Abstract
ほとんどの哺乳動物の病原体のために、研究を遺伝子発現プロファイリングは正確に、感染した組織からの病原体遺伝子転写物を定量するための技術的な困難さにより制限されています。病原体RNAは、感染した組織試料から単離された全RNAの小さな部分を構成しています。マイクロアレイとRNAseq技術の両方が弱く発現病原体の遺伝子を読み取る信頼性を生成する際に困難を持っています。 in vivoでの増殖に減少した変異病原体株は、さらに大きな課題を提起します。ここでは、非常に高速で非常に敏感と非常に再現性があるin vivoでの遺伝子発現プロファイリングプロトコルを記述します。私たちは、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルにおける真菌病原体カンジダ・アルビカンスの私達の調査中に、このプロトコルを開発しました。このプロトコルを使用して、我々は動的に調整されたCの時間経過を報告しています腎臓感染中アルビカンス遺伝子発現、及び予想外の特徴を発見し遺伝子発現応答をin vivoで薬物治療を抗真菌します。
Introduction
遺伝子発現のダイナミクスは、細胞が環境の変化にどのように応答するかについての重要な情報を保持しています。感染性微生物の場合には、遺伝子発現データは、病原体感染の環境に適応し、ホストへの損傷を引き起こす方法の臨床的に関連する洞察を提供することができます。過去20年間に、 インビトロおよびインビボの両方の遺伝子発現研究は、大量のデータを生成し、感染生物学1-3を理解するための基礎を築いています。しかし、マイクロアレイとRNAseqを含む現在のプロファイリング技術は、感染の間の病原体の遺伝子発現のプロファイリングには最適ではありません。 RNAは、感染した組織試料から単離された全RNAの圧倒的な部分（通常> 99％）を構成するホスト。宿主RNAは、マイクロアレイ上の高いバックグラウンドに寄与し、シーケンスはRNAseqから読み取り支配しています。感染組織からの病原体細胞の単離は、理論的には、病原体のRNAを濃縮することができますが、それはまたのポーズアルの問題：それが感染した組織を大量に必要とします。手順は退屈することができます。最も重要なことは、長いプロセスの間に天然状態またはRNAの完全性を保存することは困難です。実際の感染時に病原体の遺伝子発現のより包括的で正確なデータを生成するために、我々は、混合RNA集団中の少数のRNA種の信頼性が高く、費用対効果の定量化を可能にするプロトコルの開発に着手しました。
NanoString nCounterは、デジタルバーコードプローブ対4、5を用いた遺伝子発現の直接の多重化測定を行い、最近開発されたプラットフォームです。このプラットフォームは、QRT-PCRと同等の感度レベルを持っていますが、酵素増幅を必要としません。技術は、ゲノム全体ではないが、それは、それぞれのアッセイにおいて、最大800の異なる遺伝子の検出を可能にします。したがって、プロファイリングのためのプローブとして有益な遺伝子を選択することが重要です。ここでは、主要なハムの研究遺伝子発現プロファイリングを使用例として、侵襲性感染時の病原体、 カンジダ・アルビカンスは 、実証するために：1）実験手順（プロトコル）の技術的な詳細、2）この方法の感度、再現性とダイナミックレンジ（代表的な結果）、および3）重要このプロトコル（議論）に基づいて実験を設計し、実行するための考慮事項。このプロトコルは、容易に種々の病原体に適合させることができ、正常に感染モデル6-9の数に適用されています。
Protocol
全ての動物手順はロサンゼルス生物医学研究所（プロトコル011000）で施設内動物管理使用委員会によって承認され、動物の倫理的な治療のための国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って実施しました。マウスは、ハーバーUCLA研究教育院のキャンパス内にありAAALAC認定施設でケージに入れました。実験動物医学を専門にフルタイムの獣医師は、彼らの世話を監督。監禁と畜産は、米国公衆衛生局の出版物「実験動物の管理と使用に関する指針」のガイドラインに従って提供されました。すべての試みは人道的にマウスを治療することとしました。マウスの生存と健康は、毎日3回モニターしました。明らかに病気、無気力マウスをグループから分離し、苦痛を最小にするために安楽死させました。 Euthanas上のパネルが推奨するようにマウスを、ペントバルビタールの過剰投与（210 mgの/ kg）をすることにより安楽死させましたアメリカ獣医師会のIA。
1.組織の調製、試薬および楽器
- すべての研究20〜22グラム重み付けオスのBalb / cマウスを使用してください。静脈内に1×10 6酵母相Cで実験群あたり3匹のマウスに接種アルビカンス細胞 。特定の時点感染後に動物や収穫腎臓を生け贄に捧げます。スクリューキャップチューブに各腎臓を置き、後にRNA抽出6のために-80℃の液体窒素中で凍結し、店をスナップ。
注：Xuらに詳細に記載されるように動物実験を行った6。 - -80℃の冷凍庫から腎臓を削除する前に、以下の試薬および器具を準備します。
- 全RNA抽出キットを開きます。 （1％v / v）のRLTをバッファリングし、（各サンプルの2ミリリットルを用意）よく混合するの2-メルカプトエタノールを追加します。
- フェノールの調製：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1（各サンプルの600μlのを必要とします）。
- ラベルM型均質化チューブ（M-チューブ）、氷上で冷やします。
- ラベル2 mlのキャップチューブをネジし、各チューブに約300μlのジルコニアビーズを追加します。
- チェック機器を使用することができます。組織解離、beadbeater、50mlチューブおよび96ウェルプレート、光度計用のアダプタと卓上遠心機。
感染組織から2. RNA抽出
- -80℃の冷凍庫から腎臓を含むチューブを外して、氷の上に置きます。各腎臓への2-メルカプトエタノールとをBuffer RLT 1.2ミリリットルを追加します。 M型均質化チューブに緩衝液を用いて腎臓をデカント。
- 事前ロードされた設定RNA_02.01上の組織解離を使用して腎臓をホモジナイズします。
- RTで卓上遠心機で1分間、1000×gで遠心分離します。
- ジルコニアビーズを含むスクリューキャップチューブに600μlのホモジネートを転送します。氷の上の残りのホモジネートを保存します。
- 600μlのフェノールを追加：クロロホルム：イソアミルアルコール25：24：1前のステップからのチューブ。
- 4℃の低温室で3分間beadbeaterにしっかりと蓋を閉め、ボルテックス。
- 4℃の低温室で5分間15,000×gでチューブを遠心。
- 慎重にスピンカラム（2回ロード）にロード、その後、70％エタノールの等量よく混ぜ、新しい1.5mlマイクロチューブに水相を転送します。
- 二回と500μlのバッファーRPE、続いて700μlのバッファーRWで一度スピンカラムを洗浄します。スピンカラムに残っている液体を除去するためのドライコレクションチューブに遠心分離1つの余分分。 8,000×gですべての遠心操作を実行します。
- 50μlのH 2 Oで溶出RNA分光光度計を用いてOD 260で RNA濃度を測定します。
デジタルバーコードを使用してプロファイリング3.遺伝子発現
- 氷上で解凍レポーターコードセット（緑キャップチューブ）とキャプチャコードセット（グレーのキャップチューブ）。
- 130μlのハイブリダイゼーション緩衝液は、再に追加ポーターのコードセットは、混合し、スピンダウンする反転します。
- 12反応管のそれぞれにミックス20μlのを追加します。
- 各チューブに（5μLの容量で）全組織RNAの10μgのを追加します。ピペッティングにより混和します。
- 各チューブに5μlのキャプチャコードセットを追加します。クイックスピンダウンに続いてチューブを反転することによって混合します。
- 加熱蓋O / N（〜18時間）でのサーマルサイクラーで65℃で反応をインキュベートします。
- -20℃から1サンプルカートリッジを取り外し、室温にそれを温め。
- 卓上遠心機で2分間670×gで4℃、遠心分離機から2試薬プレートを取り外します。
- 画面上のステップバイステップの指示に従って準備ステーションを設定し、高感度オプションを選択します。
- サーマルサイクラーからの反応を削除し、すぐに準備ステーションにロードします。高感度プログラム（3時間）を実行する場合に選択します。
- プレップステーションプログラムが完了したら、カートリッジを除去し、透明なテープでレーンをシール。 APカートリッジの下にプライミネラルオイル（1世代のみnCounterため、後の世代には、このステップを必要としない）、その後、デジタルアナライザにカートリッジをロードします。
- 高解像度スキャンオプションを選択し、画面上のステップバイステップの指示に従ってデジタルアナライザを設定します。
- スキャンプログラム（〜4.5時間）、高解像度（600フィールド）オプションを選択して実行します。
- スキャンプログラムが完了すると、結果をダウンロード（または電子メールで結果を受け取ることを選択）、およびメーカーのソフトウェアに生データをインポートします。ソフトウェアは自動的にデータの品質をチェックし、データの品質が正常範囲から外れた場合にフラグを発生させます。 （オプション、ソフトウェアの指示に従ってください）組み込み関数を使用して技術的な調整を行い、その後、Excelファイルとしてデータをエクスポートします。
- 次のいずれかの方法を使用してデータを正規化：コードセット内のすべての遺伝子の合計数を、 1つまたは少数の内部コントロール遺伝子;幾何平均高発現遺伝子（説明を参照してください）。
- （実験は複製または三重に行われた場合）は、異なる実験群間の発現レベルの比を計算した後、各遺伝子の平均発現値を計算します。
- （オプション）nSolverソフトウェアまたはそのようなMultiExperimentビューア10としてクラスタリングプログラムに組み込み関数によってプロファイリング結果を分析し、可視化することができます。
Representative Results
生体内でプロファイリング病原体の遺伝子発現のための一つの主な課題は、十分な病原体RNAから読み取る取得することです。総RNAは、全RNAを多量に病原体転写物の割合が低い所定の（>10μg）を各反応のために使用されなければなりません。プラットフォームは、この視点でユニークな利点があります：それは、宿主RNAの圧倒的な量は、ノイズのかなりのレベルを引き起こさないように、特異性を高めるために捕捉プローブとレポートプローブの両方を使用しています。 （参考文献から適応。6）を図1に示すように、2つの感染組織サンプル（ブルードット）からの生カウントが生成されたすべての10式のデータの上にあったが、非感染組織試料（赤い点）からのバックグラウンド生の数は、すべての10未満でしたこのプロトコルを使用して高度に再現可能です。 図1（参考文献6から適応）に示すように、2つの生物学的複製（ブルードット、48時間の感染後の腎臓サンプル）からの生カウントは非常にグーを持っていましたR二乗値とDの相関は、0.945に等しいです。プラットフォームはまた、天然の生物学的発現レベルを包含するのに十分なダイナミックレンジを提供する（ 図1、生カウントは10 1から10 6の範囲でした）。
248環境応答遺伝子を特定するプローブセットを用いて、病原体の遺伝子発現の二相識別することができた（参考文献から適応図2、6）：初期遺伝子発現応答は、接種物と12時間の間で有意に異なるRNAレベルを有する遺伝子を含みます感染後のサンプル（P <0.05及び>発現の2倍の変化）、および後期遺伝子発現応答は、48時間の感染後のサンプル（P <0.05で12時間の時点の間で有意に異なるRNAレベルを有する遺伝子を含みますそして、> 2倍の発現の変化）。これらの結果は、ことを示しているC.アルビカンスの遺伝子発現は、動的に侵襲infectio中に規制されています哺乳動物宿主のN。
図1.生が。プローブは、2つの感染（48時間の感染後、青色のデータポイント）のカウント（参考文献6から適応）感染および非感染腎組織からカウントし、1感染していない（赤いデータポイント）腎臓サンプルは、散乱として表示されていますプロット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
C. 図2.式 アルビカンス 、環境応答性遺伝子は、侵襲性感染の間に（参考文献から適応。6）。発現レベルの変化を248℃でのマウスの腎臓の侵攻アルビカンス遺伝子は熱メートルに提示されていますAP形式。生物学的な三連の平均値はアップレギュレーション（黄色）のために示されており、12、24での遺伝子の（青）、および48時間感染後の相対的なダウンレギュレーション接種材料レベル（0時間）を意味します。彩度が10倍アップまたはダウンレギュレーションで完全に飽和して、表情変化の程度を表します。ヒートマップの一部は、代表的な初期の上方制御された遺伝子（上）、後期遺伝子（中央）、および初期のダウンレギュレートされた遺伝子（下）を説明するために展開されます。これらの部分では、個々のサンプルは、再現性を説明するために個別に表示されています。私たちは、接種物と12時間のサンプル間の有意差には早く発現変化を定義します。私たちは、12および48時間のサンプル間に有意な差として後期発現変化を定義します。意義は> 2倍、およびp値<0.05の変化を指します。平均値が計算される前に、各サンプルについてのデータは、対照遺伝子TDH3のRNAレベルに対して標準化しました。私たちの割り当て基準は、いくつかのdynamicaを許可LLY調節される遺伝子は、初期および後期表現クラスの両方に分類する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルはnanoString nCounterプラットフォームを使用して微生物感染の転写プロファイリングを最適化するために開発されています。全体の手順は、発現データに対する組織のコレクションから、未満48時間を必要とします。ハンズオン時間は、12個のサンプルのために約4時間です。このプロトコルにおける一つの重要な変数は、非常に最初のステップで組織に追加されたバッファRLTの量です。少なすぎるバッファは、フェノールクロロホルム抽出工程後の粘性ゲルの形成をもたらし、RNAの回収のための水相を残さないかもしれないがあまりにも多くのバッファは、ホモジネートを希釈し、RNA濃度を低下につながります。 （典型的な大きさと仮定した場合）、マウス組織のバッファRLTの経験的に決定された最適のボリュームがある：腎臓（1.2 ml）を、舌（1.0 ml）および肺（2.0ミリリットル）。特に、これらは糸状形で成長した微生物病原体については、ビーズ打つのステップは、完全に細胞内容物を放出するために、オープン厚い細胞壁を破るのに役立ちます。溶出工程において、最終的なRNAを増加させるために濃度は、最初のラウンドの溶出液をカラムに加え戻し、2回目を溶出することができます。約100μgの全組織RNAのは1 RNeasyスピンカラム（×50μL〜2μgの/μL）から回収することができます。 RNAのより大きな量が必要な場合は、第二の分取は、残りの組織ホモジネートから作ることができます。 RNA濃度が測定されるまで、念のために、残りのホモジネートを処分しないでください。
感染モデルに応じて、接種材料のサイズおよび病原体株は、全組織RNA中の病原体のRNAの割合は0％〜2％で変化し、典型的には0.05％-0.5％の範囲内です。 C.から全組織RNAを、例えば、10μgのアルビカンスは、感染した純粋なCの 10 ngのと同等の生のカウントを生成することができ、腎臓インビトロ培養からアルビカンス RNA（10 ngの/ 10μgの= 0.1％）。全組織RNA中の病原体のRNAの割合は広い範囲で変化するので、pathogeの量を知ることは困難ですトータルRNAの所定量のn RNA。消耗コードセットを回避するために、検出レベル以下の病原体のRNAの試料上で（250遺伝子のx 192反応のために、反応あたりのコストは約$ 200である）、RNAの品質管理ステップは、各試料中の病原体のRNAレベルを決定するために実行することができます。これは、Q-RTPCRまたは少数のハウスキーピング遺伝子を含む小さなコードセットのいずれかによって行うことができます。
病原体の遺伝子を用いて正規化は、発現プロファイルは、異なる試料間で比較することができる前に、重要なステップです。正規化のために一般的に使用される3つの方法があります。 1.コードセット内のすべての遺伝子から全カウントを使用してください。 2. 1つまたは少数の「ハウスキーピング」遺伝子。 3.高発現遺伝子の幾何平均（N個の数の積のN 乗根 ）を使用します。無関係な多数の遺伝子の合計数が信仰する可能性があるため、ランダムに選択されたプローブを含む大規模なコードセット（> 100個の遺伝子）については、正規化のために総カウントを使用することは、良い選択することができます完全RNAインプットの量を反映しています。 （菌糸の成長遺伝子は共調節する傾向があることを考えれば、このような菌糸の成長など、）特定のプロセスに焦点を当てたプローブを含む小さなコードセット（<100個の遺伝子）については、標準化のための制御として、1つまたは少数のハウスキーピング遺伝子を選択することが不可欠です。 TDH3、ロバスト表現代謝遺伝子は、多くの実験のためのコントロールとしても務めています。第3の方法は、高発現遺伝子から等しい貢献を強調して、方法1と2のハイブリッドです。
nCounterプラットフォームは、ゲノムワイドなされていないが、それは、単一のアッセイで最大800個の遺伝子についての発現レベルの定量化を可能にします。したがって、分析するために最も有益な遺伝子を選択すると、プロファイリングの成功のために重要です。プローブを選択するために2つのアプローチが使用されています。最初のアプローチは、「知識ベース」です。公開された発現と機能データからの情報は、現在の潜在的な関心のある遺伝子をスクリーニングするためにコンパイルされていますこのような環境応答遺伝子6-9として、研究しています。このアプローチは、in vivoでの簡単な比較はデータの解釈にコンテキストを提供するため、多くの既存のデータセットにデータをプロファイリングできます。第2のアプローチは、「探査ベース」です。そのような転写因子、キナーゼまたは細胞壁タンパク質を指定するすべての遺伝子のような微生物のゲノム中の遺伝子のカテゴリは、プローブ用に選択されます。このアプローチは、in vivoデータ 6プロファイリングに基づく新規毒性因子及び新規規制関係の発見の同定を可能にします。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金R21 DE023311（APM）、R56 AI111836（APM＆SGF）、R01 AI054928（SGF）、およびR01 DE017088（SGF）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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