדגם משמש לחישוב הריכוז של היעד במונחים של עותקים / μl.
הקרינה זוהתה ומעובדות לתצוגת עלילת פיזור דו-ממדית, תוכנה מותאמת אישית שימשה לצייר שערים מתאימים לכל אשכול נקודות קצה אגל, ומספר הטיפות בתוך כל שער נספר. כפי שניתן לראות באיור 3 א, טיפות מיוצג על ידי נקודות כחולות (אות הקרינה FAM) מעל קו החתך לכל samples (קו ורוד) היו חיובי לV600E BRAF מוטציה. טיפות מיוצגות על ידי נקודות כחולות בBRAF WT (NTC; ליין 2) מדגם יכול להיות בגלל אות שאינה ספציפית (חיובי כוזב). אותות חיוביים כוזבים (BRAF WT) היו מנורמלים עם דגימות מוטציה אחרות. כפי שניתן לראות באיור 3, טיפות WT BRAF מיוצגות על ידי נקודות ירוקות (אות הקרינה ויק). בשני המגרשים, נקודות האפורות בתחתית נחשבות כרקע הקרינה. תדרי אלל מוטנטי הכוללים חושבו באמצעות הנתונים שמוצגים באיור 3C, המבוסס על האחוזים היחסי של WT BRAF ותבניות V600E BRAF זוהו. תוצאות שהושגו ddPCR מכילות את סעיפי אירוע אגל ומחושב wild-type ומולקולת הדנ"א מוטציה סופרת לV600E BRAF (50%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1% ו 0.05%) דגימות מחושבות באמצעות להלן נוסחה הנזכרת.
% מתדירות המוטציה = (Mutantעותק / (wildtype + עותק Mutant)) x 100
בהתאם לכך, מוטציות BRAF V600E זוהו ואומתו עם תקן התייחסות (BRAF WT). תדרי allelic מוטציה BRAF V600E המוגדר של 50%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1% ו 0.05% שמשו לבדיקת הרגישות ושחזור של מערכת ddPCR. מהניתוח שלנו עם ריכוזי מדגם ידועים, אנו מאשרים כי ddPCR הוא מסוגל לזהות נמוך כמו 0.05% ממוטצית BRAF V600E. זיהוי של ספירת מוטציה חיובית כוזבת בNTC או WT עשוי אולי להיות בגלל הידרוליזה בדיקה אינה ספציפית כפי שדווח קודם לכן 14. איתור של יותר משני עותקים במדגם כבר נחשב חיובי ברקמת גידול 15.
איור 1. ייצוג סכמטי מתאר מגיב וטעינת מדגם בהכנה לAUT מכשיר מיצוי DNA omated. מניחים את דגימות מדפים מובילים ולוותר ריאגנטים לשקתות מקבילות כאמור. העסקת פרוטוקול תב"ע אוטומטי התומך בסוגים רבים מדגם, מספקת מדויקת, ותוצאות אמינות עם יעילות מקסימלית. מחדש מודפס באישור אבחון בריאות סימנס. (באדיבות אבחון בריאות סימנס).
איור 2. ייצוג סכמטי של רקמות זרימת העבודה הכנת מערכת להפקת DNA אוטומטית. הליך בידוד DNA אוטומטי לחלוטין לFFPE רקמות סעיפים כוללים צעדים שליליים בחירה של פרפין, הסרת פסולת רקמה וצעדי מבחר חיוביים של מחייב וelution מוצגים. מחדש מודפס באישור אבחון בריאות סימנס. (באדיבות אבחון בריאות סימנס).
3. השתמש באיור של מערכת ddPCR לכימות מדויק של V600E BRAF מוטציה בדגימות שורת תאים סטנדרטית התייחסות FFPE. (A, B) ויזואליזציה של אמפליטודות הקרינה חיוביות בחלקות 1D (1dot -1droplet). נקודות כחולות (, FAM חיובי) מייצגים טיפות V600E חיובי BRAF מוטציה, ואילו נקודות ירוקות (B, VIC חיובי) מייצג טיפות חיוביות לWT BRAF. קביעה זו מאפשרת כימות מוטציה מדויקת בשורות תאים סטנדרטיים התייחסות FFPE. הקו הוורוד הוא סף האפליה בין אותות חיוביים ושליליים של הטיפות. (C) עלילת שפע השבר מציגה סמנים כחולים המציינים את הריכוז (עותקים / μl) של המוטציה BRAF V600E, והסמנים הירוקים מצביעים הריכוז (עותקים / μl) של BRAF (WT). כל הברים השגיאה שנוצרו על ידי תוכנת ניתוח הנתונים מייצגים את מרווח הביטחון של 95%.
| ריאגנטים | נפח (מיליליטר) |
| תמוגה מאגר | 106 מיליליטר |
| הצפת לשטוף 1 | 101 מיליליטר |
| הצפת לשטוף 2 | 72 מיליליטר |
| הצפת לשטוף 3 | 106 מיליליטר |
| הצפת elution | 19 מיליליטר |
| חרוזים מגנטיים | 8 מיליליטר |
| מאגר FFPE | 15 מיליליטר |
| Proteinase K | 3.3 מיליליטר |
טבלת 1. נפח כולל של חומרים כימיים (ערכת תב"ע) הנדרש למיצוי DNA עם 48 דגימות.
| טמפרטורה | זמן | # מחזורים | |
| הפעלת אנזים | 95 מעלות צלזיוס | 10 דקות | 1 |
| Denaturation | 94 מעלות צלזיוס | 30 שניות | 40 |
| חישול / הרחבה | 60 מעלות צלזיוס | 1 דקות * | |
| החזק | 98 מעלות צלזיוס | 10 דקות | 1 |
| החזק | 4 מעלות צלזיוס | לנצח | 1 |
| * התאם את הגדרות שיעור רמפה ל2-2.5 ° C / sec. השתמש במכסה מחוממת מוגדרת 105 מעלות צלזיוס ולהגדיר את נפח הדגימה עד 40 μl | |||
2. תנאי thermocycling שולחן הקונבנציונלי PCR
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מדגישים את תחולתו של ddPCR ובידוד DNA מדגימות שורת תאים סטנדרטי התייחסות FFPE להערכת מוטציה הגנטית ספציפית. במחקר זה, שיטת בידוד תב"ע האוטומטית DNA משמשת שניתן להתאים בקלות, אוטומטי, ויכולה להכיל עד 48 מדגמים שונים בו זמנית, מה שמאפשר לניסויים בקנה מידה גדולים יותר והשתנות נמוכה יותר. אחת המגבלות של בידוד DNA בעבודה הנוכחית הוא שכל מדגם FFPE הוא ייחודי, וישתנה אחד אחרת במזהמי משטח, צמחיית חיידקים, ו / או רקע גנטי אנושי. באופן כללי, איכות וכמות ה- DNA חילוץ וההצלחה של ההגברה הדנ"א הגנומי כל תלויות פרמטרים שונים לפני, במהלך ואחרי החילוץ. אלה כוללים, סוג וכמות הרקמה, סוג של מקבע משמש לשימור רקמות, משך הקיבעון, גיל תנאי בלוק ואחסון נפט, כמו גם את אורכו של מקטע DNA הרצוי להיות מנותחת <sup> 16. הסרת פרפין מהרקמות היא השלב הקריטי ביותר להפקה מוצלחת כמו פרפין שלא נמס מוביל באיכות דגימה עניה. בדור אגל, יש להקפיד כדי למנוע היווצרות בועה - זה עוד צעד קריטי לזיהוי מוטציה מוצלח. בהתחשב במדגם מדגם וריאציה שעלולה להתעורר בין אוכלוסיות מדגם ומבוסס על המניע של הניסוי, שינויים מסוימים בהליך ייתכן שיידרשו כדי להשיג תוצאה רצויה.
יתרון נוסף הוא שבידוד DNA וddPCR מתבצע באמצעות מערכות אוטומטיות בפרוטוקול זה, ולכן יש שגיאה זניחה והתערבות של משתמש הנדרשת היא מינימאלית מאוד. בידוד כל-הגנום מוגבר DNA מרקמות / תאים מוטבעים פרפין הושג באמצעות מערכת TPS. אחד החסרונות בשימוש במערכת בידוד DNA אוטומטי הוא ש, זה לא יעלה יעיל לשימוש מספר קטן של דוגמאות. במקום STE האוטומטי זהעמ ', הליך בידוד DNA סטנדרטי אחר גם יכול להתבצע עבור דגימות מוגבלות
מחקר שנערך לאחרונה קבע כי אגל באמצעות PCR הדיגיטלי (ddPCR) הוא מסוגל לקבוע את מספר העותק היחסי של לוקוסים הגנומי ספציפיים אפילו בנוכחות של רקמה נורמלית מתמזגת מתקבלת מרקמות FFPE. באמצעות סדרת דילול שליטה, Nadauld, ל 'ואח'. קבע את הגבולות של גילוי (לוד) עבור assay ddPCR ודיווח על הרגישות המשופרת שלה בכמויות מזעריות של דנ"א לעומת זמן אמת סטנדרטי PCR 17. כאן, שורות תאים סטנדרטי התייחסות FFPE משמשות כדי להדגים את יכולת איתור מוטציה של מערכת ddPCR. תוצאות מערכת ddPCR הצביעו על האפשרות לזיהוי תדרי allelic המוטציה נדירים עד מוטציה 0.05%. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שמערכת ddPCR גם מאפשרת ניתוח כמותי של אחוזי אללים מוטציה שונים והבדלים יחסי במדגם גידול קליני הטרוזיגוטייםים. מספר גדול של דגימות FFPE ניתן לנתח למוטציות גנטיות ספציפיות בו זמנית וזה טכניקה אופטימלית למחקרים גנטיים רחבים אוכלוסייה.
לבסוף, יש לקחת בחשבון כי תדרי המוטציה מיוצגים כאן הם כימות מוחלט ולא צריך להיחשב כערך יחסי של שיעור מוטציות או תדירות. קריאת נתוני ddPCR מספק כימות מוחלט של המוטציה בדנ"א היעד. ערכים אלה יכולים לשמש לאימות תדרי מוטציה של דגימות מוכנות תחת אותו המצב, ורצף על אותו האזור. עם זאת, ערכים מוחלטים אלה לשחזור ויכולים לשמש להשוואת כמותית של הפצת מוטציה ותדירות כאשר פרמטרים אופטימליים נשלטים. לסיכום, ddPCR התפתח לאחרונה ככלי חזק שנותן quantitation המוחלט של חומצות גרעין בדגימות ביופסית FFPE וגם יכול להיות duplexed עם מבחני התייחסות לקביעת או לאריכוזי rmalized תמליל או עותק DNA מספר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מיונג Ryuri אה, סי יון קים, וצעיר Deug קים הן עובדי מלון האביון CRO.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר ופיתוח לחברה של קרן המחקר הלאומית (NRF), ממומנת על ידי משרד המדע, טכנולוגיות מידע ותקשורת ותכנון עתידי (מענק מס '2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
