设计，包装，并通过立体定向注射高效价CRISPR复古和慢交付

该程序的总体目标是使研究人员能够设计和包装表达荧光蛋白、CAS9 和 sgRNA 的病毒，然后将它们立体定向注射到小鼠大脑中。这种方法可以帮助回答神经科学领域的特定问题，例如导致神经和神经发育障碍的基因的作用。这项技术的主要优点是能够纵特定基因，而无需花费时间和资源来创造基因工程动物。

在制备细胞之前，使用网站生成 20 个核苷酸的引导链或 sgRNA，用于设计单链寡核苷酸。按照文本方案中的说明订购寡核苷酸并使用它们制备最终质粒后，继续将所有 th-od 细胞从冻存管中移液到 15 mL 锥形管中。接下来加入 2 毫升预热的 CO 2 平衡完全 IMDM。

然后以 500 倍 G 离心细胞 5 分钟，然后吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 10 毫升完全 IMDM 中。将细胞接种到 10 cm 细胞培养皿上，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育过夜。铺板后 24 小时，通过吸出现有培养基并加入 10 毫升预热的 IMDM 来更换培养基。

一旦细胞汇合，就分裂细胞。要分离细胞，吸出培养基并用 5 毫升 PBS 洗涤板。然后向板中加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育，直到细胞从板中升起。

然后，加入 0.5 毫升 IMDM 以中和胰蛋白酶反应，并将细胞移液到 1.5 毫升试管中。接下来，将细胞以 500 倍 G 离心 5 分钟。将细胞重悬于 1 毫升 IMDM 中，并在 90 微升 PBS 中稀释 10 微升细胞。

使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并用完全 IMDM 重新接种细胞。第 5 天，在转染前 2 小时更换培养基，并确保 10 厘米板中正好有 10 mL 培养基。接下来，使用两支 5 ml 圆底聚苯乙烯管制备用于两次分离的转染试剂。

将第一管标记为 DNA，将第二根管标记为 2X HBS。然后在 PH 值为 7.4 的 Tris EDTA 中将 DNA 浓度调节至 1 μg/μL。要制备慢病毒和逆转录病毒的转染试剂，请将所需的组分缓慢添加到标记的 DNA 管中，同时不断敲击试管进行混合。

之后，将 1 毫升 2X HBS 添加到标有 2X HBS 的试管中。接下来，缓慢地将 DNA 管中的 1 毫升内容物添加到 2X HBS 管中，一次一滴。连续敲击 2X HBS 管，观察每次滴液后形成的磷酸钙沉淀物，以确保成功制备转染复合物。

随后在室温下避光孵育试管 30 分钟。30 分钟后，向每个 10 cm 细胞板中加入 1 mL 慢速液滴转染试剂，并在 37 °C 下孵育细胞过夜。在第 6 天更换培养基。

第 7 天，用 10 毫升血清移液管将含有病毒颗粒的培养基转移到 50 毫升锥形管中，然后在 4 摄氏度下储存。然后向每个细胞板中加入 8 毫升 0.5% FBS 培养基。第八天，收集含有病毒颗粒的细胞培养基，并将其与前一天的收获物混合在 50 毫升锥形管中。

在该步骤中，将病毒上清液以 2000 倍 G 离心 10 分钟。然后，通过 0.45 微米低蛋白结合注射器过滤器过滤病毒培养基来纯化病毒培养基。接下来，向培养基中加入 5X 聚乙二醇 6000 溶液。

将试管倒置数次以混合。然后将病毒混合物在 4 摄氏度下孵育至少 12 小时。第 9 天，将病毒混合物以 2500 倍 G 离心 45 分钟。

45 分钟后，弃去上清液并再次离心 2 分钟。然后再次去除上清液。然后，加入 320 μL 无菌 PBS 重悬沉淀，并在摇床上室温孵育 30 分钟。

第二天，将病毒分装并在零下 80 摄氏度下冷冻等分试样。要开始此过程，请剃掉麻醉小鼠的头部，以便为注射部位做准备。将 4% 异氟醚直接进入鼻锥。

接下来，将鼠标放入立体定向仪器中。将咬杆插入口中，直到牙齿掉入插槽中，然后再固定耳杆。确保动物的身体在加热垫上，并且鼻子位于鼻锥中。

接下来，通过捏脚来确认麻醉。然后涂抹人工泪液来润滑眼睛。随后用聚维酮碘和利多卡因擦拭剃光的头部。

现在沿着头皮中线做一个小切口。用棉签擦干颅骨并涂抹过氧化氢以帮助观察前囟。使用解剖镜，找到头骨上的前囟，并将钻头放在其上方。

将 X、Y 和 Z 平面的数字立体定向坐标设置为零。为了确保头部在喙尾 Y 轴上水平，将钻头放在 lambda 上并调平头部，使 Z 坐标在前囟和 lambda 处大致等于零。为确保头部沿 X 轴水平，请将钻头放在前囟和 lambda 之间的中点上，并在距两侧中点一毫米处测量 Z 坐标，以确保它们相等。

接下来将异氟醚降低到 2%，然后将钻头放在所需的坐标上并小心地钻穿头骨。钻完所有孔后，将充满病毒的注射器贴在立体定向器械上。将注射器置于孔的中心，并将头骨处的 Z 坐标设置为零。

慢慢将注射器降低到最深的 Z 深度，并使用立体定向注射器以每分钟 0.25 微升的速度开始注射。在最深的 Z 深度完成注射后，等待一分钟，然后将其升高到下一个坐标，然后再次开始注射。继续此模式，直到注入所有 Z 注入坐标。

最后一次注射后，等待 2 分钟后再取出注射器。然后从立体定向器械中取出鼠标并缝合头皮。在手术部位涂抹利多卡因和抗菌乳膏，并在将动物转移到加热的恢复室之前服用止痛药。

这张 10X 宽视野荧光图像表明，高滴度逆转录病毒感染了大量细胞，这些细胞的形态可以通过荧光团表达进行评估。在这个例子中，表达 GFP 或 mCherry 的病毒被共同注射到齿状回中。使用逆转录病毒系统，可以使用一种病毒进行一种以 GFP 为标记的基因作和另一种以 mCHerry 为标记的基因作，然后评估由于每种病毒引起的单个或附加变化。

这是注射范围的 3D 重建，其中在 21 个连续切片上追踪了病毒传播的闭合轮廓。然后对齐轮廓描记以生成用于体积量化的 3D 图像。病毒总传播以绿色显示，dendate 局部传播以紫色显示。

该图像显示病毒除了填充齿状回的喙尾轴外，还沿针道和胼胝体传播。体内病毒注射后，我们使用其他方法，如组织学、电生理学或双重显微镜检查来研究基因作对神经元发育的影响。