确定基因组靶向分子的直接作用靶点仍然是一个重大挑战。为了理解DNA结合分子如何与基因组相互作用，我们开发了一种依赖小分子交联来分离染色质的方法（COSMIC）。
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本文内容
摘要
摘要
基因组是一些最有效化疗药物的作用靶点，但大多数此类药物缺乏DNA序列特异性，从而导致剂量限制性毒性和多种不良副作用。利用具有序列特异性的 小分子靶向基因组，可能有助于开发出治疗指数更高且脱靶效应更少的药物分子。 N-甲基吡咯/N甲基咪唑聚酰胺是一类可被合理设计以高精度靶向特定DNA序列的分子。与大多数天然转录因子不同，聚酰胺在结合甲基化或染色质化DNA时，其亲和力不会降低。聚酰胺的序列特异性已得到广泛研究 体外 通过同源位点鉴定（CSI）以及传统的生物化学和生物物理方法，已对多酰胺类化合物的结合特性进行研究，但在细胞内研究其与基因组靶标的结合仍具挑战性。本文报道了一种名为小分子交联分离染色质（crosslinking of small molecules to isolate chromatin, COSMIC）的方法，可鉴定多酰胺在整个基因组中的结合位点。COSMIC 与染色质免疫共沉淀（ChIP）技术类似，但在两个关键方面存在差异：（1）采用光交联剂以实现对多酰胺结合事件的选择性、时间可控的捕获；（2）利用生物素亲和标签在半变性条件下纯化多酰胺–DNA 共价复合物，从而减少非共价结合的 DNA 干扰。COSMIC 是一种通用策略，可用于揭示多酰胺及其他靶向基因组的化学治疗药物在全基因组范围内的结合行为。
引言
人体内每个细胞的生成信息都编码在DNA中。对这些信息的选择性使用决定了细胞的命运。转录因子（TFs）是一类能够结合到特定DNA序列上的蛋白质，可表达基因组中特定的基因子集，而转录因子的功能异常与多种疾病的发生相关，包括发育缺陷、癌症和糖尿病。1,2 我们一直致力于开发能够选择性结合基因组并调控基因调控网络的分子。
由多胺组成的 N-甲基吡咯和 N甲基咪唑是经过合理设计的分子，能够以媲美天然转录因子的特异性和亲和力靶向DNA。3-6 这些分子结合到DNA小沟中的特异序列。4,5,7-11 聚酰胺已被用于抑制和激活特定基因的表达。4,12-19 它们还具有有趣的抗病毒作用20-24 抗癌12,13,25-30 特性。聚酰胺的一个显著优点是能够识别并结合甲基化的DNA序列31,32 并缠绕在组蛋白上9,10,33.
为了测量DNA结合分子的全面结合特异性，我们实验室开发了识别共有序列位点（cognate site identifier, CSI）的方法。34-39 基于体外（in vitro）特异性的结合位点预测出现频率（基因组景观，genomescapes）可以在基因组上进行可....
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方案
1. 活细胞中的交联
- 以约 2.5×107 个 H1 细胞或其他培养细胞开始。
注意：此数量的 H1 细胞相当于五个 10 cm 培养皿（约 40% 汇合度）。 - 将细胞培养于涂有支持多能干细胞生长表面的培养皿中的 E8 培养基中，并在 37 °C、5% CO2 的湿化气氛中孵育。通过酶法收获细胞（参见材料列表）。注意：避免 H1 细胞汇合度超过 90%；高汇合度会诱导 H1 细胞自发分化。为计数细胞，额外培养一个 10 cm 培养皿的细胞，按照 1.8–1.10 节所述方法通过酶法消化细胞，并用血细胞计数板进行计数。
- 按照 Chen et al.54 的方法配制 E8 培养基
- 在加入多酰胺之前，使用连接真空泵的巴斯德吸管移除用过的培养基。使用移液管和移液器分配器向每个培养皿中加入新鲜培养基（每 10 cm 培养皿 8 ml）。
注意：应将培养基沿培养皿壁加入，以避免扰动细胞。从此时起需将细胞避光，防止多酰胺过早发生光交联。 - 使用移液器将多酰胺直接加入各培养皿的培养基中（每皿加入 8 µl 的 400 µM 多酰胺 DMSO 溶液，终浓度为 400 nM）。轻轻晃动培养皿，使多酰胺在培养基中均匀分散。
注意：浓度可调整，但需确保所选处理条件不引起细胞毒性。
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结果
为消除基因组片段化不均一性及其他变量的影响，纯化的DNA应始终以输入DNA（Input DNA）作为参照进行标准化。可使用针对目标位点的特异性引物。同时分析一个预期无分子结合的位点作为阴性对照，有助于实验结果的解读。我们观察到 >365 nm 光照后聚酰胺占据率增加 100 倍（图2).
富集的DNA也可通过下一代测序进行分析。DNA的测序文库制备方法与ChIP DNA的制备方法相同（例如，使用商业样品制备试剂盒，参见材料列表）。即使采用下一代测序技术，我们仍使用qPCR来确认在预期多酰胺结合的基因组位点处DNA的富集情况。测序完成后，将原始DNA读段比对至参考基因组，并使用专为分析ChIP-seq数据设计的相同软件生成密度图谱图3）。根据我们对细胞内多酰胺分布的分析，发现跨越广泛亲和力范围的成簇结合位点最能预测细胞内的占据情况。我们开发了一种算法，用于对整个基因组与我们的多酰胺结合情况进行评分 体外 CSI 数据（图4A）。该评分方法表明.......
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讨论
传统ChIP技术面临的主要挑战之一是合适抗体的筛选。ChIP高度依赖抗体的质量，而大多数商用抗体并不适用于ChIP实验。事实上，DNA元件百科全书（ENCODE）联盟发现，仅有20%的商用抗体适用于ChIP检测50。在COSMIC技术中，抗体被链霉亲和素（streptavidin）所取代。由于多酰胺分子上修饰有生物素（biotin），因此使用链霉亲和素替代抗体来捕获多酰胺–DNA交联复合物。生物素与链霉亲和素之间的相互作用是自然界中已知最强的相互作用之一，其强度比抗体与其配体的结合强一千到一百万倍62。我们利用这一强韧的相互作用以及链霉亲和素本身的内在稳定性，对捕获的多酰胺–DNA交联物进行剧烈的洗涤处理，这种条件足以使抗体变性。这些洗涤步骤显著降低了COSMIC的背景信号。此外，在此类剧烈条件下，诸如组蛋白等生物素化蛋白会去折叠并从DNA上解离63,64。
添加生物素基团会增加分子的大小，可通过替换为“可点击”基团（例如炔基）来减小分子体积。43-46 该基团可用于在细胞裂解后引入生物素基团。.......
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披露
A.Z.A. 是 Vista Motif, LLC 和 WINStep Forward 的唯一所有人。
致谢
我们感谢 Ansari 实验室成员以及 Parameswaran Ramanathan 教授提供的有益讨论。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA133508 和 HL099773、H. I. Romnes 教师研究员奖以及 W. M. Keck 医学研究奖对 A.Z.A. 的支持。G.S.E. 得到了生物化学系 Peterson 研究生奖学金以及美国国立卫生研究院 T32 GM07215 分子生物科学培训项目的支持。A.E. 得到了 Morgridge 研究生奖学金和干细胞与再生医学中心奖学金的支持，D.B. 得到了美国国家科学基金会（NSF）NSEC 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | 任意来源 | ||
| 苯甲脒 | 任意来源 | ||
| 亮抑酶肽 | 任意来源 | ||
| 蛋白酶K | 任意来源 | ||
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1 | Life Technologies | 65001 | |
| PBS，pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 可使用其他来源 |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Life Technologies | A1110501 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | 我们已成功尝试其他厂家的DNA柱产品。 |
| TruSeq ChIP 样品制备试剂盒 | Illumina | IP-202-1012 | 该试剂盒可用于为下一代测序制备COSMIC DNA |
| Matrigel 基底膜基质 | BD Biosciences | 356231 | 用于包被培养板以生长H1胚胎干细胞（H1 ESCs） |
| pH试纸 | 任意来源 | ||
| 棕色微量离心管 | 任意来源 | ||
| 微量离心管 | 任意来源 | ||
| Pyrex滤器 | 任意来源 | Pyrex烤盘适用 | |
| qPCR预混液 | 任意来源 | ||
| RNase | 任意来源 | ||
| HCl（6 N） | 任意来源 | ||
| 10 cm组织培养皿 | 任意来源 | ||
| 血清移液管 | 任意来源 | ||
| 巴斯德移液管 | 任意来源 | ||
| 移液器吸头 | 任意来源 | ||
| 15 ml锥形管 | 任意来源 | ||
| 离心机 | 任意来源 | ||
| 微量离心机 | 任意来源 | ||
| 旋转混合仪（nutator） | 任意来源 | ||
| 磁力分离架 | 任意来源 | ||
| 紫外光源 | CalSun | B001BH0A1A | 可使用其他紫外光源，但交联时间需通过实验优化 |
| Misonix超声破碎仪 | Qsonica | S4000配431C1杯型探头 | 可使用其他超声仪，但超声条件需通过实验优化 |
| 带湿度控制的CO2培养箱 | 任意来源 | ||
| 带真空出口的生物安全柜 | 任意来源 |
参考文献
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet<....
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重印与许可
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