Introduction
Равное разделение генома во время деления клетки требует правильных взаимодействий между ДНК и репликации микротрубочек веретена. Микротрубочки физически взаимодействовать с хромосомами через ансамбль белков, которые собирает в центромерах известных как кинетохорах 1. Правильное распределение хромосом требует сестра кинетохоры которые с двойной ориентацией, в которой каждый сестра связано с микротрубочками, происходящих из противоположных полюсов шпинделя. Кинетохор микротрубочек (кт-МТ) вложения, которые не в двойной ориентацией конформации быстро и эффективно дестабилизирована, чтобы обеспечить возможность установить biorientation в процессе, известном как исправление ошибок. Исправление ошибок анализа, который ранее был создан в клетках млекопитающих 5 требует сборки монополярных шпинделей с помощью обратимых низкомолекулярные ингибиторы против EG5 (кинезин-5). Лечение наркотиками порождает множество ошибочных syntelic вложений, в котором ботч сестра кинетохоры приложить к тому же полюса веретена. Последующее смыв препарата позволяет визуализации процесса коррекции ошибок. Исправление ошибок анализ может быть сделано в присутствии низкомолекулярные ингибиторы или нокдаун для изучения вклада кандидатов белков к исправлению ошибочных вложения кт-МТ.
Возможность визуализировать исправление ошибок в живых клетках является мощным инструментом для дальнейшего понимания молекулярного механизма, участвующих в этом сложном процессе. Тем не менее, большое количество хромосом, присутствующих в большинстве клеточных линий представляет собой вызов в наблюдении отдельных вложения кт-MT. Дрозофилы S2 клетки будут идеально подходит для применения коррекции ошибок анализа, поскольку они содержат всего лишь как 4 хромосомы 6, но низкомолекулярные ингибиторы кинезин 5, такие как S-тритил-L-цистеина (STLC) и monastrol 7-9 не влияет шпинделя в сборе или кинезин-5 моторную функцию в клетках дрозофилы. Поэтому мы родыТед клеточная линия дрозофилы S2 выражения человеческого кинезин-5 под индуцируемого промотора, чувствительного к кинезин-5 ингибиторов. Этот протокол описывает, как нокдаун эндогенной дрозофилы кинезин-5 гомолог, Klp61F, и использовать эту линию клеток в клеточной основе коррекции ошибок анализа.
Protocol
1. трансфекции Клетки S2
- Из ранее культивируемых 25 см 2 колбу, добавляют GFP-альфа-тубулина, экспрессирующих S2 клетках 10 до конечного объема 2 мл на 100% слияния, и дать им возможность полу-прилипать к нижней части 35 мм блюдо культуры ткани для приблизительно 1 ч.
- Выньте носители из чашки. Трансфекции 2 мкг Eg5-mCherry построить 11 с 1 мл среды Шнайдера с добавлением 10% FBS (далее обозначается как средства массовой информации Шнейдера), и реагента для трансфекции, в соответствии с протоколом производителя. Печать блюдо с парафильмом и инкубировать клетки при 25 ° С в течение 16-18 ч.
- Добавить 1 мл СМИ Шнайдера. Возврат клеток до 25 ° С инкубатор.
- На 3 день после трансфекции, передать 500 мкл трансфицированных клеток в новой 35 мм ткани блюдо культуры, содержащий 1,5 мл СМИ Шнайдера для индукции испытаний. Индуцируют экспрессию Eg5-mCherry, добавив CuSO 4
- Для того, чтобы покровные A-покрытием Конканавалин, пипетки достаточно объемные конконовалина раствор (0,5 мг / мл, растворенный в H 2 O), чтобы покрыть кислота мыть покровное, удалить избыток, и позволяют покровное высохнуть на воздухе.
- Поместите 22 мм х 22 мм конканавалин покровное A A покрытием в чистом 35 мм блюдо культуры ткани, а затем 500 мкл семян на 100% слияния индуцированных клеток на покровное и позволяют клеткам придерживаться в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Для проверки выражения Eg5-mCherry, собрать покровное в розовом камеры (или соответствующий изображения судна) со средствами массовой информации для визуализации при комнатной температуре на флуоресцентного микроскопа. Используйте соответствующие источники света и наборы фильтров для визуализации клеток. Например, микроскоп используется в данном исследовании обладает светодиодной источник белого света и EGFP (FITC / Су2) и Dsred (TRITC / Су3) фильтр кубов. Eg5-mCherry локализуется в микротрубочек и обогащается NEAг шпинделя полюса.
- Убедившись, что клетки экспрессируют как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина, передавать остаток трансфицированных клеток, неиндуцированных к 25 см 2 культуре ткани колбу, содержащую 4 мл среды Шнайдера.
- Добавить бластицидин S НСl при конечной концентрации 25 мкг / мл в колбу трансфицированных клеток и продолжают расщепление в присутствии 25 мкг / мл бластицидин S HCl до гибели клеток не перестает быть уверены, чтобы проверить на экспрессию Eg5-mCherry периодически. Выдержите клеточных линий в 25 ° C инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: процент клеток, экспрессирующих Eg5-mCherry увеличивается с течением времени. - После клетки, стабильно трансфицированные, по-прежнему разделены в отсутствие лекарства и заморозить 12 клеток для использования в будущем.
2. РНК-интерференция
- ПЦР амплификации ~ 500 б.п. область Klp61F из кДНК (LD15641) с использованием праймера с добавлением Т7 промотора (последовательность предоставленной в список материалов),используется в качестве матрицы для синтеза дцРНК.
- Установите четыре ПЦР реакции, 50 мкл каждый, содержащие 100 нг матричной ДНК, 25 мкМ каждого праймера, соответствующего буфера, и полимеразы. Установите протокол ПЦР на амплификаторе в соответствии с протоколом производителя полимеразной из отдела.
- Бассейн и чистые четыре ПЦР реакции с использованием ПЦР очистить комплект в соответствии с протоколом производителя. Хранить чистый шаблон при -20 ° С.
- Подготовка двухцепочечной РНК (дцРНК) из шаблона, используя набор транскрипции Т7 РНК, следуя инструкциям изготовителя. Ожидать ~ концентрацию 5-15 мг / мл дцРНК. Хранить дцРНК при -20 ° С.
- Чтобы Knockdown Klp61F с дцРНК, позволяют S2 клетки, экспрессирующие EG5-mCherry на 25% слияния на полу-прилипать к нижней части 35 мм чашки для культивирования тканей в течение 1 часа.
- Удалить носитель из блюд и добавить 5 мкг дсРНК против Klp61F (Drosophila кинезин-5), разбавленный в 1 мл сыворотки Шнайдер "с СМИ.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавить 1 мл СМИ Шнайдера с 10% FBS. Инкубируйте клетки при 25 ° С.
- 24 ч после обработки дцРНК, индуцируют экспрессию Eg5-mCherry добавлением CuSO 4 до конечной концентрации 500 мкМ. Инкубируйте клетки при 25 ° С в течение еще 24 ч.
3. живых изображений сотовый
- Поместите 22 мм х 22 мм Конканавалин покровное покрытием в чистую 35 мм блюдо культуры ткани.
- Семенной 500 мкл клеток, которые были обработаны с дцРНК и индуцированных O / N на покровное покрытием конканавалин А и позволить им следовать в течение приблизительно 1 ч.
- Соберите покровное в розовом камеры (или соответствующий сосуд) для визуализации.
- Найти митотических клеток, экспрессирующих как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина.
ПРИМЕЧАНИЕ: делящихся клеток, экспрессирующих GFP-только альфа-тубулина должны монополярных шпинделей, так как Klp61F, который необходим для шпинделя биполярности, сбит 10,13, - Соберите покадровой изображения биполярных веретен (например, 1 кадр в минуту) в клетках, экспрессирующих как EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина.
- В то время как изображения, извлекайте носитель из роз камеры, и заменить его со средствами массовой информации, содержащий Шнайдера 1 мкм STLC в течение 3 последовательных обменов СМИ (~ 5 мл всего) в камере для визуализации крах шпинделя.
- Для вымывания препарата и обратить вспять крах шпинделя, тщательно удалить STLC содержащих носители из роз камеры, и мыть в СМИ Шнайдера 4x (всего 6-8 мл) перед заправкой роза палату в последний раз свежей средой. Продолжить изображений.
4. Коррекция ошибок Анализ
- Поместите 22 мм х 22 мм с покрытием Конканавалин покровные в чистые 35 мм чашках для тканевых культур.
- Семя 500 мкл клеток, которые были обработаны с Klp61F дсРНК на покровное покрытием конканавалин A и позволяют им придерживаться.
- После клеток ADHERред добавить 1,5 мл среды Шнайдера в каждую чашку, чтобы довести до конечного объема до 2 мл.
- Чтобы задержать клетки в митозе, добавить MG132 до конечной концентрации 10 мкМ каждого из блюд, и инкубируют в течение 1 часа.
- Добавить 1 мкм STLC и инкубировать в течение 1 часа, чтобы дать монополи в форме.
- Промыть STLC путем промывки 3x покровные 2 мл свежей среды Шнайдера каждый раз.
- Выдержите покровные со СМИ Шнайдера в дополнение к любым фармакологических препаратов (например, ингибиторы киназы Aurora) или ДМСО в качестве контроля.
Примечание: концентрации ингибитора изменяются и соответствующие конечные концентрации должны быть определены экспериментатором. Исходные растворы обычно изготавливают таким образом, что ингибитор разводили 1: 1000 в средствах массовой информации. В этом случае разведение 1: 1000 (ДМСО или подходящем растворителе) служит контролем-носителем. Мы используем B ингибитор Аврора Binucleine 2 при конечной концентрации 40 мкМ. - Fix клетки в различные моменты времени TО наблюдать прогрессирование формирования биполярного веретена и оценить крепления кинетохор государства. Исправить:
- Быстро промойте покровные с 2 мл 1x BRB-80.
- Исправление клетки добавлением 2 мл 10% параформальдегида, разведенного в 1x BRB-80 в течение 10 мин. Внесите параформальдегиде тщательно в химической капотом.
- Проницаемыми клеток по 2 мл PBS + 1x 1% Triton-X в течение 8 мин.
- Промыть 3 раза скользит по 2 мл PBS + 1x 0,1% Triton-X.
- Передача покровные клетки стороны лицом вверх на лист парафильмом (использовать маркер, чтобы пометить парафильм надлежащим образом следить за слайдов) в 150 мм чашки Петри.
- Обложка покровные с 150 мкл сыворотки осла вареные (BDS) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы блокировать неспецифическую связывания антитела.
Примечание: Здесь, протокол фиксации может быть остановлен будет продолжено на более позднем этапе. Покровные могут быть сохранены в камере влажности при температуре 4 ° С в течение до 24 часов. Для того, чтобы камеру влаги, выравнивают обод 150 мм блюдос мокрой лаборатории протрите и покройте блюдо крышкой на Петри. - Удалить блок, и инкубируют покровные в течение 1 часа при комнатной температуре с 150 мкл первичных антител разводили надлежащим образом в BDS для окрашивания для кинетохорами и микротрубочек до конечных концентраций 2 мкг / мл (или в соответствии с рекомендациями производителя) и 1 мкг / мл, соответственно ,
Примечание: Здесь, протокол фиксации может быть остановлен будет продолжено на более позднем этапе. Покровные могут быть сохранены в камере влажности при температуре 4 ° С в течение до 24 часов. - Промыть покровные 3x 500 мкл 1X PBS + 0,1% Triton-X.
- Инкубируйте покровные в течение 30-60 мин при комнатной температуре с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами разводят в BDS.
- Промыть покровные 3x 500 мкл 1X PBS + 0,1% Triton-X.
- Инкубируйте покровные 150 мкл, содержащих BDS 1 мкг / мл DAPI конечной концентрации в течение 5 мин.
- Вымойте покровные 2x с PBS 1x + 0,1% Triton-X, и смонтировать Coverslips сторона ячейки вниз на 3x1 "слайд с 8 мкл монтажа средств массовой информации. Краска углы ногтей, чтобы обездвижить покровные на слайды.
- Клетки Изображение с биполярным шпинделей, которые, выражающих EG5-mCherry. Возьмите Z серии, состоящей из 30 самолетов на 0,2 мкм интервалы во всех каналах, используя цель 100X. Тщательно проанализировать кинетохоры и микротрубочки, чтобы определить, крепежные состояния (с двойной ориентацией или syntelic вложения).
Representative Results
Klp61F требуется для формирования биполярных веретен. Человек кинезин-5, Eg5, может спасти функцию Klp61F в дрозофилы S2 клетках (рис 1а и D). При добавлении кинезин-5 ингибитор (STLC), микротрубочки связаны уровни падения двигателя (рис 1B и E), и обвалов шпинделя, в результате монополя (рис 1С и F) в клетках не хватает эндогенного Klp61F после успешного РНК-интерференции (Справочная фильм 1). Следует отметить, что биполярные веретена разрушаться при добавлении STLC в гуманизированных клеток S2, поскольку кинезин-5 Активность не требуется для поддержания шпинделя двуполюсность в клетках человека. Это интересно расхождение может быть результатом различий в межполюсном микротрубочек перекрытия и / или стабильности в двух модельных систем 14. Кинезин-5 Ингибирование (фиг.2А и Е) может быть rêve rsed вымывая препарат и восстановление биполярной шпинделя может следовать в течение долгого времени. После удаления ингибитора (рис 2B и F), Eg5-mCherry повторно ассоциируется с микротрубочками как биполярный шпинделя сборок (рис 2С и G), и клетки могут развиваться в биполярный анафазе (рис 2D и H, Справочная фильм 2 ).
Рисунок 1. Добавление 1 мкМ STLC приводит к монополярной шпинделей в дрозофилы S2 клеток. Представитель изображения с покадровой визуализации ячейки дрозофилы S2, выражающей Eg5-mCherry (AC) и GFP-альфа-тубулина (DF) в течение того 1 мкм STLC. Eg5 ингибитор был добавлен в 3 мин. Масштаб бар = 5 мкм. Отметка = мин: сек. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. биполярного веретена реформы при удалении STLC. Типичные изображения из покадровой визуализации в дрозофилы 2 клетки, экспрессирующие EG5-mCherry (AD) и GFP-α-тубулина (EH) во время эксперимента STLC вымывания. STLC промывают на 5 мин. Биполярного реформы шпинделя в пределах 1 часа от удаления STLC. Масштаб бар = 5 мкм. Отметка: мин.: Сек Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "целевых =" _blank "> Справочная Фильм 1. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). флуоресценции изображений с широким полем зрения представительной например клетки дрозофилы S2, выражающей EG5-mCherry ( слева) и GFP-α-тубулина (справа). 1 мкМ STLC был добавлен в 2 мин, а формы шпиндель монопольный течение 10 мин после добавления ингибитора. Изображения были получены каждые 1 мин и играл в размере 10 кадров в секунду. Масштаб бар = 5 мкм.
Справочная Фильм 2. (щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать). Флуоресценции Широкопольный изображений представительного например клетки дрозофилы S2, выражающей EG5-mCherry (слева) и GFP-альфа-тубулина (справа). Медиа содержащие 1 мкм STLC удаляли ипромыть в 5 мин. Биполярного реформы шпинделя в пределах 1 часа удаления ингибитора. Изображения были получены каждые 1 мин и играл в размере 10 кадров в секунду. Масштаб бар = 5 мкм.
Discussion
Визуализация коррекции ошибок является ценным методика исследования этапы в этом важном и сложном процессе клеточного. Чтобы сделать это, ошибочные вложения генерируется с использованием обратимыми ингибиторами, и исправление ошибок наблюдается при вымывания препарата. Этот анализ был первоначально разработан с использованием ткани млекопитающего культуры клеток 5. Однако наличие большого числа кинетохорами во многих модельных типов клеток млекопитающих представляет собой вызов в наблюдении отдельных событий коррекции ошибок. Дрозофилы S2 клетки обладают, как мало, как 4 пары кинетохорами, что делает их более предпочтительным клеточную линию для наблюдения коррекции ошибок. Однако основным недостатком является то, что многие ингибиторы неэффективны в Drosophila S2 клетках. Таким образом, способность генерировать гуманизированного клеточную линию клетки Drosophila S2, экспрессирующих человеческий кинезин-5 представляет собой ценный инструмент для изучения коррекции ошибок.
Хотя дрозофилы S2 клетки могут бытьлучше клеточной линии для изучения коррекции ошибок, несколько шагов, участвующих в получении клеточной линии и сбить существенные гены создает некоторые проблемы в этой технике. Например, эффективность трансфекции может быть достаточно низким. Если менее 20% клеток выражают EG5-mCherry, трансфекции следует повторить, как процесс отбора будет длиться дольше. Кроме того, процент клеток, экспрессирующих обе флуоресцентные белки могут уменьшаться с течением времени. Эту проблему можно решить путем разделения клеток в присутствии бластицидин S HCl и гигромицина, чтобы выбрать для клеток, экспрессирующих EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина, соответственно. Важно также отметить, что дрозофилы S2 клетки имеют ортологи на многие белки человека и, Поэтому, важно, чтобы оптимизировать нокдауна условия для эндогенных белков. Оптимальные условия могут варьироваться нокдаун в размере дцРНК и продолжительности лечения. Учитывая появление и быстрое улучшение CRISPR-Cas9 TECHNOLOGIES 15-17, генерация клеточной линии Drosophila с геном Klp61F заменен человека EG5 представляет мощную альтернативу, которая бы преодолеть ограничения трансфекции и бросовой подхода. Наша работа показывает, что муха к человеку замены гена должны быть жизнеспособным вариантом в этом случае, хотя необходимые реагенты, чтобы сделать это в дрозофилы S2 клеток в настоящее время разрабатываются.
Эта процедура не ограничивается EG5, но могут быть применены для изучения функции других белков, представляющих интерес. При использовании ингибиторов, которые ранее были установлены, чтобы быть неэффективным в дрозофилы S2 клеток, этот протокол может быть изменен, чтобы изучить прямое действие ингибиторов в живых клетках без озабоченности мимо ворот эффектов. Клеточная линия, полученные с использованием этого протокола, также могут быть использованы в высокопроизводительного скрининга анализа для идентификации потенциальных лекарств, направленные белки, участвующие в коррекции ошибок.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Патрицию Уодсворт за дар от кинезин-5 конструкции. Эта работа была поддержана грантом NIH в (5 R01 GM107026) для TJM и научно-исследовательский грант № 5-FY13-205 от марта Dimes фонд в TJM, а также поддержки со стороны Чарльза Х. Гуд Foundation, Inc., Бостон, Массачусетс. чтобы TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A.
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
