Anti virulenta Störningar av patogena Biofilmer användning Engineered kvorum läckande Lactonases

Summary

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Abstract

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Introduction

Behandlingsalternativ för infektionssjukdomar har komplicerats av den snabba ökningen av multiresistenta bakterier som är immuna mot ett brett spektrum av antibiotika ^1. Med hög sjuklighet och dödlighet från resistenta bakteriemedie infektioner, det finns ett behov av att eskalera läkemedels utvecklingsprocesser och / eller utforska bättre antibakteriella alternativ för att förbättra terapeutiska möjligheter. På senare tid har den anti-virulens strategi ökar intresset med tanke på dess potential att förebygga virulens via icke-bakteriedödande metoder, därmed minska riskerna för resistensmekanismer ^2.

Quorum avkänning är en "huvudströmbrytare" i bakteriell virulens och störningar i denna signalering fenomen är en lovande anti-virulens metod mot patogenes ^3. Uppkomsten av virulens kräver ansamling av beslutförhet molekyler i den extracellulära omgivningen efter en kritisk bakteriepopulation täthet uppnås. Som quorom molekyler diffunderar tillbaka in i intracellulära matris, bindning med deras besläktade receptorer leder till aktivering av virulensfaktorer samt gener associerade med antibiotikaresistens och biofilmbildning ^4. I allmänhet, quorum kännande störningar innebär att hämma quorum molekyl och receptorinteraktion utan att påverka primära metabola vägar. Därför har det inte någon direkt implikation på celltillväxt. Eftersom lämplighet inte äventyras, det är minimal selektionstryck för bakterier att utvecklas och få motståndskraft mot sådana behandlingar ^5. Dessutom kan quorum-sensing störningar störa inneboende bakterieskyddsmekanismer, som i fallet av biofilmbildning, vilket ger skydd mot antibakteriella medel och värdimmunsvar.

Det uppskattas att det finns 99% av mikrober på jorden i komplexa biofilm liknande matriser, som ger viktiga överlevnads fördelar för mikroorganismerna som lever inom these strukturer ^6. Ännu viktigare är bildandet av dessa fastsittande domäner orsaken till de flesta långlivade och kroniska sjukhusförvärvade infektioner ^7. Acinetobacter baumannii är en av de viktigaste humana patogener som är förknippade med globala sjukhusförvärvade infektioner och dess virulens är till stor del tillskrivas quorum kännande medierad biofilm formation ^8. Quorum läckande enzymer har använts framgångsrikt i att störa beslutför-medierad signaltransduktion genom att rikta en grupp av föreningar som kallas N-acyl homoserinlaktoner (Ahls) som produceras av gramnegativa bakterier ^9. Flera studier har också expanderat på användningen av dessa enzymer för att blockera bakteriell patogenes genom att minska virulensfaktorn uttryck och cellantal i biofilmer ^10,11. Tyvärr finns det fortfarande en brist på påtaglig demonstration av en effektiv användning av kvorum- läckande enzymer mot biofilmbildning av bakteriella patogener. Dere har gjorts försök att använda kvorummöten hämmare (AHL analoger), i stället för kvorum- läckande enzymer, för att störa A. baumannii biofilm formation ^12. Även om denna metod för att använda små molekyler hämmare är en effektiv strategi, kan upprätthålla sin biotillgänglighet i translationella användningsområden vara en utmaning. Tvärtom skulle användningen av katalytiska beslutförhet läckande enzymer kringgå biotillgänglighet fråga som enzymer är mer mottagliga mot immobilisering på ytor av biomedicinska anordningar för terapeutiska effekter.

Här beskriver vi en bedömning av effekterna av manipulerade kvorum- läckande lactonases från Geobacillus kaustophilus (GKL) ^{13 på} bakteriell biofilm bildning, användning av kristallviolett färgning och konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM). Denna studie är den första lyckade demonstrationen av biofilm störningar i en kliniskt relevant A. baumannii S1-stam med användning kvorum- läckande enzymer. Metoderna beskrivnai denna studie är användbara för att bedöma effekten av andra kvorum- läckande enzymer i efterföljande terapeutiska utvecklingsinsatser mot patogena gramnegativa bakterier.

Protocol

1. Crystal Violet kvantifiering av biofilmbildning i A. baumannii S1 Odla en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i lysogeni-buljong (LB) (trypton 10 g / liter, jästextrakt 5 g / I) vid 30 ° C i en skakinkubator (220 rpm) under 16 timmar. Justera kultur av A. baumannii S1 till en önskad OD 600 av 0,8. Med användning av en 96-brunnars platta, ympa bakteriekulturen (1: 100 spädning) i färskt LB innehållande 10 | il av renat GKL enzym (40 mg / ml); den ny…

Representative Results

I kristallviolett kvantifiering experiment två beslutsförhet läckande enzymer används för att demonstrera genomförbarheten i att störa biofilmsbildning: vildtyp GKL och en förbättrad GKL dubbel mutant (E101G / R230C). Båda enzymerna har visat sig demonstrera laktonas aktivitet mot 3-hydroxi-dekanoyl-L-homoserinlakton (3-OH-C 10 -HSL), den viktigaste quorum molekyl som används av A. baumannii S1 14. För giltigt bedömning av biofilm stö…

Discussion

I båda uppsättningarna av experiment A. baumannii S1 odlades i LB-medium utan NaCl som en hög saltkoncentration kan minska mängden av biofilm som bildas av bakterierna ^15. Närvaron av sådan artefakt kan underskatta mängden av biofilm bildad, liksom effekterna av kvorum- läckande enzymer i olika behandlingsbetingelser. Användningen av ett katalytiskt inaktivt enzym är viktigt som en negativ kontroll för att eliminera de möjliga effekterna av enzym kvarstad. Figur 1 visar a…

Materials

Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus