Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Выявление прямых целей генома таргетирования молекул остается серьезной проблемой. Чтобы понять, как молекулы ДНК-связывающего заниматься геном, мы разработали метод, который опирается на сшивания малых молекул, чтобы изолировать хроматина (космические).

Abstract

Геном мишенью некоторые из наиболее эффективных химиотерапевтических средств, но большинство из этих препаратов не имеют специфичность последовательности ДНК, что приводит к дозозависимой токсичности и многие неблагоприятные побочные эффекты. Ориентация геном с последовательностью конкретных малых молекул может позволить молекулы с повышенной терапевтическим индексом и меньшими мимо эффектов. N -methylpyrrole / N метилимидазол полиамиды являются молекулы, которые могут быть рационально, предназначенные для решения конкретных последовательностей ДНК с изысканной точностью. И в отличие от большинства природных факторов транскрипции, полиамиды могут связываться с метиловым и chromatinized ДНК без потери сродства. Последовательность Специфика полиамидов была тщательно изучена в пробирке с родственным идентификации сайта (CSI) и с традиционными биохимических и биофизических подходов, но изучение полиамида связывания с геномной целей в клетках остается неуловимым. Здесь мы приводим метод сшивания малых молекул Isolaте хроматина (космические), который идентифицирует полиамидные сайты связывания в геноме. Космический аналогична иммунопреципитации хроматина (чип), но отличается в двух важных способов: (1) photocrosslinker используется для того, чтобы избирательное, временно контролируемый захват полиамидных связывания событий и (2) биотин сродством ручка используется для очистки полиамид -DNA конъюгаты под полу-денатурирующих условиях, чтобы уменьшить ДНК, которая является нековалентно связаны. Космический является общей стратегией, которые могут быть использованы для выявления генома связывания события полиамидов и других биологических поражающих химиотерапевтических агентов.

Introduction

Информация, чтобы каждая ячейка в человеческом теле закодирована в ДНК. Избирательное использование этой информации определяет судьбу клетки. Транскрипционных факторов (ТФ) являются белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК, чтобы выразить определенный набор генов в геноме, и неисправность ТФ связано с наступлением широкий спектр заболеваний, в том числе дефектов развития, рак и диабет . 1,2 Мы были заинтересованы в развитии молекулы, которые могут избирательно связываться с геном и модулируют генных регуляторных сетей.

Полиамиды состоит из N -methylpyrrole и N метилимидазол рационально продуманная молекулы, которые могут ориентироваться ДНК с особенностей и сходства, что соперник природные факторы транскрипции. 3-6 Эти молекулы связываются со специфическими последовательностями в малой бороздке ДНК. 4,5,7 -11 Полиамиды были использованы для обоих подавить и активировать экспрессию специфического гены. 4,12-19 Они также имеют интересные противовирусные 20-24 и противораковые свойства 12,13,25-30. Один привлекательной особенностью полиамидов является их способность получить доступ к последовательности ДНК, которые метилированные 31,32 и обернутые вокруг белков гистонов 9,10,33.

Для измерения комплексные специфичностью связывания молекул ДНК-связывающий нашей лаборатории создан способ родственные идентификатор сайта (CSI). 34-39 Прогнозируемое вхождение сайты связывания на основании в пробирке специфичности (genomescapes) могут быть отображены на геном, поскольку в пробирке связывания интенсивности прямо пропорционально констант ассоциации (К а). 34,35,37 Эти genomescapes обеспечить понимание размещение полиамида в геноме, но измерения полиамид связывания в живых клетках было проблемой. ДНК плотно упакованы в ядре, которые могли бы повлиять на доступность сайтов связывания. The Accessibility этих chromatinized последовательностей ДНК в полиамидов, остается загадкой.

В последнее время многие методы исследования взаимодействия между малыми молекулами нуклеиновых кислот и возникли. 40-48 Химический захвата близость и массово-параллельной последовательности ДНК (чем-след) является одним из таких методов. Хим-след использует формальдегид для сшивания небольших молекул для геномной цели интереса и биотинилированного производного небольшой интерес молекулы захватить лиганд-мишень взаимодействия. 48,49

Формальдегид сшивания приводит к косвенным взаимодействий, которые могут производить ложных срабатываний. 50 Мы разработали новый метод сшивания малых молекул, чтобы изолировать хроматина (космические), 51 с photocrosslinker, чтобы устранить эти так называемые "фантомные" пики. 50 Для начала, мы разработали и синтезировали Трифункциональные производные полиамидов. Эти молекулы содержали ДНК-связывающий Polyamide, А photocrosslinker (псорален), и близость ручка (биотин, Рисунок 1). С трифункциональных полиамидов, мы можем ковалентно захватить взаимодействия полиамида-ДНК с 365 нм УФ-облучения, длины волны, чтобы не повредить ДНК или индуцировать не-Psoralen на основе сшивания. 51 Далее, мы фрагментировать геном и очистить захваченный ДНК под жесткими, полу -denaturing условия для уменьшения ДНК, которая является нековалентно связаны. Таким образом, мы считаем, КОСМИЧЕСКИЙ как метод, связанные с чем-SEQ, но с более прямой считывания ДНК ориентации. Важно отметить, что слабым (К 10 3 -10 4 М -1) близость псоралена для ДНК не обнаруживаемой воздействие полиамида специфичность. 51,52 обогащенного фрагменты ДНК могут быть проанализированы количественные полимеразной цепной реакции 51 (космические-КПЦР) или следующего поколения секвенирования (53 КОСМИЧЕСКИХ SEQ). Эти данные позволяют объективную, геном наведением дизайн лигандов, которые междудействовать с желаемой локусов генома и свести к минимуму мимо эффекты.

Рисунок 1
Рисунок 1. Биологически активные полиамиды и космической схеме. (A) Шпилька полиамиды 1 - 2 целевые последовательность ДНК 5'-WACGTW-3 ". Линейные полиамиды 3 - 4 мишени 5'-AAGAAGAAG-3 ". Кольца N-метилимидазола выделены жирным шрифтом для наглядности. Открытые и заполненные круги представляют N -methylpyrrole и N метилимидазол, соответственно. Площадь представляет 3-хлортиофена, и бриллианты представляют бета-аланин. Псораленом и биотин обозначаются Р и В, соответственно. (B), космической схеме. Клетки обрабатывали трифункциональных производных полиамидов. После сшивания 365 нм УФ-облучения, клетки лysed и геномная ДНК разрезается. Покрытых стрептавидином магнитные гранулы добавляют захватить аддукты полиамид-ДНК. ДНК высвобождается и может быть проанализирована с помощью количественной ПЦР (КПЦР) или следующего поколения секвенирования (NGS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сшивание в живых клетках

  1. Начните с ~ 2.5x10 7 H1 клеток, или других культивируемых клеток.
    Примечание: Этот номер H1 клеток соответствует пяти 10-см чашки (приблизительно 40% слияния).
  2. Рост клеток в средах E8 на чашках, покрытых на поверхности, поддерживающей плюрипотентных стволовых клеток (см Материалы список), и инкубируют их при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2. Урожай клетки ферментами (см список материалов). Примечание: Не допускайте, чтобы H1 клетки превышать 90% слияния; конфлюентности вызывает спонтанную дифференцировку клеток H1. Для подсчета клеток, растут дополнительный 10-см блюдо клеток, поднимите клетки ферментами, как описано в разделах 1.8-1.10, и считать их с гемоцитометре.
    1. Подготовка E8 культуральной среды, как описано в Chen и соавт. 54
  3. Перед добавлением полиамида, удалить расходуемую культурную среду с помощью пастеровской пипетки, прикрепленной к вакуумной ловушки. Добавить свежие СМИ с вerological пипетки и пипетки Дозатор (8 мл на 10-см чашку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить СМИ в сторону тарелки для того, чтобы избежать разрушения клеток. С этого момента защищают клетки от света, чтобы избежать преждевременного фото-сшивания.
  4. Добавить полиамида с помощью пипетки (8 мкл 400 мкМ полиамида в ДМСО, 400 нМ конечная концентрация) непосредственно в культуральной среде в каждой чашке. Вихревой блюдо для разгона полиамид равномерно в средствах массовой информации.
    Примечание: Концентрация может быть разнообразным, но гарантировать, что ни клеточной токсичности не наблюдалось при лечении выбранной.
  5. Инкубируйте клетки 24 ч 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2, и обеспечить их защиту от света.
    Примечание: Время инкубации может изменяться для измерения полиамид связывания во времени.
  6. Вымойте каждый 10-см блюдо с 4 мл PBS (1,05 мМ фосфат калия одноосновной, 155.17 мМ хлорида натрия, 2,97 мМ фосфат натрия двузамещенный), используя серологические пипетки и пипетки DISраздатчика. Аспирируйте PBS и добавить 3 мл культуральной среды E8.
  7. С огни серым цветом, снимите крышку 5 чашек для культивирования и поместить клетки на плоской поверхности за пределами капотом. Поставьте стакан фильтра на 5 чашек для культивирования, чтобы отфильтровать свет с А <300 нм. Поместите источник УФ поверх фильтра. Образцы поперечных сшивок 30 мин с 365 нм УФ-облучения (2,4 мВт / см 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сшивание время должны быть определены опытным путем.
  8. Перевести культуры блюда обратно в капюшоне. Аспирируйте носитель с помощью пастеровской пипетки, прикрепленной к вакуумной ловушки. Вымойте каждый 10-см блюдо с 4 мл PBS. Аспирируйте PBS. Добавьте 3 мл фермента для диссоциации клеток (см список материалов) за 10-см чашку отделить клетки. Инкубируйте 5 минут при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не предварительно прогреть фермента.
  9. Quench фермент с 3 мл E8 средствах массовой информации в блюдо. Передача диссоциированных клеток в одном 15 мл коническую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Место клетки на льду с этого момента.
  10. CentriFuge диссоциируют клеткам 5 мин, 500 мкг при 4 ° С. Аспирируйте супернатант удалить фермент и средства массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза точку. Клетки могут быть быстро замораживали в жидком азоте, хранили при -80 ° С для последующей обработки в более позднее время.

2. Выделение хроматина

  1. Добавить 1,2 мл COSMIC буфер (20 мМ Трис-HCl [pH 8,1], 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% Тритон-X100, 0,1% SDS) и пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендируют осадок клеток для каждого образца в 1,2 мл буфера. КОСМИЧЕСКИХ
    1. Добавить 133 мкл каждого из 100 мМ фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ), 100 мМ бензамидин и 150 мкм пепстатина ингибиторов протеазы свежие до конечной концентрации 1 мМ PMSF и для бензамидина и 1,5 мкМ для пепстатина. Сплит решение клеточного лизата в двух янтарь 1,7 мл микропробирок.
  2. Ультразвук с Sonicator 35 мин (10 сек на 10 сек с 60% мощности), чтобы фрагментировать геном между 100 Aй 500 б.п..
    1. Удержать уровень хроматина раствора в микроцентрифужных трубки, параллельной уровня воды в резервуаре. Подтвердите этот уровень визуального осмотра.
      Примечание:. Убедитесь, что ДНК сдвигу с 1,5% агарозном геле 55
    2. Оптимизация времени обработки ультразвуком эмпирически. Используйте минимальное количество льда в водохранилище, чтобы охладить образцы, и убедитесь, что лед не вмешиваясь между образцами и чашки рога.
  3. Центрифуга образец 12000 мкг 10 мин. Сохраните водного раствора, который содержит растворимый хроматина путем передачи его на новый янтарь микроцентрифужных трубки с пипеткой. Откажитесь от гранул.
  4. Передача 110 мкл (10%) образца на новый микроцентрифужных трубки и обозначить ее ввода ДНК. Хранить при -80 ° С. Сохранить остальную часть образца хроматина на льду для использования на стадии 3.3.

3. Захват лиганд-ДНК сшивок

  1. Используйте пипетку, чтобы обойтись 60 мкл streptaviдин-покрытием магнитных шариков в микроцентрифужных трубки. Добавить 1 мл буфера COSMIC и смешать на nutator 5 мин при комнатной температуре. Поместите магнитные шарики на магнитной сепарации стойки 2 мин, чтобы захватить шарики. Удалить COSMIC буфер с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте шарики высыхают. Немедленно приступить к следующему шагу.
  2. Добавить хроматина пробы (~ 1 мл) с гранулами (60 мкл) и ресуспендируют бусины. Инкубируйте хроматина с покрытыми стрептавидином магнитные гранулы, по крайней мере 4 ч на ротационной мешалке, качалке при 4 ° С. Выдержите образцы O / N, при желании.

4. Выделение аффинно-очищенными ДНК

  1. Вымойте бисером с 7-минутного интервала при комнатной температуре со следующими мытья буферов для удаления неспецифических взаимодействий. Используйте магнитную стойку разделения захватить шарики после каждого мытья. Ресуспендируют бусины после каждого изменения в стиральной буфера.
  2. Подготовка стирки буферов в дистиллированной деионизированной воде и фильтр (0,2 мкм) перед использованием. Магазин мыть Буферы 1 и 2 при 4 ° С для Several месяцев. Подготовьте промывочный буфер 3 свежих каждый день. Добавить и удалить моющие буферов образца с помощью пипетки. Для 2 и 4, добавление 1 и 3 (5 мм), соответственно, в промывок. Образцы могут быть дополнительно дважды промывали КОСМИЧЕСКОГО буфера (сразу 12 ч, после 4 часов) до промывок, перечисленных ниже.
    1. Промывают один раз промывочным буфером 1 (10 мМ Трис-Cl [рН 8,0], 1 мМ ЭДТА, 3% SDS). Промывают один раз промывочного буфера 2 (10 мМ Трис-Cl [рН 8,0], 250 ммоль LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% NP40, 1% дезоксихолат натрия). Дважды промывали промывочным буфером 3 (4 М мочевины, 10 мМ Трис-Cl [рН 7,5], 1 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40). Дважды промывали Трис ЭДТА (ТЕ) буфера (10 мМ Трис-Cl [рН 8,0], 1 мМ ЭДТА).
  3. Ресуспендируют бисером в 200 мкл ТЕ-буфера с помощью пипетки. Этот образец захваченного ДНК называют аффинно-очищенными (AP) ДНК.
  4. Дополнение входного и AP ДНК с 10-кратным Crosslink разворота буфера (100 мМ Трис-Cl [8,0] рН 1 М КОН, 4 ммЭДТА) до 1х конечную концентрацию. 56,57 Выдержите 30 мин при 90 ° С.
    Примечание: 254 нм УФ-облучение также может быть использован, чтобы изменить псорален поперечных связей, но циклобутил 58 пиримидиновые димеры могут быть образованы из облучения на этой длине волны и мешать последующей обработки ДНК.
  5. Для AP ДНК, поместите микроцентрифуга трубки, содержащей образец на магнитной сепарации стойки 2 мин при комнатной температуре, и выделение жидкости (ДНК) с помощью пипетки. Передача AP ДНК (который был освобожден из бисера) к новому янтарь микроцентрифужных трубки.
    Примечание: Заданная АР ДНК в жидкости, больше не прилагается к шарикам.
  6. Нейтрализовать ввода и ДНК AP концентрированной НСl до рН 7 добавлением приблизительно от 1 мкл 6 N HCl в 100 мкл образца с помощью пипетки. Подтвердите образцы нейтрализовали добавлением ~ 0,5 мкл на рН бумаги с пипетки. Внимание: концентрированную HCl сильная кислота коррозионные. Обращайтесь в соответствии с вашим учреждением217; s руководящие принципы для средств личной защиты.
  7. Добавить РНКазы А (100 мг / мл) до 0,2 мкг / мкл конечной концентрации в обоих входных и AP ДНК. Инкубируют 1 час при 37 ° С. Добавить протеиназы К (20 мг / мл) до 0,2 мкг / мкл конечной концентрации в обоих входных и AP ДНК, добавить. Выдержите 1 час при 55 ° C.
  8. Очищают ДНК с ДНК комплект колонки очистки (список материалов). 55 элюирования ДНК в 58 мкл ДНК-класса H 2 O. Магазин Входные и AP образцы при -20 или -80 ° C
  9. Анализ ДНК AP количественными полимеразной цепной реакции (КПЦР) с локус-специфических праймеров, и / или путем следующего поколения секвенирования. Для количественной ПЦР, используют 2 мкл ДНК AP на локус со следующими параметрами: 1 цикл 95 ° С 10 мин и 40 циклов 95 ° С 20 сек, 54 ° С или 56 ° С 20 сек, 72 ° С 40 сек.
    Примечание: Температура отжига должна быть изменена в зависимости от температуры плавления пар праймеров, используемых. Выберите отжига temperatuRe, что сводит к минимуму цикл количественный без каких-либо неспецифической амплификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа следующего поколения с секвенирования, цель, по крайней мере 10 млн отображается читает. Количество карту считывает может быть увеличена за счет увеличения количества ДНК AP и меньше путем объединения образцов в перспективе для секвенирования. Подробнее читает повышения чувствительности. Стандартная упаковка для чип-след анализа (например, Гомера, 59 MACS, 60 и 61) SPP работать с КОСМИЧЕСКИХ последующие данные. Как и в других методах, которые полагаются на следующего поколения секвенирования генома, в том числе последовательности и чип-SEQ, повторяющиеся регионы создают неясности в выравнивания и собраний и, таким образом, остаются техническая задача.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для учета неравномерного генома фрагментации и других переменных, очищенный ДНК всегда должны быть нормализованы против ведения ввода ДНК. Праймеров, специфичных к локусу интерес может быть использован. Это полезно также проанализировать локус, где молекула не ожидается, чтобы связать, в качестве отрицательного контроля. Мы видим увеличение> 100-кратное размещение полиамида при облучении 365 нм света (рис 2).

Обогащенный ДНК также могут быть проанализированы следующего поколения секвенирования. ДНК получают для секвенирования таким же образом, как готовят ДНК-чип (например, с коммерческим образцом Prep Kit, см список материалов). Даже с следующего поколения секвенирования, мы по-прежнему использовать КПЦР для подтверждения обогащение ДНК в локусах, где мы ожидаем, что полиамид быть связаны. После того, как последовательность, сырье ДНК читает выровнены с геномом и плотности следов готовы с той же программного обеспечения, предназначенного для анализа чип-последующие данные (Рисунок 3). БаСЭД на нашем анализе полиамидных распределений в клетках, мы обнаружили, что кластер сайтов связывания, охватывая широкий спектр сродства, лучше прогнозировать заполняемость в клетках. Мы разработали алгоритм, чтобы забить весь геном для связывания с нашими данные в пробирке CSI (рис 4а). Этот метод подсчета очков выяснилось, что разные локусов генома с аналогичными прогнозируемых обязательных показателей демонстрируют разнообразную кластеризацию нескольких сайтов различной сродства (рис 4б).

фигура 2
Рисунок 2. Результаты космических КПЦР. Влияние 365 нм УФ-облучения на фракции AP / вход из НЕК293. А.П., аффинно очищенным. Результаты приведены на логарифмической шкале и представляют среднее ± SEM

Рисунок 3
Fiфигура 3. Результаты космических SEQ в H1 клетках. КОСМИЧЕСКИХ последующие плотность тег трек для линейного полиамида 4, направленное на AAG повторяется. Плотность тегов нормализовалось 10 7 тегов и отображается с интегрированной генома Viewer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Модель из полиамида обязательными. (A) Скрипка участки прогнозируемых показателей для 2 и 4 обязательным по всей генома. Представительства genomescapes для 4 также показаны. С помощью метода биоинформатики забил занятых, геномные локусы можно подвести к тому же предсказал счет различными способами. (Б) локусов с несколькими низкими и средними сродство последовательностей шож похожи размещение полиамид локусов с нескольких последовательностей высоким сродством. Печатается с разрешения. 51 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Молекулярная биология выпуск 107 КОСМИЧЕСКИЙ CSI молекулярное распознавание хемоинформатика химические геномика полиамид геном таргетинг точность медицины ДНК иммунопреципитация хроматина следующего поколения секвенирования
Генома Отображение лекарственно-ДНК взаимодействий в клетках с космическими (сшивание малых молекул изолировать хроматина)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter