Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Identifiera de direkta målen för genom-målsökande molekyler är fortfarande en stor utmaning. För att förstå hur DNA-bindande molekyler engagera genomet har vi utvecklat en metod som bygger på tvärbindning av små molekyler för att isolera kromatin (COSMIC).

Abstract

Genomet är målet för några av de mest effektiva kemoterapeutika, men de flesta av dessa läkemedel saknar DNA-sekvens specificitet, vilket leder till dosbegränsande toxicitet och många negativa biverkningar. Targeting genomet med sekvensspecifika små molekyler kan möjliggöra molekyler med ökad terapeutisk index och färre ej åsyftade effekter. N -methylpyrrole / N -metylimidazol polyamider är molekyler som kan rationellt utformade att inrikta sig på specifika DNA-sekvenser med utsökt precision. Och till skillnad från de flesta naturliga transkriptionsfaktorer, kan polyamider binda till metylerat och chromatinized DNA utan förlust i affinitet. Den sekvensspecificitet av polyamider har studerats in vitro med besläktat platsbeskrivning (CSI) och med traditionella biokemiska och biofysiska metoder, men studiet av polyamid-bindning till genomiska mål i celler fortfarande instabil. Här rapporterar vi ett förfarande, att tvärbindningen av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), identifierar att polyamid bindningsställen över hela genomet. COSMIC liknar kromatin immunoprecipitation (chip), men skiljer sig i två viktiga sätt: (1) en fototvärbindare utnyttjas för att möjliggöra selektiv, tidsmässigt kontrollerade infångning av polyamid bindningshändelser, och (2) biotin affinitetshandtag används för att rena polyamid -DNA konjugat enligt semi-denaturerande betingelser för att minska DNA som är icke-kovalent bunden. COSMIC är en allmän strategi som kan användas för att avslöja de genomvida bindningshändelser av polyamider och andra genom-targeting kemoterapeutiska medel.

Introduction

Den information för att göra varje cell i människokroppen är kodad i DNA. Den selektiv användning av denna information styr ödet för en cell. Transkriptionsfaktorer (TFS) är proteiner som binder till specifika DNA-sekvenser för att uttrycka en speciell undergrupp av generna i genomet, och fel på TF: er är kopplad till uppkomsten av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive utvecklingsdefekter, cancer och diabetes . 1,2 Vi har varit intresserade av att utveckla molekyler som selektivt kan binda till arvsmassan och modulerar genreglerande nätverk.

Polyamider som består av N -methylpyrrole och N -metylimidazol är rationellt utformade molekyler som kan rikta DNA med särdrag och tillhörighet som rivaliserande naturliga transkriptionsfaktorer. 3-6 Dessa molekyler binder till specifika sekvenser i mindre spår av DNA. 4,5,7 -11 Polyamider har använts för att både undertrycka och aktivera uttrycket av specifika genes. 4,12-19 De har också intressanta antivirala 20-24 och cancer 12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv egenskap av polyamider är deras förmåga att få tillgång till DNA-sekvenser som är metylerade 31,32 och lindade runt histonproteiner 9,10,33.

För att mäta de omfattande bindningsspecificiteter av DNA-bindande molekyler, skapade vårt labb det besläktade platsen identifieringsmetod (CSI). 34-39 Den förutspådda förekomsten av bindningsställen baserat på in vitro-specifika förhållanden (genomescapes) kan visas på genomet, eftersom in vitro bindningsnivåer är direkt proportionell mot associationskonstanter (K a). 34,35,37 Dessa genomescapes ge insikt i polyamid beläggning över genomet, men mätning av polyamid bindande i levande celler har varit en utmaning. DNA är tätt förpackad i kärnan, som skulle kunna påverka tillgängligheten till bindningsställen. The accessibility av dessa chromatinized DNA-sekvenser till polyamider förblir ett mysterium.

Nyligen många metoder studera interaktioner mellan små molekyler och nukleinsyror har uppstått. 40-48 Den kemiska affinitetsinfångning och massivt parallella DNA-sekvensering (kem-punkter) är en sådan teknik. Chem-seq använder formaldehyd för att tvärbinda små molekyler till en genomisk mål av intresse och ett biotinylerat derivat av en liten molekyl av intresse för att fånga ligand-mål-interaktion. 48,49

Formaldehyd tvärbindning leder till indirekt interaktion som kan producera falska positiva. 50 Vi har utvecklat en ny metod, tvärbindningen av små molekyler för att isolera kromatin (COSMIC), 51 med en fototvärbindare att eliminera dessa så kallade "fantom" toppar. 50 Till att börja, Vi designade och syntetiserade trifunktionella derivat av polyamider. Dessa molekyler innehöll en DNA-bindande polyamide, en fototvärbindare (psoralen), och en affinitetshandtag (biotin, figur 1). Med trifunktionella polyamider, kan vi kovalent fånga polyamid-DNA-interaktioner med 365 nm UV-bestrålning, en våglängd som inte skadar DNA eller förorsaka icke psoralen-baserade tvärbindning. 51 Nästa, vi fragmentera genomet och rena den infångade DNA under stringenta, semi -denaturing betingelser för att minska DNA som är icke-kovalent bunden. Därför ser vi COSMIC som en metod i samband med kemiska-punkter, men med en mer direkt avläsning av DNA inriktning. Viktigt är att svaga (K 10 3 -10 4 M -1) affinitet psoralen för DNA inte påvisbart påverkan polyamid specificitet. 51,52 De anrikade DNA-fragment kan analyseras antingen genom kvantitativ polymerase chain reaction 51 (COSMIC-qPCR) eller genom nästa generations sekvensering 53 (COSMIC-punkter). Dessa uppgifter möjliggöra en opartisk, genom styrd utformning av ligander som interhandla med deras önskade genomiska loci och minimera off-target effekter.

Figur 1
Figur 1. Bioaktiva polyamider och kosmisk ordning. (A) hårnål polyamider 1-2 målgrupp DNA-sekvensen 5'-WACGTW-3 '. Linjära polyamider 3-4 målgrupp 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringar av N-metylimidazol är i fetstil för tydlighets skull. Öppna och fyllda cirklar representerar N -methylpyrrole och N metylimidazol, respektive. Square representerar 3-klortiofen och diamanter representerar β-alanin. Psoralen och biotin betecknas med P och B, respektive. (B) KOSMISK system. Celler behandlas med trifunktionella derivat av polyamider. Efter tvärbindning med 365 nm UV-bestrålning, celler är lysed och genomisk DNA klippt. Streptavidinbelagda magnetiska pärlor tillsätts för att fånga polyamid-DNA-addukter. DNA frigörs och kan analyseras med kvantitativ PCR (qPCR) eller genom nästa generations sekvensering (NGS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tvärbindning i levande celler

  1. Börja med ~ 2,5x10 7 H1-celler, eller andra odlade celler.
    OBS: Denna antal H1 celler motsvarar fem 10-cm rätter (ca 40% konfluens).
  2. Odla celler i E8 media på skålar belagda på en yta som stöder pluripotenta stamceller (se Material List), och inkubera dem vid 37 ° C i fuktad atmosfär av 5% CO2. Harvest celler enzymatiskt (se Materials List). Obs: Låt inte H1 celler att överstiga 90% konfluens; konfluens inducerar spontan differentiering av H1-celler. För att räkna celler, växer en extra 10-cm skål med celler, lyfta cellerna enzymatiskt såsom beskrivits i avsnitten 1.8-1.10, och räkna dem med en hemocytometer.
    1. Förbered E8 odlingsmedier som beskrivs i Chen et al. 54
  3. Före tillsats av polyamid, avlägsna det förbrukade odlingsmedium med en pasteurpipett ansluten till en vakuumfälla. Lägg till nytt medium med såerological pipett och pipetDispenser (8 ml per 10-cm skål).
    OBS: Lägg medierna vid sidan av skålen för att undvika att störa cellerna. Från denna punkt och framåt skydda cellerna från ljus för att undvika för tidig fototvärbindning.
  4. Lägg polyamid med en pipett (8 il 400 iM polyamid i DMSO, 400 nM slutlig koncentration) direkt till odlingsmediet av varje maträtt. Snurra skålen för att skingra polyamiden jämnt i medierna.
    OBS: Koncentration kan varieras, men att ingen cellulär toxicitet observeras för behandling valda.
  5. Inkubera cellerna 24 h 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO2, och se till att de skyddas från ljus.
    OBS: Inkubationstiden kan varieras för att mäta polyamid bindning över tiden.
  6. Tvätta varje 10-cm skål med 4 ml PBS (1,05 mM kaliumfosfat monobasisk, 155,17 mM natriumklorid, 2,97 mM natriumfosfat dibasisk) med användning av en serologisk pipett och pipet dispenser. Aspirera PBS och tillsätt 3 ml E8 odlingsmedier.
  7. Med lamporna nedtonade, ta bort locket av 5 odlingsskålar och placera cellerna på en plan yta utanför huven. Placera ett glasfilter över 5 odlingsskålar för att filtrera ut ljus med λ <300 nm. Placera UV-källan ovanpå filtret. Tvär prover 30 min med 365 nm UV-bestrålning (2,4 mW / cm 2).
    OBS: Tvärbindning Tiden bör bestämmas empiriskt.
  8. Transfer tillbaka till huven odlingsskålar. Suga ut mediet med en pasteurpipett ansluten till en vakuumfälla. Tvätta varje 10-cm skål med 4 ml PBS. Aspirera PBS. Tillsätt 3 ml enzym för cell dissociation (se Material List) per 10 cm skålen dissociera cellerna. Inkubera 5 minuter vid 37 ° C.
    OBS: inte i förväg värma enzymet.
  9. Släck enzymet med 3 ml E8 media per fat. Transfer dissocierade celler i ett 15-ml koniskt rör.
    OBS: Placera cellerna på is från denna punkt och framåt.
  10. CentriFuge dissocierade celler 5 min, 500 x g vid 4 ° C. Sug ut supernatant för att avlägsna enzym och media.
    OBS: Paus punkt. Celler kan vara blixtfrystes i flytande kväve, lagrad vid -80 ° C för efterföljande bearbetning vid ett senare tillfälle.

2. Isolering av Chromatin

  1. Lägg 1,2 ml KOSMISK buffert (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) och pipettera upp och ned flera gånger för att resuspendera cellpelleten för varje prov i 1,2 ml KOSMISK buffert.
    1. Lägg 133 il vardera av 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM bensamidin och 150 | iM pepstatin proteasinhibitorer färska till en slutlig koncentration av 1 mM för PMSF och bensamidin och 1,5 pM för pepstatin. Split lösning av cellysat i två bärnsten 1,7 ml mikrocentrifugrör.
  2. Sonikera med sonikator 35 min (10 sek på 10 sek av, 60% effekt) att fragmentera genomet till mellan 100 ennd 500 bp.
    1. Hålla nivån av kromatin lösning i mikrocentrifugrör parallellt till nivån av vatten i behållaren. Bekräfta denna nivå genom visuell inspektion.
      Anmärkning. Kontrollera att DNA skjuvades med en 1,5% agarosgel 55
    2. Optimera sonikeringstid empiriskt. Använd en minimal mängd av is i reservoaren att kyla proverna, och se till att isen inte interfererande mellan proven och koppen horn.
  3. Centrifugera provet 12.000 xg 10 min. Spara vattenlösning som innehåller lösliga kromatin genom att överföra den till en ny bärnsten mikrocentrifugrör med en pipett. Kassera pelleten.
  4. Överför 110 | il (10%) av provet till ett nytt mikrocentrifugrör och märk den Input DNA. Förvara vid -80 ° C. Spara resten av kromatin prov på is för användning i steg 3.3.

3. Fånga av ligand-DNA tvärbindningar

  1. Använd en pipett för att dispensera 60 | il streptavidin-belagda magnetiska pärlor i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml KOSMISK buffert och blanda på en nutator 5 min vid RT. Placera magnetiska kulor på magnetisk separation rack 2 min för att fånga pärlor. Avlägsna KOSMISK buffert med en pipett.
    OBS: Låt inte kulorna torka ut. Fortsätt omedelbart till nästa steg.
  2. Lägg kromatin prov (~ 1 ml) för att pärlor (60 | j, l) och återsuspendera pärlorna. Inkubera kromatin med streptavidinbelagda magnetiska pärlor minst 4 h på en roterande, gungande blandare vid 4 ° C. Inkubera proverna O / N om så önskas.

4. Isolering av Affinitetsrenat DNA

  1. Tvätta pärlorna med 7 minuters intervall vid RT med följande tvättbuffertar för att avlägsna icke-specifika interaktioner. Använd en magnetisk separation rack att fånga pärlor efter varje tvätt. Resuspendera kulorna efter varje ändring i tvättbuffert.
  2. Bered tvättbuffertar i destillerat avjoniserat vatten och filtrering (0,2 ^ m) före användning. Butikstvättbuffertar 1 och 2 vid 4 ° C för several månader. Bered tvättbuffert tre färska varje dag. Lägg till och ta bort tvättbuffertar från provet med en pipett. För 2 och 4, tillsätt 1 och 3 (5 mM), respektive i tvättarna. Prover kan dessutom tvättas två gånger med KOSMISK buffert (en gång 12 h, en gång 4 timmar) innan de tvättar som anges nedan.
    1. Tvätta en gång med tvättbuffert 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Tvätta en gång med tvättbuffert 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% natriumdeoxikolat). Tvätta två gånger med tvättbuffert 3 (4 M urea, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Tvätta två gånger med Tris-EDTA (TE) buffert (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspendera kulorna i 200 | il TE-buffert med en pipett. Detta prov av infångat DNA benämnes affinitetsrenat (AP) DNA.
  4. Komplettera Input och AP-DNA med 10x Crosslink Återföring buffert (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) till 1x slutkoncentration. 56,57 Inkubera 30 min vid 90 ° C.
    OBS: 254 nm UV-bestrålning kan även användas för att reversera psoralen-tvärbindning, 58 men cyklobutyl pyrimidin dimerer kan bildas av bestrålning vid denna våglängd och störa nedströms behandling av DNA.
  5. För AP-DNA, placera mikrocentrifugrör innehåller provet på magnetisk separation rack 2 min vid RT och isolering vätska (DNA) med en pipett. Överför AP-DNA (som har blivit befriad från pärlorna) till en ny bärnsten mikrocentrifugrör.
    OBS: Den önskade AP-DNA i den flytande, inte längre bunden till pärlorna.
  6. Neutralisera Ingång och AP-DNA med koncentrerad HCl till pH 7 genom tillsats av cirka 1 jil 6 N HCl per 100 | il prov med en pipett. Bekräfta proverna neutraliseras genom att tillsätta ~ 0,5 l på pH-papper med en pipett VARNING:. Koncentrerad HCI är en stark frätande syra. Hantera enligt din institution217; s riktlinjer för lämplig personlig skyddsutrustning.
  7. Lägg RNas A (100 mg / ml) till 0,2 mikrogram / l slutlig koncentration till både ingång och AP-DNA. Inkubera 1 h vid 37 ° C. Lägg proteinas K (20 mg / ml) till 0,2 mikrogram / l slutlig koncentration till både ingång och AP-DNA, lägga till. Inkubera 1 h vid 55 ° C.
  8. Rena DNA med en DNA-kolonn rensning kit (se Materials List). 55 Eluera DNA i 58 pl DNA-grade H2O Butiks Input och AP prover vid -20 eller -80 ° C
  9. Analysera AP DNA genom kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) med ställesspecifika primers, och / eller genom nästa generations sekvensering. För qPCR, använda 2 jil AP DNA per lokus med följande parametrar: 1 cykel av 95 ° C 10 min och 40 cykler av 95 ° C 20 sek, 54 ° C eller 56 ° C 20 sek, 72 ° C 40 sek.
    OBS: Glödgningstemperaturen bör modifieras i enlighet med smälttemperaturen av primerparen användes. Välj en glödgning tempere som minimerar kvantifiering cykeln utan ospecifik förstärkning.
    OBS: För analys av nästa generations sekvensering, sträva efter att minst 10 miljoner mappas läser. Antalet mappade läsningar kan ökas genom att öka mängden av AP-DNA och genom att kombinera färre prov till en körning för sekvensering. Mer läser förbättra känsligheten. Standardpaket för Chip-punkter analys (t.ex., Homer, 59 MACS, 60 och SPP 61) arbetar med cosmic-artiklar uppgifter. Som med andra metoder som förlitar sig på nästa generations sekvensering, inklusive genomsekvensering och Chip-punkter, repetitiva regioner skapar oklarheter i linje och montering och därmed förbli en teknisk utmaning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att beakta olikformig genomet fragmentering och andra variabler, bör den renade DNA alltid normaliserades mot en referens av Ingångs-DNA. Primrar som är specifika för ett lokus av intresse kan användas. Det är användbart att också analysera en lokus där molekylen inte förväntas binda, som en negativ kontroll. Vi ser en> 100-faldig ökning av polyamid beläggning vid bestrålning med 365 nm ljus (Figur 2).

