Introduction
El concepto de la activación inmune materna (MIA) se origina a partir de los estudios epidemiológicos sobre la asociación de la infección materna con el autismo y la esquizofrenia 1. Debido a la ausencia de patógenos virales de replicación detectables en la placenta o el cerebro del feto después de la infección viral de la madre 2,3, el efecto de la infección en la descendencia es la hipótesis de que es causada por la activación del sistema inmune materno en lugar de los propios patógenos .
Para dilucidar la relación causa-efecto entre MIA y los trastornos psiquiátricos, la inyección de sintetizado químicamente, virales imitan doble poliinosínico ARN de cadena: ácido policitidílico (poli (I: C)) en roedores embarazadas ha sido ampliamente utilizado como modelo animal para el MIA 4,5. Poli (I: C) es reconocida por los receptores Toll-like 3 (TLR3), y la administración sistémica de poli (I: C) induce la respuesta inflamatoria aguda de tipo vírico. Uno de los mecanismos por los que el poli (I: C) produces anomalías conductuales y neuropatologías en la descendencia es al causar un desequilibrio de las citocinas inflamatorias favor y en contra en el eje materno-fetal de la placenta-6. Varios grupos han adoptado el modelo de MIA de entender la etiología de los trastornos psiquiátricos 7, y debido a la diversidad de intereses entre grupos de investigación, varios puntos de tiempo de la activación inmune se han utilizado para conseguir diferentes perturbaciones en el desarrollo del cerebro y los comportamientos 7.
El laboratorio de Paul H. Patterson en el Instituto de Tecnología de California adopta la estrategia de inyección de poli (I: C) en ratones embarazadas en embriones de 12,5 días (E12.5), que ha demostrado con éxito que MIA es capaz de inducir comportamiento, neurológicos, y cambios inmunológicos en la descendencia que están asociados con el autismo y la esquizofrenia 8-11. Nuestros trabajos anteriores muestran que MIA descendencia mostrar anormalidades de comportamiento (por ejemplo, impairmen socialest, déficit de comunicación, comportamiento repetitivo, un comportamiento similar a la ansiedad, y la inhibición latente déficit 8,10,12), la desregulación inmune y citocinas desequilibrio 8,13,14, alteración de la expresión de genes del cerebro fetal al 15, la pérdida de células de Purkinje en el lóbulo VII del cerebelo 11, alteración de las propiedades sinápticas en el hipocampo 9, la interacción gen x ambiente 13, la alteración de la permeabilidad del intestino, y la composición de la microbiota intestinal 16. Además, las estrategias terapéuticas y profilácticas también se desarrollan a partir de este 13,16,17 sistema modelo. Mediante la inducción de MIA en E12.5, otros han demostrado que MIA produce la activación microglial fetal y alteración del desarrollo colinérgica en el cerebro anterior basal 18, la interacción cepa específica 19, cerebro sinaptosomales cerebral anomalías ultraestructurales, cerebrales mitocondriales respiratorias abnormalties hiperfunción cadena, regulación a la baja de moléculas sinaptosomales cerebrales 17 ,comportamientos de tipo depresivo, deterioro en la cognición y del hipocampo potenciación a largo plazo (LTP), y el déficit de la neurogénesis del hipocampo adulto 20.
Aquí, se proporciona un método detallado de cómo inducir MIA en E12.5 por poli (I: C), así como paradigmas de cómo aplicar este modelo para estudiar la etiología de autismo y la esquizofrenia. Es importante señalar que MIA es un factor de riesgo para una variedad de trastornos 4, y sus resultados son extremadamente sensibles a la hora y el método de inducción, así como la cría de las presas embarazadas. Como tal, incluso pequeñas incongruencias entre los laboratorios a menudo resultan en una baja reproducibilidad y / o diferentes fenotipos en la descendencia. Nuestro método está diseñado específicamente para los interesados en el estudio de MIA como un factor de riesgo ambiental para el autismo y la esquizofrenia, y la descripción detallada proporcionada ayudará a los investigadores a mejorar la reproducibilidad de sus datos.
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Protocol
Todos los protocolos se realizaron bajo la aprobación del California Institute of Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Tecnología (IACUC).
1. Preparación de pares de temporizado de apareamiento
- Use por lo menos 6 presas para los experimentos de comportamiento y 3 para el análisis de la expresión génica.
NOTA: Utilice el doble del número de ratones hembras estimados, ya que sólo alrededor del 50% de los ratones se conecta desde la cronometrada de apareamiento. - Utilice ratones femenino sin embarazo antes y en 8-16 semanas de edad.
NOTA: Los ratones hembra que tiene la exposición sexual antes de los ratones machos, pero no han estado embarazadas son aceptables. - Casa los ratones hembra juntos y coloque las jaulas junto a la otra con el fin de sincronizar su ciclo estral. Utilice una jaula de ratones estándar con una altura de más de 5,5 pulgadas y un piso interior 75 pulgada cuadrada para permitir la vivienda de 5 ratones adultos. Etiqueta de cada ratón hembra usando un punzón oreja.
2. La creación de temporizado-matING Par
- Configurar el cronometrado de apareamiento 0-2 horas antes de que comience el ciclo de oscuridad. Coloque dos ratones hembra en cada jaula. Sacar los ratones y pesarlos individualmente. Anotar el peso corporal de cada ratón hembra.
- Coloque un ratón macho en cada jaula con los dos ratones hembra. Utilice el apareamiento trío para minimizar el efecto de confusión paterna.
3. Comprobar tapón vaginal (E0.5)
- Compruebe la hembra ratones 0-4 horas después de que termine el ciclo de oscuridad. Levante con cuidado el ratón hembra de la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula.
- La búsqueda de signos de tapón vaginal: tapón vaginal es una masa blanquecina visible en la abertura vaginal. Si el enchufe no es evidente, introduzca suavemente una punta de pipeta de 200 l en la abertura vaginal. La resistencia de la coagulación confirma la formación del tapón vaginal. Compruebe el tapón vaginal una vez al día.
NOTA: tapón vaginal sólo es una indicación de que se ha producido la copulación, y por lo tanto no guarantee el embarazo. tapón vaginal puede ser difícil de identificar en ciertas cepas de ratones. Busque la ayuda de un cuidador ratones con experiencia para aumentar la precisión de la identificación de enchufe. - Mover los ratones conectados a una nueva jaula y el grupo de vivienda para ellos. Definir el día de la aparición tapón vaginal como embrionarias 0,5 días (E0.5).
4. En E10.5-11.5, verificar si está embarazada
- levante suavemente la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula. Observe el área del abdomen para verificar si hay signos de embarazo, por ejemplo, una protuberancia en el abdomen (Figura 1).
NOTA: El signo de embarazo es siempre más evidente que en E11.5 en E10.5. - Pesar los ratones para verificar el embarazo. El ratón embarazadas generalmente pesa alrededor de 20% más pesado en E10.5 y un 30% más pesado en E12.5 en comparación con un ratón que no está embarazada (Figura 2). Sola casa los ratones embarazadas en jaulas limpias.
5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparación
- Use por lo menos 6 presas por grupo para los experimentos de comportamiento y 3 por grupo para el análisis de la expresión génica. Preparar la cantidad correspondiente de poli (I: C) solución.
- Pesar el poli (I: C) en polvo en un tubo cónico de 50 ml para hacer una concentración final de 40 mg / ml. Con el fin de minimizar y estandarizar el estrés causado por el volumen de inyección, inyectar 5 l de poli (I: C) solución para cada gramo de peso corporal de ratón (5 l / g, o 5 ml / kg). Para inducir la MIA, inyectamos 20 mg de poli (I: C) por kg.
NOTA: La concentración de poli (I: C) solución necesaria es (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Puesto que el poli (I: C) polvo contiene 10% de poli (I: C), tenemos que hacer una concentración final de (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml de poli (I: C) solución.
PRECAUCIÓN: El poli (I: C) en polvo es muy ligero. Tenga cuidado de no perder ninguna de polvo durante la transferencia de la espátula para el tubo cónico. - Añadir el volumen correspondiente de cloruro de sodio 0,9% (solución salina) en la bañera cónicae y cerrar la tapa. Disolver el polvo rodando suavemente la gota de solución salina sobre el poli (I: C) en polvo hasta que la solución es clara. Centrifugar el tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtrar el poli (I: C) solución por 0,22 micras filtro. Transferir el poli (I: C) solución a un tubo de 1,5 o 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Utilice un espectrofotómetro para medir la relación 260/280 de la poli (I: C) solución. Asegúrese de que la relación es de entre 1,54 a 1,82 (Figura 3) como se describe por el fabricante. NOTA: La solución salina utilizado para disolver el poli (I: C) en polvo y servir como control de la inyección debe ser de grado estéril y farmacéutica.
6. Saline o poli (I: C) Inyección en E12.5
- Pesar el ratón sobre la escala y ponerlo de nuevo en la jaula. Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de la inyección tanto para la solución salina y poli (I: C) ratones: el peso corporal (g) multiplicado por 5 = volumen de inyección deseado (l). Use un Insul 0,3 mlen la jeringa para extraer el volumen calculado de solución salina o 20 mg / kg de poli (I: C) solución, por ejemplo, 150 ml para un ratón de 30 g.
- recoger suavemente hacia arriba el ratón por la base de la cola y colocarlo en la parte superior de la jaula. Manejar el ratón con cuidado para evitar confusión efectos inducidos por el estrés. Insertar la aguja, bisel hacia arriba, aproximadamente a 20 ° en relación con el ratón en el centro de sus dos pezones superior (Figura 4), e inyectar la solución salina o poli (I: C) solución. NOTA: La aguja debe ser reemplazado para cada ratón después de la inyección.
- Coloque el ratón de nuevo a su jaula. Colocar las jaulas en una habitación tranquila tráfico, baja para evitar los efectos de confusión de otros.
7. El día de poli (I: C) Inyección (E13.5)
- Compruebe los ratones inyectados a la mañana siguiente. Utilice una escala para medir el peso corporal.
NOTA: El poli (I: C) inyectado ratones embarazadas por lo general ganan menos peso que los ratones solución salina inyectada en el día después injexión. - No moleste a los ratones hasta que nacen las crías.
8. Captador de la MIA Offspring
- Con el fin de minimizar los efectos de confusión de la inducción MIA, sigue las instrucciones que figuran a continuación para medir el uso de MIA descendencia.
- Excluir las camadas de nacimiento prematuro o tardío, o si el tamaño de la camada es menor que 5.
- La eutanasia de los cachorros excesivas de CO2 si el tamaño de la camada es mayor que 10.
9. Opcional: Examine la respuesta inflamatoria aguda Después de MIA
- Sacrificar el embarazo los ratones 3 horas después de la solución salina o poli (I: C) de inyección utilizando el método descrito en el protocolo aprobado por comité de cuidado de los animales de la institución.
NOTA: La dislocación cervical a menudo se prefiere ya que minimiza el efecto de las drogas de CO 2 / eutanasia en la presa y el embrión. - Se recoge el bazo de los ratones gestantes adultas y aislar la placenta y el feto sujetadoren menos del microscopio estereoscópico.
- Para la recolección de bazo, poner el ratón sobre la placa de disección y rociar 70% de etanol en la zona abdominal de los ratones embarazadas. Use un par de tijeras estériles para hacer un corte vertical en el centro de la zona abdominal por debajo de la caja torácica a través de la piel.
- El bazo se encuentra en el cuadrante abdominal superior, izquierda. El uso de fórceps para aislar el bazo. Enrollar el bazo de limpiaparabrisas tarea delicada para eliminar el tejido graso alrededor del órgano. Recoger aproximadamente 50 mg de tejido esplénico y colocarlos individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizar tampón o TRIzol para evitar la degradación de ácidos nucleicos. Almacenar las muestras a -80 ° C congelador hasta su uso.
- Para la recolección de la placenta, tire suavemente de los cuernos uterinos del cuerpo. Coloque los cuernos uterinos en una placa de Petri llena de solución salina de fosfato tamponada esterilizada en autoclave (PBS) y dejar el plato en hielo. Use dos pinzas para rasgar la pared uterina y exponer el saco amniótico.
- Con cuidado, usar las pinzas para abrir el saco amniótico sin dañar la placenta y el feto. Separar la placenta del feto y cortar el cordón umbilical tan cerca de la placenta como sea posible. Eliminar los restos saco amniótico de la placenta. Coloque la placenta individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso.
- Para la recolección de cerebro fetal, almacenar el feto en el ARN a estabilizar tampón de la etapa 9.2.2 hasta la disección. Se burlan de la membrana pial desde el ventrículo del cerebro utilizando delicados # 5 fórceps bajo el microscopio estereoscópico. Retirar con cuidado toda la membrana del cerebro del feto. Coloque los cerebros fetales individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso.
- Extraer el ARN a partir del tejido y convertir el ARN en ADNc. Analizar la expresión del gen IL-6 en el ADNc de real-time PCR.
- Extraer el ARN de los tejidos siguiendo el protocolo fabricación de TRIzol. Si los tejidos se almacenan en tampón de estabilización de ARN. Descongelar la muestra y centrifugar la memoria intermedia. Transferir el tejido de punta a otra Eppendorf con 500 l TRIzol y continuar la extracción de RNA.
- Use un espectrofotómetro para medir la concentración, 260/280 y 260/230 relación del ARN. Asegúrese de que las relaciones son por encima de 2,0.
- Eliminar la contaminación de ADN por tratado el ARN con ADNasa I. Mix RNA 1 g, tampón de reacción de 1 l 10X, 1 l de DNasa libre de RNasa, y agua libre de nucleasa a un volumen final de 10 l. Incubar la mezcla maestra a 37 ° C durante 30 min. Añadir 1 l de solución de parada DNasa para terminar la reacción. Incubar la mezcla a 65 ° C durante 10 min.
- Transcripción inversa del ARN en ADNc. Utilice reacciones de 20 l, y de hasta 1 g de ARN total por reacción. Mezclar 4 l de tampón de transcripción (RT) de la mezcla de reacción 5x revertir, 1 l reverse transcriptasa, 11 l plantilla de ARN después del tratamiento con DNasa I y 4 l de nucleasa libre de H2O para obtener una solución final de 20 microlitros. Programar las condiciones termociclador para RT. Una condición genérico incluye: Paso 1: 25 ° C durante 5 min; Paso 2: 42 ° C durante 30 min; Paso 3: 85 ° C durante 5 min; Paso 4: mantener a 4 ° C. Diluir el cDNA 5 veces. Para el almacenamiento a corto plazo, almacenar el ADNc a 4 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, congelar el cDNA a -20 ° C.
- Analizar la expresión del gen IL6 en el ADNc mediante PCR en tiempo real y normalizar la expresión del gen IL6 a ß-actina de la expresión génica.
- Hacer una mezcla maestra para la IL-6 y la detección de β-actina. Utilice 25 l de reacción, la mezcla maestra para cada gen incluye 12,5 l SYBR Green Mix, 0,5 l de cebador directo 10 M, 0,5 l de 10 mM cebador inverso y 6,5 l de nucleasa libre de H 2 O.
- Coloca 5 l 5x ADNc diluida unat el fondo del pozo de placa de reacción óptica de 96 pocillos. Pipetear 20 l de mezcla maestra a cada pocillo para hacer un 25 l final de mezcla de PCR. Por triplicado cada gen para cada muestra. Sellar la placa con película adhesiva óptica. Centrifugar la placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C Utilice el programa estándar de PCR en tiempo real: Paso 1: 50 ° C durante 2 min; Paso 2: 95 ° C durante 10 min; Paso 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y la temperatura de 60 ° C durante 1 min. Añadir un paso adicional para la curva de disociación.
10. Examine las anormalidades de comportamiento en Offspring MIA adulto (Opcional):
- Llevar a cabo las pruebas de comportamiento en las edades de 8-12 semanas. Cambiar la ropa de cama jaula de al menos 3 días antes de la prueba. Aclimatarse a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento al menos 30 minutos antes de la prueba.
- Para la inhibición prepulso (PPI), restringir los ratones en cilindros de plexiglás con un sensor piezoeléctrico por debajo de ella. Aclimatarse a los ratones a la PPIcámara de 5 min. Exponer a los ratones con 6 ensayos de 120 dB de ruido blanco (sobresalto).
- A continuación, exponer a los ratones con mezclas aleatorias de 14 ensayos de ruido de fondo, 14 ensayos de sobresalto, 14 ensayos de prepulso 5 dB (5 dB mayor que el ruido de fondo) + sobresalto (PPI5), y 14 ensayos de prepulso 15 dB (15 dB más altos de ruido de fondo + de sobresalto (PPI15).
- Promediar la respuesta de sobresalto durante los 6 primeros ensayos de 120 ensayos dB. Promediar la respuesta de sobresalto para los otros estímulos individuales. Convertir el valor a la inhibición prepulso por (sobresalto - PPI5 o PPI15) / sobresalto.
- Para la prueba de campo abierto, coloque el puntero del ratón en la esquina de un espacio cuadrado abierto (50 x 50 x 50 cm 3). Registrar la trayectoria del ratón durante 10 min a través de una cámara montada techo. Definir el centro de la arena como la zona central (17 x 17 cm 2). Cuantificar la distancia recorrida, las entradas de la zona central, y el tiempo transcurrido en la zona central de forma manual o mediante software de análisis automático basado en imágenes. Para la prueba de enterramiento de esferas, ambientar el ratón a una jaula de ensayo con, limpio, ropa de cama de pino Aspen profundidad de 5 cm comprimido durante 10 minutos. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su homecage. Con cuidado, coloque 20 de color azul marino de 1,5 cm de diámetro canicas de vidrio en la moda de 4 x 5 arreglo. Coloque el ratón de nuevo a la jaula de ensayo con mármoles durante 10 minutos. Contar los mármoles que ha sido enterrados en la duración del ensayo de 10 min.
11. Examine el cerebelosa Neuropatología en la descendencia MIA Adultos (Opcional):
- La eutanasia a la solución salina y MIA hijos adultos por anestesia. Perfundir el ratón con 50 ml de PBS y posteriormente 50 ml de paraformaldehído al 4% a través del sistema cardiovascular.
- Retire cuidadosamente el cerebro y Postfix el cerebro en 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 DO. Enjuague el cerebro con PBS tres veces y almacenar el cerebro en PBS con azida de sodio 0,02% en una nevera C 4 ° hasta su uso.
NOTA: El cerebro se fijaron posteriormente se puede almacenar en PBS con 0,02% de SODazida io en la nevera hasta por un mes. - Sección del cerebro en 50 micras rodajas finas sagittally usando vibratome. Recoger las secciones del cerebro usando un pincel suave. Terminar la actividad de peroxidasa endógena por incubación de las secciones en peróxido de hidrógeno 0,6% durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones de anticuerpo anti-calbindin diluida en el tampón de bloqueo (suero de cabra al 10% con azida de sodio 0,1% de Triton X-100 y 0,02% en PBS) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación incubar las secciones en correspondiente anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Se incuban las secciones en DH avidina - tampón complejo H peroxidasa biotinilada para detectar la biotina durante 1 hora a temperatura ambiente. Desarrollar las secciones mediante el uso de sustrato de peroxidasa para visualizar el antígeno. Se lavan las secciones con PBS tres veces entre los pasos. Montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Imagen de las secciones bajo el microscopio.
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Representative Results
La inyección de 20 mg / kg de poli (I: C) en E12.5 podría evocar una respuesta inflamatoria aguda en el eje-materno-fetal de la placenta y precipitar un efecto crónico para el desarrollo del cerebro y fenotipos conductuales 12,13. Los niveles elevados de una citoquina proinflamatoria, interleuquina (IL) -6, es un indicador fiable de la respuesta inflamatoria aguda después de MIA. El tiempo máximo para la expresión del gen IL-6 en la placenta y el cerebro fetal es a las 3 horas después de la poli (I: C) de inyección de 12,13. Hemos demostrado que el poli (I: C) induce una mayor expresión del gen IL6 a través del cerebro bazo-placenta-fetal materna (Figura 5) (datos adaptados de Wu et al, 2015). 13. Los investigadores podrían combinar este paradigma con otro tratamiento para estudiar los factores que podrían alterar la respuesta inflamatoria aguda después de MIA, por ejemplo, las dietas maternas, los ratones mutantes genéticos, los fármacos anti-inflamatorios, etc.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Por otra parte, los cambios de comportamiento también son señas de identidad de la modelo de MIA Varias pruebas de comportamiento pueden llevar a cabo en la descendencia adulta MIA para demostrar diferentes autista y esquizofrénica similar. comportamientos. por lo general, cuando se compara a la descendencia solución salina, MIA crías muestran un menor número de entradas de la zona centro y una duración más corta zona centro pasados en la prueba de campo abierto. además, muestran comportamientos enterramiento más frecuentes en el enterramiento de esferas de prueba y PPI inferior (Figura 6) (datos adaptados de Wu et al., 2015) 13. la pérdida de células de Purkinje en el lóbulo cerebelo VII es otro sello distintivo de MIA descendencia (Shi et al., 2009). Cuando se tiñeron con anticuerpos calbindina, hay menos células de Purkinje calbindina-positivo en el cerebelo lóbulo VII de MIA descendencia en comparación con la descendencia control de solución salina (Figura 7).3643 / 53643fig1.jpg "/>
La Figura 1. La señal de ratones embarazadas. Ratón mitad de la gestación se puede identificar por el bulto en su área de abdomen (flecha). Endogámica cepa de ratón C57BL / 6 se utiliza aquí como ejemplo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. alteraciones del peso corporal en ratones C57BL / 6N embarazadas de embriones (E) 0.5-12.5 días. Al comparar los ratones embarazadas y no embarazadas con tapones vaginales presentes en E0.5, la (A) el peso corporal y (B) porcentaje del peso corporal se somete a un aumento dramático en E10.5 en ratones embarazadas. Embarazada n = 10, no embarazadas n = 5. Los datos se presentan como media ± SE. *** P <0,001, ****p <0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Medición de la absorbancia de poli (I: C).. Asegúrese de solución de la relación 260/280 es de entre 1,54 a 1,82 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El poli (I: C) de inyección en embriones (E) 12,5 días Scruff el ratón embarazada suavemente.. El sitio de inyección se encuentra en el punto medio de los pezones superiores. Se inyecta la aguja, bisel hacia arriba, aproximadamente a 20 ° ángulo en relación con el ratón. endogámica C57BL / 6 cepa de ratón se utiliza aquí como ejemplo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. El poli (I: C) de inyección aumenta la expresión del gen IL-6 en el eje cerebro-bazo fetal de la placenta de la presa Los datos se presentan como media ± SEM.. * P <0,05, ** p <0,01 (los datos son originalmente de Wu et al., 2015 y modificado por el artículo 13). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. & #160;. MIA hijos adultos presentan anormalidades de comportamiento asociados con los endofenotipos de autismo y la esquizofrenia En la prueba de campo abierto, MIA descendencia (A) entran en la zona centro con menos frecuencia y (B) pasar menos tiempo en la zona central. (C) En la prueba de enterramiento de esferas, MIA descendencia enterrar más canicas que la resultante solución salina de control. MIA descendientes exhiben inhibición prepulso déficit (PPI) en (D) prepulso 5 dB y (E) prepulso 15 dB. La media ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Los datos son originalmente de Wu et al., 2015 y modificado por el artículo 13). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. MIA Hijo adulto exhiben anormalidades neuropatológicas asociadas con los endofenotipos del autismo. La pérdida de células de Purkinje en lóbulo VII se ha demostrado en MIA descendencia adulta. Flecha: células Calbindin + Purkinje. ML: capa molecular, GCL: capa de células granulares, PCL:. Capa de células de Purkinje Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
MIA inducción en diferentes ventanas de tiempo perturba diferentes eventos de desarrollo cerebral en roedores, y por lo tanto conduce a diferentes alteraciones del comportamiento y neuropatologías en la descendencia. Aquí, se describe un protocolo para inducir MIA en ratones con poli (I: C) de inyección en E12.5. Este método de inducción MIA conduce a comportamiento, neurológicos, inmunológicos y alteraciones gastrointestinales asociados con el autismo y la esquizofrenia en la descendencia 8,10,11,16. Es importante tener en cuenta que, debido a MIA es un factor de riesgo ambiental, se espera que el fenotipo de la descendencia de tener variación más alta que la de los ratones de los modelos genéticos de trastornos del neurodesarrollo. Por lo tanto, para generar con precisión y consistentemente el autismo y fenotipos relacionados con la esquizofrenia a través de MIA, es especialmente importante para reducir al mínimo las variables adicionales que pueden confundir los resultados.
La línea de tiempo establecido en el protocolo debe ser seguido de cercaLy. ventana de tiempo de inyección correcta garantizaría que MIA perturba el desarrollo de las crías del cerebro en la fase deseada. La inducción de MIA en E12.5 en ratón corresponde a las perturbaciones cerca del final del primer trimestre de la gestación humana 21 - un período durante el cual se produce el desarrollo del cerebro significativo, incluyendo el desarrollo de las células de Purkinje y putamen caudado, y la neurogénesis en la capa cortical. Se requiere más investigación para probar la asociación entre la pérdida de células de Purkinje en el cerebelo y MIA principios perturbación del desarrollo del cerebro.
Mientras que el tratamiento coherente, el examen y hasta la cría de las represas minimizar el efecto del estrés materno en el fenotipo de la descendencia, nuestro protocolo todavía contiene advertencias que los investigadores deben tener en cuenta. Por ejemplo, podemos sola casa las presas el día antes de la inyección de poli (I: C) y durante el resto del embarazo. Nuestra estrategia es dejar los ratones gestantes en un undisturbed ambiente. Sin embargo, esta acción podría inducir la respuesta al estrés en el entorno materna. Aunque no sabemos si esta respuesta de estrés inducida por aislamiento interfiere con el desarrollo de la descendencia, el efecto MIA puede observarse siguiendo nuestro procedimiento.
Además, la cepa y genético fondo de los ratones debe ser elegido y probado cuidadosamente para la inducción de MIA. Hasta ahora, el efecto de MIA se replica principalmente en de tipo salvaje C57BL / 6N ratones 8,10,13,16. Otros también han observado el efecto MIA en BTBR cepa de ratón 19. Se ha demostrado que el poli (I: C) podría provocar diferentes respuestas inmunes en ratones genéticamente 13,22-24, que pueden introducir efectos de confusión adicionales a la descendencia.
En términos del número de repeticiones biológica, se utiliza al menos 6 litros por grupo para ensayos de comportamiento o fisiológicos y 3 litros por grupo para la expresión de genes, proteínas o inmunoenfoques histoquímica. Probamos todos los descendientes de una misma camada en lugar de utilizar una o dos crías en una camada para evitar el sesgo experimental. También tenemos una media de los datos para todos los descendientes de una misma camada, y el uso que la media, como un punto de datos (tales que n = el número de camadas) para evitar las estadísticas inadecuadas 13. Los datos de cada género también se agruparon porque hay diferencia de género obvia se ha observado en el modelo de MIA 13.
La razón de ser de medir MIA crías por camada es de tamaño para minimizar la variación causada por la lactancia materna y el cuidado. Tamaño de la camada se ha demostrado que se correlaciona con comportamientos estereotipados en ratones C57BL / 6 25. Los autores especulan que esto podría ser debido a la asignación de recursos durante la lactancia materna y el cuidado. Para evitar este efecto de confusión, nuestro tamaño de la camada deseada estándar es de 6-10 para ratones C57BL / 6.
Incluso cuando se sigue el protocolo de cerca, el experimentador puede encontrarrestar una respuesta inmune demasiado débil o demasiado potente en ratones embarazadas después de poli (I: C) de inyección. Para evitar esto, es esencial para validar la actividad pirogénica y cytokinogenic de diferentes lotes de poli (I: C). Diferentes lotes y lotes de poli (I: C) de la misma compañía podría dar lugar a diferentes niveles de la respuesta inflamatoria en ratones; sorprendentemente, la inyección de dosis idénticas de poli (I: C) de lotes diferentes puede resultar en hasta 10 veces las diferencias en el plasma de IL-6 26. La determinación de la dosis y lote de poli (I: C) para obtener más experimento MIA por la lectura de la hembra no embarazada de medición IL-6 podría ayudar a reducir la variación del efecto de la inducción MIA.
Si es necesario modificar la dosis para lotes específicos de poli (I: C), también es importante modificar la concentración de la poli (I: C) Solución para inyección de tal manera que el volumen inyectado queda más o menos 5 l por gramo de de peso del ratón. Por ejemplo, de acuerdo con la manufprocedimiento de acturer, poli (I: C) es supuestamente reconstituyó en ~ 10 mg / ml de agua para producir un polinucleótido en solución fisiológica tamponada con fosfato. En comparación con nuestra solución de 40 mg / ml, la concentración más baja sería aumentar el volumen de inyección por 4 pliegues. Para los ratones embarazadas, un gran volumen de inyección de tampón podría aumentar la presión sobre los embriones no deseada e introducir, a efectos de la descendencia de confusión. Por lo tanto, elegimos para disolver el poli (I: C) en polvo en cloruro de sodio 0,09% con una concentración final más alta con el fin de reducir el volumen de inyección.
IL-6 es elegido para ser el marcador de la respuesta inflamatoria aguda, porque la investigación previa ha identificado la señalización de IL-6 como un factor crítico en la mediación de los efectos de MIA en el desarrollo cerebral y el comportamiento. Después de poli (I: C) el tratamiento, la IL-6 es la citocina más regulada al alza en la sangre materna y la placenta 10,12. Lo más importante, Smith et al. demostrado que varios decitoquinas altamente regulados positivamente, sólo la IL-6 exhibieron tanto necesidad y suficiencia para la inducción del cerebro asociadas-MIA y alteraciones del comportamiento. Es decir, la inyección de la madre de anti-IL-6 podría prevenir con eficacia las anomalías de comportamiento y transcriptomic anormales en MIA descendencia, mientras que otras citoquinas neutralizantes no lo hicieron 10. Por otra parte, la inyección materna de IL-6 recombinante solo (sin poli (I: C)) reproduce transcripcional asociado-MIA y anormalidades del comportamiento visto en el cerebro fetal MIA y descendencia 12,15.
En comparación con otros métodos para inducir la MIA (por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) o influenza), poli (I: C) es relativamente seguro y proporciona una manera fácil de controlar la intensidad de la respuesta inmune. Aunque la respuesta inflamatoria provocada por poli materna (I: C) es la administración aguda y transitoria, su efecto sobre los comportamientos descendencia y el desarrollo del cerebro es profunda. En general, una vez que la técnica de inducir MIA tediante poli (I: C) la inyección en E12.5 se domina, se puede entonces proceder a realizar diferentes ensayos conductuales y biológicos para examinar el efecto de este factor de riesgo ambiental en la descendencia. Al mismo tiempo, también se podría combinar el método con modificaciones genéticas u otros tratamientos antes, durante o después del embarazo para investigar las causas y posibles enfoques terapéuticos para el autismo y la esquizofrenia.
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Acknowledgments
Nos gustaría honrar al difunto Dr. Paul H. Patterson por sus contribuciones al progreso del modelo de MIA, el autismo, la esquizofrenia y la investigación. Reconocemos Sarkis K. Mazmanian por su gran apoyo en este protocolo; Ruben M. Bayon, Yvette García-Flores, Karen C. Lencioni, y Leslie A. Neumann por la asistencia administrativa; Ali Khoshnan y Jan C. Ko por la asistencia en el rodaje; Elaine Y. Hsiao y Natalia Malkova por sus consejos sobre la inducción MIA; Jeffrey S. Cochrane, Joaquín Gutiérrez, F. Lee Kwan, Jaime Rodríguez, Lorena C. Sandoval, y Natalie A. Verduzco por su cría de animales experto. Este trabajo fue apoyado por el NIH Premio Conte Centro (NIH 5P50MH086383-04, a Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, de Paul H. Patterson); Fundación Simons (# 322839, en Sarkis K. Mazmanian); NIH Formación Grant (NIH / NRSA T32GM07616 a K.-HC); Caltech Verano Pregrado Becas de Investigación (SURF) (a ZY); Amgen Académicos Programa de Caltech (a ZY); y fr beca posdoctoralConsejo Nacional de Ciencia om, Taiwán (NSC 101-2917-I-564-039, de W.-LW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