Anrikat DNA kan också analyseras genom nästa generations sekvensering. DNA är förberedd för sekvensering på samma sätt som Chip-DNA framställs (t.ex. med ett kommersiellt prov prep kit, se Material List). Även med nästa generations sekvensering, fortfarande använder vi qPCR att bekräfta anrikning av DNA vid loci där vi förväntar oss att polyamid att vara bunden. När sekvens läser rå DNA anpassas till genomet och densitets spår är beredda med samma programvara som utformats för att analysera Chip-punkter data (Figur 3). Based på vår analys av polyamid distributioner i celler, fann vi att klustrade bindningsställen, som spänner över ett brett spektrum av tillhörighet, bäst förutsäga inflyttning i celler. Vi utvecklade en algoritm för att göra mål hela genomet för bindning med våra in vitro CSI data (Figur 4A). Denna scoringmetod avslöjade att olika genomisk lokus med liknande förutsagda bindnings poäng uppvisar de olika kluster av flera webbplatser med varierande affiniteter (Figur 4B).

Figur 2
Figur 2. Resultat av COSMIC-qPCR. Effekt av 365 nm UV-strålning på den del av AP / input från HEK293-celler. AP, affinitetsrenat. Resultaten plottas på log-skala och representerar medelvärde ± SEM

Figur 3
Figur 3. Resultat av COSMIC-punkter i H1-celler. COSMIC-punkter tag täthet spår för linjär polyamid 4 utformade för att rikta AAG upprepas. Tag täthet normaliserades till 10 7 taggar och visas med den integrerade Genome Viewer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Modell av polyamid bindande. (A) Violin tomter av förväntade betygen för 2 och 4 bindning över hela genomet. Representativa genomescapes för 4 visas också. Med den bioinformatik scoring metod som används, kan genom loci summerar till samma förutspådde poäng på olika sätt. (B) Loci med flera låg- och medelaffinitets sekvenser show liknande polyamid inflyttning till ställen med få hög affinitet sekvenser. Återges med tillstånd. 51 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Molecular Biology COSMIC CSI molekylär igenkänning cheminformatics kemiska genomik polyamid genom inriktning precision medicin DNA kromatin immunoprecipitation nästa generations sekvensering
Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter