Name: 设计，包装，并通过立体定向注射高效价CRISPR复古和慢交付 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习利用CRISPR/Cas9系统设计和包装高滴度逆转录病毒与慢病毒，并通过立体定向注射精准递送至成年小鼠脑内特定区域。该方法无需构建转基因动物即可实现基因敲除，为研究神经系统疾病相关基因功能提供高效工具。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目R01MH097949、自闭症之声试点资助项目7359（授予BWL）以及诺里斯·科顿癌症中心光学成像共享仪器资助项目P30CA023108支持。

伦理声明：所有实验方案均经达特茅斯大学机构生物安全委员会和机构动物照护与使用委员会审查批准。
1. 用于CRISPR/Cas9逆转录病毒的向导链（sgRNA）设计实验方案
注意：有许多非营利性网站可用于设计靶向目的基因的sgRNA（https://benchling.com/ 和 http://crispr.mit.edu/）。&#160;本实验方案的目标是设计并从商业供应商处订购可相互退火的单链寡核苷酸，该退火后的寡核苷酸将连接至PXL转移载体。&#160;有关使用Benchling设计sgRNA的示例，请参见补充视频1。
<ol>
	<li>使用专门用于设计sgRNA的网站。 
	注意：例如，将目标基因起始区域附近的编码/外显子序列输入网站，将生成一个20个核苷酸的sgRNA。使用该20个核苷酸的sgRNA序列设计正义链和反义链寡核苷酸，用于订购以构建sgRNA。</li>
	<li>生成sgRNA后，将此序列复制到文字处理软件中。如果该20个核苷酸的sgRNA序列开头不含G（鸟嘌呤），则在文档中为其序列开头添加一个G即， G-20 核苷酸的sgRNA序列）。这是为了确保U6启动子能够有效转录。</li>
	<li>记录该20-21个核苷酸序列的反向互补序列。对于正义寡核苷酸，添加 &#34;CACC&#34; 到文档中序列的5'端即， CACC-G-20 核苷酸 sgRNA 序列）。该突出端将用于将序列连接至 PXL 载体中。</li>
	<li>对于反义寡核苷酸，在其5'端添加AAAC。利用该突出端将序列连接至PXL载体中。</li>
	<li>获取正义链和反义链寡核苷酸。收到寡核苷酸后，使用无DNA酶的水配制100 μM的储存液。取100 μM的正义链和反义链寡核苷酸各10 µl，加入4 µl 10x NEB Buffer 2和16 µl水，混匀。 
	注意：它们不需要进行PAGE纯化或5'端磷酸化（因为BbsI的突出端为不兼容的黏性末端）。
	<ol>
		<li>在500 ml烧杯中将200 ml水煮沸，然后将装有该混合物的试管置于泡沫架上漂浮加热 &#34;漂浮物&#34; 固定器。将水在室温下从95 °C缓慢冷却2小时。</li>
		<li>将已退火的寡核苷酸混合物用无菌水稀释1:1,000，立即用于后续连接反应，或将剩余反应液于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 BbsI 限制性内切酶在 37 °C 条件下消化 pXL（一种 PX330 载体衍生物）2 小时。反应体系为 40 µl，包含 2 µg pXL、4 µl 10x NEB Buffer 2、1 µl BbsI 和加水至终体积。将消化后的 pXL 使用商业试剂盒进行常规凝胶纯化，确保获得约 8.5 kB 的产物。</li>
	<li>使用商业连接试剂盒，将1 µl 1:1,000退火寡核苷酸与50 ng经消化及凝胶纯化的pXL连接。将连接产物转化至感受态重组缺陷型 E. coli （NEB 5-alpha，用于亚克隆效率）。通过质粒DNA测序筛选含有正确向导序列的转化子。</li>
	<li>使用 BstB1 和 Pac1 限制性内切酶将 U6、引导链和 RNA 支架元件（sgRNA）从 pXL 载体中酶切下来，并连接至经相同限制性内切酶消化的荧光蛋白-T2A-Cas9 病毒骨架中。将连接产物转化至 NEB 5-alpha 最高效感受态细胞中。荧光蛋白-T2A-Cas9 病毒骨架质粒为低拷贝质粒，因此必须采用低拷贝质粒操作规范。 
	注意：可通过PacI酶切另一种pXL引导链质粒，将第二条sgRNA以类似方式引入，并连接至已含有第一条引导链、经PacI消化并用小牛肠碱性磷酸酶处理过的病毒骨架中。对病毒转移质粒进行磷酸酶处理有助于减少未插入第二条引导链的质粒自连所产生的转化子数量。</li>
	<li>对最终质粒进行序列验证&#160;使用 Nucleobond Xtra 病毒包装试剂盒进行大提，并将其包装成病毒，步骤如下 &#34;逆转录病毒/慢病毒生产方案 — 磷酸钙法&#34;.</li>
</ol>
2. 准备293FT/293GP细胞用于转染（逆转录病毒/慢病毒生产——磷酸钙法）
<ol>
	<li>（第1天）在37 °C水浴中快速解冻每10 cm细胞培养皿所需的1管细胞。进行慢病毒包装时，使用293FT细胞；进行逆转录病毒包装时，使用293GP（gag/pol）细胞。</li>
	<li>将冻存管中全部解冻后的细胞用移液器转移至15 ml锥形管中，并加入2 ml预热的、经CO2平衡的完全Iscove改良Dulbecco培养基。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟使细胞沉淀，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml完全Iscove改良Dulbecco培养基中，接种至10 cm细胞培养皿中。于37 °C、5%二氧化碳培养箱中过夜培养。</li>
	<li>（第2天）接种后24小时，吸除原有培养基，向培养皿中加入10 ml预热的Iscove改良Dulbecco培养基以更换培养液。
	<ol>
		<li>（第3–4天）换液后24–48小时，待细胞达到汇合状态时，将细胞按每皿（10 cm培养皿）2.5–3.0 × 106个细胞的密度进行传代。</li>
		<li>传代时，吸除培养基，用5 ml PBS洗涤培养皿，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育至细胞脱离培养皿表面。加入0.5 ml Iscove改良Dulbecco培养基以中和0.25%胰蛋白酶反应，将细胞吹打混匀后转移至1.5 ml离心管中。</li>
		<li>以500 × g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于1 ml Iscove改良Dulbecco培养基中。取10 µl细胞悬液与90 µl PBS混合稀释，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。用完全Iscove改良Dulbecco培养基将细胞重新接种至每皿2.5–3.0 × 106个细胞。 
		注意：接种后24–34小时，细胞汇合度约为50%。当细胞汇合度达到约50%时进行转染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. （第5天）CaPO4 转染与病毒颗粒收集
<ol>
	<li>转染前2小时更换培养基，吸除原有培养基，加入10 ml预热的Iscove改良Dulbecco培养基。确保10 cm培养皿中的培养基恰好为10 ml。</li>
	<li>使用2个5 ml圆底聚苯乙烯管为2个培养皿准备转染试剂。标记第一个管 &#34;DNA&#34; 第二个管子 &#34;2X HBS&#34;将DNA浓度用pH 7.4的Tris-EDTA缓冲液调整至1 μg/μl。
	<ol>
		<li>对于慢病毒，缓慢加入20 μl转移载体（感兴趣的病毒构建体）、13 μl CMVdelta8.9、9 μl VSV-g、860 μl分子生物学级H2O和100 μl的2.5 M CaCl2 到第一个试管（&#34;DNA&#34;同时不断轻敲管壁以混匀。</li>
		<li>对于逆转录病毒，省略 CMVdelta8.9 质粒。加入 20 µl 转移载体、15 μl VSV-g、860 μl 分子生物学级 H2O和100 μl 2.5 M CaCl2 标记为的试管 &#34;DNA&#34;.</li>
		<li>向标有标签的试管中加入 1 ml 2x HEPES 缓冲盐水（pH 7.0；该 pH 值至关重要） &#34;2X HBS&#34;.</li>
		<li>缓慢加入1 ml的管内物质 &#34;DNA&#34; 管子到 &#34;2X HBS&#34; 管，一次一滴。持续轻敲 &#34;2X HBS&#34; 用食指或中指按住试管，同时加入管内物质 &#34;DNA&#34; 管。观察明显的 CaPO4 每次滴加后轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 ml转染液缓慢滴加至每个10 cm细胞培养皿中，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>（第6天）将培养基更换为8 ml含0.5%胎牛血清和40 mg咖啡因/100 ml培养基的Iscove改良Dulbecco培养基。如果转移载体含有荧光标记，则荧光蛋白的表达表明转染成功。</li>
	<li>（第7天）使用10 ml血清移液管收集含有病毒颗粒的培养基，并转移至50 ml锥形管中。将50 ml锥形管置于4 °C保存。向每块培养板中加入8 ml含0.5% FBS的培养基。
	<ol>
		<li>（第8天）再次收集含有病毒颗粒的培养基，并与前一天收获的培养基合并至50 ml锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 病毒的浓缩与纯化
<ol>
	<li>通过将40%聚乙二醇6000和1.5 M NaCl加入ddH₂O中，配制5倍浓度的聚乙二醇6000溶液。2O. 将溶液在121 °C条件下，使用液体循环程序高压灭菌45分钟。冷却时缓慢混匀溶液。 
	注意：溶液在冷却过程中会先呈现浑浊，随后逐渐变澄清。</li>
	<li>将含有两份病毒上清液的50 ml锥形管在2,000 × g离心10分钟，以沉淀不溶性物质。使用0.45 µm低蛋白结合力注射器滤器（PES或PVDF）过滤病毒培养基，以进行纯化。</li>
	<li>向培养基中加入5倍浓度的聚乙二醇6000溶液（最终浓度应为8%聚乙二醇6000和0.3 M NaCl）。通过反复倒置试管数次混匀（切勿涡旋振荡）。将含有病毒的聚乙二醇溶液于4 °C孵育12小时或更长时间，期间偶尔重新混匀。</li>
	<li>（第9天）将含有病毒的聚乙二醇溶液在2,500 × g离心45分钟。移除并弃去上清液，再短暂离心2分钟。再次移除并弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于320 µl无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中（320 µl为1/100）th （收集的含病毒培养基原始体积的）并在4°C下孵育过夜。可选步骤：在室温下将沉淀物置于摇床上重悬30分钟。</li>
	<li>重悬沉淀后，将病毒分装（每管0.5 ml含5–10 µl），并于–80 °C冻存（反复冻融或4 °C保存会显著降低病毒滴度）。</li>
	<li>使用标准方案对病毒进行滴定， 即， 在6孔板的HEK293T细胞中进行梯度稀释，48小时后人工计数荧光集落。</li>
</ol>
5. 测试CRISPR病毒的效力
注意：使用以下步骤对序列克隆进行检测，以验证在小鼠 Neuro2A 细胞中通过非同源末端连接（NHEJ）修复的双链断裂的产生情况。该方法相较于调查者检测具有优势，因为它可用于确定发生修饰的细胞百分比，以及由 NHEJ 引起的插入缺失（indel）的性质。
<ol>
	<li>用伊格尔改良杜尔贝科培养基将基质胶按1:50比例稀释，取适量覆盖3.5 cm细胞培养皿，37 °C孵育30分钟。吸除基质胶稀释液后接种Neuro2A细胞。</li>
	<li>当 Neuro2A 细胞达到 50% 汇合度时，以感染复数为 10 的条件加入 CRISPR 慢病毒或逆转录病毒（即， 每个细胞10个病毒颗粒。 
	注意：Neuro2A 细胞相较于 HEK293 细胞更不易被感染，因此单次感染无法使 100% 的细胞被慢病毒成功感染。此外，逆转录病毒仅感染分裂期细胞，因此也无法实现 100% 的感染率。为达到接近 100% 的感染率，可在多个时间点重复添加病毒，并根据需要对细胞进行传代。或者，可使用荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell-sorting）分离出荧光阳性细胞。实现慢病毒感染率达到 100% 的最有效方法是进行一次感染后，接着进行 FACS 分选。对于逆转录病毒，应每隔 24 小时进行一次感染，共进行四轮感染，随后进行 FACS 分选，以确保达到 100% 的感染率。</li>
	<li>感染细胞1周后，将细胞扩增至10 cm培养皿中接近汇合，吸除培养基，用5 ml磷酸盐缓冲液洗涤培养皿。加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，37 °C孵育至细胞脱离培养皿。加入0.5 ml Iscove改良Dulbecco培养基以中和0.25%胰蛋白酶反应，吹打收集细胞至1.5 ml离心管中，500 × g离心5 min沉淀细胞。</li>
	<li>为了分离DNA，加入100 µl 50 mM氢氧化钾，重悬细胞，并在95℃下孵育 °C 反应 5 分钟。加入 10 µl 1 M Tris（pH = 8.0）中和溶液。</li>
	<li>使用步骤5.5中分离得到的约300 ng DNA，采用高保真PCR预混液对CRISPR sgRNA靶向的基因组区域侧翼片段进行PCR扩增4.</li>
	<li>在2.5%琼脂糖凝胶上进行PCR反应，使用凝胶纯化试剂盒（如凝胶DNA回收试剂盒）纯化大小合适的片段。将片段连接至PCR克隆载体（如pGem-t-easy），并转化至感受态细胞中9.</li>
	<li>24 小时后，向 15 ml 圆底试管中加入 2 ml LB 液体培养基以及相应的抗生素（氨苄青霉素、新霉素）， 等等。)。使用无菌移液器吸头或接种环从LB平板上挑取单个菌落，接种至试管中。将试管置于37 °C、250 RPM条件下振荡培养24小时，使菌落扩增生长。根据需要，对多个菌落重复上述操作。
	<ol>
		<li>使用小型质粒提取试剂盒，从样品中分离DNA E. coli 使用针对sgRNA靶向基因区域设计的引物进行测序，以分析小鼠基因组中Cas9的靶向区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 成年小鼠立体定位注射方案
<ol>
	<li>准备手术 
	注意：在存活手术期间维持无菌条件非常重要。本方案通过热力灭菌手术器械、使用聚维酮碘对注射部位进行消毒，以及在关闭切口后于切口处涂抹抗生素软膏来实现无菌操作。同时，使用无菌手套以及一个经过彻底消毒的专用手术区域也至关重要。
	<ol>
		<li>使用前通过高压灭菌或干热灭菌珠对手术器械进行热力灭菌。打开加热垫以预热恢复室和手术区域，以在手术及恢复期间维持动物体温。组装用于在颅骨上钻孔以便注射的钻机。</li>
		<li>将4 µl病毒液从无菌PCR管中直接抽吸至注射针头内。短暂地将病毒分装样品从冰上取出。病毒在注射器中于室温下放置时间不得超过1小时，随后即应进行注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 立体定位注射
<ol>
	<li>确认手术室通风系统已打开，以确保空气流通。使用诱导舱以4%异氟烷对小鼠进行麻醉，随后剃除头部毛发以准备注射部位。
	<ol>
		<li>使用镊子将小鼠舌头向下并向一侧移动，将其固定于立体定位仪中。将咬合杆插入小鼠口腔，直至牙齿落入凹槽，然后固定耳杆。确保小鼠身体位于加热垫上，鼻部置于鼻罩内，并向鼻罩输送4%异氟烷。用镊子轻夹小鼠足部以确认麻醉深度，确保无惊跳反射。</li>
		<li>涂抹人工泪液以润滑眼睛。交替使用聚维酮碘和利多卡因擦拭已剃毛的头部，完成注射部位的准备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手术刀沿头皮正中线做小切口。必要时用棉签蘸取过氧化氢干燥颅骨，以帮助辨识前囟。
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下定位颅骨上的前囟，并将钻头尖端置于前囟处。将数字立体定位坐标在x、y和z三个平面上归零（或记录）。</li>
		<li>为确保头部在前后方向（y轴）上水平，将钻头置于后囟位置，并调整头部使前囟与后囟处的z坐标大致相等。</li>
		<li>为确保头部在左右方向（x轴）上水平，将钻头置于y = 1/2后囟位置。确保矢状缝两侧1 mm处（x = ±1 mm）的z坐标相等。若后囟左右1 mm处z坐标存在差异，则调整颅骨位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将钻头移至目标坐标位置。对于齿状回，使用从前囟起y = -1.9、x = ±1.1的坐标。钻孔前将异氟烷浓度降至2%，然后缓慢而小心地钻穿颅骨。
	<ol>
		<li>完成所有钻孔后，将装有液体的注射器固定至立体定位仪上。目视将注射器对准钻孔中心，并将颅骨表面设为z坐标的零点。</li>
		<li>缓慢将注射器降至最深的z坐标位置。对于齿状回，z深度分别为-2.5、-2.4和-2.3。使用立体定位注射仪以0.25 µl/min的速率开始注射。
		<ol>
			<li>在最深z坐标注射完成后，等待1分钟，然后提升至下一个坐标位置并再次开始注射。重复此过程，直至所有z坐标位置均完成注射。最后一次注射完成后，等待2分钟再移出注射器。 
			注：在小鼠脑半球内注射病毒量达2 µl时，尚未观察到对组织产生不良影响。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对其他钻孔重复上述注射步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射完成后，将小鼠从立体定位仪中取出，使用6-0丝线缝合头皮。在伤口处涂抹利多卡因及抗菌软膏。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射途径给予0.8–1.0 ml生理盐水+酮洛芬（3–5 mg/kg）以缓解疼痛。随后将小鼠放入加热的恢复舱中。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开看护。在动物完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后数日内，每日称量小鼠体重，并提供软质食物和零食。检查伤口情况，并记录其整体健康状况和行为表现。</li>
	<li>立体定位注射后，可对小鼠实施安乐死，用于脑片制备及电生理记录1，或进行灌注，取出脑组织，切片并采用免疫组织化学染色进行分析10。</li>
</ol>

<ol><li>Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+of+newborn+Pten+knock-out+neurons+results+from+increased+excitatory+synaptic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive.</a> J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+knockdown+in+vivo+increases+excitatory+drive+onto+dentate+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells.</a> J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Luikart, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+mediates+the+integration+of+newborn+neurons+into+the+adult+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (5), e19077(2011).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+higher+titer+lentivirus+with+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Creating higher titer lentivirus with caffeine.</a> Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).</li>
<li>Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method">http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method</a> (2015).</li>
<li>Fricano, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+increase+neuronal+hypertrophy+of+Pten+knockdown+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons.</a> Front Mol Neurosci. 7, 30(2014).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?</a> Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功的病毒包装有几个关键步骤至关重要。细胞在转染前和转染期间的健康状态极为重要，因为不健康的细胞会显著降低病毒的产量。如果转染和包装成功，则应有100%的细胞表达荧光蛋白，并且细胞应形成功能性的合胞体。在步骤3.2.4中，轻敲离心管对于实现高效高滴度转染是必要的，且HEPES缓冲盐溶液的pH值必须准确。用于病毒包装所需质粒的大量提取（maxi-prep）必须极为纯净。为此，建议将最终洗脱的DNA进行乙醇沉淀，并重新悬浮于Tris-EDTA缓冲液中。此外，在第6天（步骤3.4）向培养基中添加咖啡因之前，将血清浓度降低至2%或更低也非常重要。如果未降低血清浓度，则最终纯化的病毒中将含有过量的血清蛋白，这是不可取的。在沉淀病毒颗粒时使用聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000）可避免超速离心的必要性。还需要注意的是，携带Cas9 CRISPR的病毒其滴度通常比仅携带荧光蛋白的病毒低约10倍。
在立体定位手术中，使用吸入式麻醉剂相比注射用麻醉剂能够更快速、精确地控制动物的意识状态，并且适用于更广泛年龄段的动物。保持手术器械的清洁与无菌至关重要，而可重复的靶向定位则需要头部的精确定位。务必确保动物头部在立体定位仪中没有俯仰或侧倾，并且颅骨固定牢固。可让颅骨适当干燥，以便观察缝线位置，从而确定立体定位坐标。此外，每个立体定位坐标的注射速率和注射体积均需通过实验经验确定。
该技术的局限性在于，慢病毒或逆转录病毒的扩散能力受限，尤其是与腺相关病毒（AAVs）相比。因此，这些病毒适用于感染特定的脑区，但不适用于与用于动物行为学分析的AAVs相关的整体性感染。本方案中使用咖啡因可显著提高这些病毒的滴度，但其滴度仍不及AAV包装所达到的水平。此外，稳定整合仅对荧光蛋白表达具有优势，因为CRISPR/Cas9即使在瞬时转染的情况下也能形成稳定的基因组编辑，而持续表达Cas9和sgRNA可能会最终导致脱靶效应。虽然通过AAVs瞬时表达CRISPR/Cas9系统足以产生可在细胞分裂过程中持续传递的基因组改变，但荧光蛋白的表达将无法维持。
利用 CRISPR/Cas9 系统构建慢病毒和逆转录病毒，将赋予研究人员在多种生物体中靶向任意新基因的能力。基因编辑的效率似乎取决于引导 RNA 靶向 Cas9 切割位点的序列。已有实验数据表明，在感染 Neuro2A 细胞后，经测序发现含有插入或缺失（indel）的克隆比例介于 10% 至 80% 之间。目前尚不清楚在 Neuro2A 细胞中计算得到的 indel 频率是否能够反映神经元中的真实情况。目前一些引导 RNA 设计软件（如 Benchling）已包含“&#34;on-target&#34;”评分功能，可能可用于预测特定靶序列的编辑效率。然而，随着 CRISPR-Cas9 系统的广泛应用，此类“&#34;on-target&#34;”评分在神经元及其他细胞类型中的可靠性仍需通过实验进一步验证。
基于慢病毒的转基因动物制备在不同研究中成功率不一，有报道称慢病毒递送的转基因会发生沉默11。通过CRISPR介导的DNA基因编辑可经由生殖系传递，从而建立完整的动物模型。因此，尽管病毒递送的荧光蛋白和Cas9转基因可能发生沉默，仍有可能实现稳定的基因组编辑。这可能为靶向基因组改造提供一个高效的平台。虽然CRISPR/Cas9系统的病毒递送无需依赖转基因生物，但其与现有技术具有互补性。例如，将此类病毒颗粒注射到可诱导表达Cre以及Cre依赖的光遗传或化学遗传转基因的复合转基因动物中，将有助于深入研究基因操作与神经元活动之间的关系。第二个例子是将Cas9/sgRNA病毒颗粒递送至条件性基因敲除模型中，以筛选基因间的相互作用。最后，该研究另一令人振奋的方向是在患者来源的细胞中进行表型及治疗化合物的筛选，可用于验证并发现多种疾病中被破坏的基因调控网络。

为了研究正常生理功能和疾病病理学的基础，需要在模式生物中精确操控基因表达。对于哺乳动物模式生物而言，这主要依赖于转基因小鼠的构建与培育，其中目标遗传元件两侧包含可被重组酶识别的位点，从而实现对这些侧翼基因的位点特异性操控。尽管该策略已被广泛应用，但其耗时较长且资源消耗大；例如，构建一只同时表达floxed基因、Cre重组酶和Cre报告基因的三重转基因动物，需要多次交配并进行基因型验证。相比之下，将编码荧光蛋白和Cre重组酶的复制缺陷型病毒颗粒通过立体定位注射至携带floxed基因的动物体内，则无需复杂的基因分型或繁育策略1。此外，若将表达荧光蛋白和Cre重组酶的病毒与另一种编码不同荧光蛋白的病毒共注射，则可在同一组织内为靶向遗传操作提供内部对照。尽管该策略仍需使用基因敲入动物，但基于病毒介导的RNA策略避免了对转基因动物的需求。例如，通过立体定位注射编码荧光蛋白和短发夹RNA（shRNA）的复制缺陷型病毒，可利用细胞内源性的RNA干扰（RNAi）机制，有效降低目标基因转录本的表达水平。然而，shRNA策略通常仅导致基因表达的部分下调，常产生较轻微的细胞表型2。虽然这种基因敲低可能更接近杂合子基因功能障碍的生理状态，但相较于基因完全敲除，其效应较弱，不利于新基因的表型发现。
最近出现的第三种技术是CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9（CRISPR相关蛋白9）系统，该系统依赖于一种小的外源RNA和一种DNA切割酶的共同表达。CRISPR/Cas9系统源自原核生物的免疫系统，该系统进化出一种识别病毒来源的外源入侵DNA，并通过Cas9酶将其靶向降解的机制3,4。这种强大的基因组编辑技术可用于实现靶向缺失、插入和突变；以下方案将概述如何在体内对目标基因进行缺失操作，以敲除其表达。in vivo。Cas9酶必须与一段与目标区域同源且与支架RNA相连的向导RNA共同表达。利用该技术敲除基因需要使用合成的向导RNA（sgRNA）将Cas9靶向基因组中的特定位点，并在目标位点诱导产生双链断裂（DSBs）。这些DSBs随后由细胞内源性的修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）方式进行修复，从而产生插入或缺失突变（indels），可能导致错义或无义突变，因此可导致功能蛋白表达的丧失5。由于该系统会引起基因组的永久性改变，因此仅需Cas9和sgRNA的瞬时表达即可。然而，若能有一个稳定的荧光指示剂来识别经此方式处理的细胞及其子代细胞，则更为理想。
慢病毒和逆转录病毒能够将目的DNA稳定整合到宿主细胞基因组中，实现长期表达，并在有丝分裂过程中传递给子代细胞。本实验方案描述了两种复制缺陷型、高滴度逆转录病毒的设计与制备方法：来源于人类免疫缺陷病毒的慢病毒颗粒（lentivirus）以及基于小鼠莫洛尼白血病病毒（murine Maloney Leukemia virus）的逆转录病毒颗粒（retrovirus）。尽管这两种病毒均能稳定表达较大的外源基因，但逆转录病毒仅能在细胞分裂过程中、核膜降解时将其基因组整合至宿主DNA，因此可作为标记细胞并确定其出生时间的工具6。虽然慢病毒通常被认为滴度相对较低7，但本方法通过在病毒收集过程中使用咖啡因8，常规可获得109至1010 粒子/mL的高滴度。慢病毒和逆转录病毒的另一优势在于其对非常大插入片段的耐受性。以下一系列实验方案概述了设计编码荧光报告蛋白、sgRNA和Cas9的慢病毒或逆转录病毒的流程，以利用CRISPR/Cas9系统实现DNA编辑的同时表达荧光蛋白。
小鼠立体定位神经外科手术是一种用于注射病毒的有价值方法 体内 用于研究被感染神经元的形态、功能及连接性。通过病毒感染神经元，可在较长时间内（例如整个发育过程）调控基因表达水平，并利用多种药物诱导系统及特异性Cre驱动表达实现精确控制。本实验方案详细介绍了如何向成年小鼠脑内注射表达sgRNA和Cas9的病毒，以敲除目标基因。小鼠在手术后恢复迅速，注射后48小时内即可检测到病毒携带的转基因表达。然而，荧光蛋白的表达水平在数周内持续上升，至感染后3周左右达到接近峰值的水平。接受病毒立体定位注射的小鼠可用于行为学、电生理学或形态学研究。总体而言，本实验的目的在于演示如何结合立体定位手术与表达特异性sgRNA及Cas9的病毒，在成年小鼠脑内实现基因敲除。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞培养试剂列表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>293FT 细胞系</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>用于慢病毒</td></tr><tr><td>293GP 细胞系</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>用于逆转录病毒</td></tr><tr><td>DMEM 的 Iscove 改良培养基（IMDM）</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>含 10% FBS、1% NEAA、1% L-Gln 和&amp;nbsp;1% P/S 的完全 IMDM</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液，100 倍浓度（L-Gln）</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液，100 倍浓度（P/S）</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯 10&amp;nbsp;cm 培养皿</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 1 倍溶液</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;转染试剂列表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5&amp;nbsp;ml 聚苯乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C69-500</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 2.5 M 溶液</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2 倍 HEPES 缓冲盐水（HBS）</td><td></td><td></td><td>500 ml：8.2 g NaCl，5.95&amp;nbsp;g HEPES，0.106 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 7.01（精确！）</td></tr><tr><td>咖啡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;M 注射器滤器</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;M 注射器滤器</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>60 cc L/L 注射器</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇&amp;nbsp;&amp;nbsp;6000（PEG 6000）</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10 倍浓度</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>供体马血清</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>抗-GFP 抗体，兔源，488 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A21311</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;立体定位手术试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>兽用注射器，仅限 T.B. 注射器，1 cc 鲁尔滑动式，100 支/盒</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片，#10，100 片装</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液软膏</td><td>Med-Vet International</td><td>RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP 消毒液&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>三重抗生素软膏&amp;nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&amp;reg; 针头软包装 25 g × 5/8&quot;</td><td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

高滴度crispr逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

复制缺陷型慢病毒或逆转录病毒能够将外源基因稳定整合到被感染宿主细胞的基因组中。该技术已被广泛用于在模式生物中编码荧光蛋白、光遗传或化学遗传细胞活动调控元件，或异源表达人类基因。这些病毒还成功应用于在转基因动物的特定靶位点递送重组酶，甚至递送小发夹RNA（shRNA）或微小RNA（miRNA）以调控基因表达。尽管这些技术已取得成果，但其通常依赖于转基因动物（重组酶系统），或在shRNA/miRNA应用中常存在效率低和特异性差的问题。相比之下，CRISPR/Cas系统利用外源的Cas核酸酶，通过外源引导RNA（gRNA）靶向生物体基因组中的特定位点，从而诱导DNA双链断裂。这些断裂随后通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，产生插入或缺失（indel）突变，可能导致有害的错义突变或无义突变。本文提供了详细的方法，用于设计、生产、注射及验证单个慢病毒/逆转录病毒颗粒，该病毒可稳定转导神经元，使其表达荧光报告基因、Cas9蛋白以及sgRNA，从而在模式生物中实现基因敲除。

根据“CRISPR/Cas9逆转录病毒向导链（sgRNA）设计实验方案”，靶向特定序列的寡核苷酸通过BbsI克隆位点插入PXL克隆载体中，位于hU6启动子下游以及向导RNA骨架序列下游（图1，步骤1）。随后，将该sgRNA从PXL载体中切除，并利用BstBI和PacI位点插入pRubi骨架中（图1，步骤2）。最后，另一个已克隆至PXL载体的sgRNA可被插入pRubi-Guide1中第一个向导序列的下游（图1，步骤3），以靶向基因的另一区域，从而通过NHEJ途径提高基因敲除的概率。正确构建的载体应通过测序分析进行验证。构建完成后，可按照“逆转录病毒/慢病毒制备—CaPO4法实验方案”将该载体包装成病毒。通过将病毒转导至HEK293细胞进行滴度测定，以确认包装是否成功。若未观察到荧光蛋白表达，则表明病毒包装过程中可能出现了错误。
图2 是两种逆转录病毒的代表性实验结果，其中一种表达GFP，另一种表达mCherry，共同注射至新生小鼠（7日龄）的齿状回，并在注射后21天进行成像观察。利用mCherry或GFP标记神经元，可在同一组织中对不同遗传操作进行形态学评估，例如一种病毒可表达CRISPR/Cas9介导的基因敲除（KO），而另一种作为对照病毒，仅表达荧光蛋白。立体定位注射可实现精确的解剖学靶向，如本实验中病毒特异性感染目标区域——齿状回。在分析脑切片感染情况时，应保留周围组织，直至确认目标解剖区域已被成功感染。若目标区域未见感染迹象，则可能注射位点位于邻近区域，可通过观察周围切片加以识别。此外，定位针道有助于确定确切的注射位置。当将VSVg假型病毒注射至齿状回时，其极少扩散至齿状回边界以外区域。 体内 并倾向于沿头尾轴扩散，感染整个齿状回的细胞，如三维重建分析所示（图3).
<img alt="CRISPR 克隆过程示意图，包含载体图谱、向导 RNA 插入和 pacI 消化步骤。" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：逆转录病毒 pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR 质粒的克隆策略。该策略与基于 FU 的慢病毒质粒完全相同。将 sgRNA 寡核苷酸退火后，利用 BsbI 克隆位点插入 PXL 载体中。经测序确认 sgRNA 已成功插入 PXL 后，用 BstBI 和 PacI 酶对质粒进行消化。被切出的插入片段（黑色框）随后被克隆至病毒骨架（黑色虚线）pRubi-Guide1 CRISPR 中。第二个 sgRNA 也可插入 PXL 并通过 PacI 酶切下，然后利用 PacI 位点将其克隆到 pRubi-Guide1 CRISPR 载体中（红色虚线）。最终获得的质粒即包含两条向导链以及必要的病毒元件、启动子和荧光蛋白编码序列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示神经组织中GFP和mCherry荧光的共聚焦显微镜图像；蛋白质共定位。" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠齿状回的逆转录病毒感染。 将表达mCherry（红色）或GFP（绿色）的逆转录病毒注射到出生7天（p7）小鼠的齿状回中。21天后，对小鼠进行灌注，取出脑组织并切片，随后对GFP和mCherry进行染色。(A) 一幅5倍宽场荧光图像显示了齿状回注射的精确性以及齿状回颗粒神经元标记的特异性。通过DAPI（蓝色）染色可观察到海马体的形态结构。比例尺为200 µm。(B) 一幅10倍宽场荧光图像表明，这些高滴度慢病毒能够感染大量细胞，且可通过荧光蛋白的表达来观察这些细胞的形态。比例尺为100 µm。(C) 将表达GFP或mCherry的病毒共同注射至齿状回。利用逆转录病毒系统，可使用一种病毒实现由GFP标记的特定基因操作，同时使用另一种病毒实现由mCherry标记的另一项基因操作，进而分别或联合评估每种病毒所引起的改变。比例尺为10 µm。
<img alt="神经结构三维重建，显微图像，脑切片分析，从头侧到尾侧。" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：慢病毒注射的解剖学扩散范围。 将GFP-shPten病毒与mCherry对照病毒立体定位共注射至成年Ptenloxp/+小鼠脑内，导致病毒沿海马齿状回全长的头侧/尾侧轴扩散。该扩散范围通过三维重建呈现，其中使用重建软件在连续21个切片（Z = 50 μm/切片）上追踪了病毒扩散区域的闭合轮廓。随后将这些轮廓对齐，生成用于体积定量的三维图像。总病毒扩散区域以绿色显示（体积 = 54,730,800 μm3），局限于齿状回的扩散区域以紫色显示（体积 = 27,275,200 μm3）。病毒沿注射针道及其与胼胝体交界处扩散，同时填充齿状回的头侧/尾侧轴。比例尺为200 µm。
<img alt="带有限制性酶切位点的基因编辑序列图谱；DNA分析软件界面；序列注释。" src="/files/ftp_upload/53783/53783video1frame.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="补充视频 1 帧"> 
补充视频 1. 将 sgRNA 设计克隆至逆转录病毒和慢病毒骨架。 
在此合成向导 RNA（sgRNA）设计示例中，从小鼠 CHD8 的 NCBI 数据库下载其基因组序列。随后在 Vector NTI 中可视化起始密码子和外显子结构。这使我们能够复制首个编码外显子周围的基因组区域，并将该序列输入 Benchling。Benchling 可帮助我们可视化该区域内所有潜在的 sgRNA。此外，在指定已输入的基因组区域后，Benchling 将显示每条向导 RNA 的靶上和脱靶评分。用户可据此选择靶上和脱靶评分最高的向导 RNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）</a>

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9 系统构建可敲除目的基因的病毒，并通过立体定位注射将其注入成年小鼠脑内。

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

复制缺陷型慢病毒或逆转录病毒能够将外源基因稳定整合到被感染宿主细胞的基因组中。该技术……

本实验的总体目标是使研究人员能够设计并包装表达荧光蛋白、CAS9 和 sgRNA 的病毒，然后通过立体定位注射将其注入小鼠脑内。 该方法有助于解答神经科学领域中的特定问题，例如与神经及神经发育障碍相关的基因所起的作用。该技术的主要优势在于能够操控特定基因，而无需耗费大量时间和资源来培育基因工程动物。在准备细胞之前，使用网站设计一段20个核苷酸的引导链或sgRNA，用于后续设计单链寡核苷酸。在订购寡核苷酸并按照文本方案将其构建为最终质粒后，继续操作：将冻存管中所有解冻的细胞用移液器转移至一个15毫升的锥形管中。随后加入2毫升预热并经CO₂平衡的完全IMDM培养基。然后在500 × g条件下离心5分钟。之后吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于10毫升完全IMDM培养基中。将细胞接种至一个10厘米的细胞培养皿中，在37°C、5% CO₂培养箱中过夜培养。接种24小时后，吸除原有培养基，更换为10毫升预热的IMDM培养基。当细胞达到完全汇合时进行传代。传代时，吸除培养基，并用5毫升PBS洗涤培养皿。然后向培养皿中加入1毫升0.25%胰蛋白酶，在37°C孵育，直至细胞从培养皿表面脱落。随后，加入 0.5 毫升 IMDM 以中和胰蛋白酶反应，并用移液器将细胞转移至 1.5 毫升离心管中。接着，以 500 × g 离心 5 分钟。用 1 毫升 IMDM 重悬细胞，并将 10 微升细胞与 90 微升 PBS 混合进行稀释。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞，并用完全IMDM重悬细胞后重新接种。 第五天，在转染前两小时更换培养基，并确保10厘米培养皿中恰好含有10毫升培养基。接下来，使用两个5毫升圆底聚苯乙烯管为两块培养皿准备转染试剂。将第一个管标记为DNA，第二个管标记为2X HBS。然后用pH 7.4的Tris EDTA缓冲液将DNA浓度调整至1微克/微升。 制备慢病毒和逆转录病毒的转染试剂时，将所需组分缓慢加入标记为DNA的离心管中，同时持续轻弹管壁以混匀。随后，向标记为2X HBS的离心管中加入一毫升2X HBS溶液。接着，将DNA管中的内容物逐滴缓慢加入2X HBS管中，每次一滴。在每滴加入后持续轻弹2X HBS管，并观察磷酸钙沉淀的形成情况，以确保转染复合物成功生成。之后将该管置于室温下避光孵育30分钟。30分钟后，以缓慢滴加的方式将一毫升转染试剂加入每个10厘米细胞培养皿中，并将细胞在37°C条件下孵育过夜。 第六天更换培养基。第7天，使用10毫升血清移液管将含有病毒颗粒的培养基转移至50毫升锥形管中，随后于4°C保存。然后向每块细胞培养板中加入8毫升含0.5%胎牛血清的培养基。 第八天，收集含有病毒颗粒的细胞培养基，并将其与前一天收获的样品混合于50毫升锥形管中。在此步骤中，将病毒上清液在 2000 × g 条件下离心 10 分钟。随后通过 0.45 微米低蛋白结合注射器滤器过滤，以纯化病毒培养基。接着，向培养基中加入 5 倍浓度的聚乙二醇 6000 溶液。反复倒置试管数次以混匀。然后将病毒混合液在 4 °C 条件下孵育至少 12 小时。第9天，将病毒混合物在2500 × g条件下离心45分钟。45分钟后，弃去上清液，再短暂离心2分钟，随后再次弃去上清液。接着加入320 µL无菌PBS重悬沉淀，并在室温下置于摇床孵育30分钟。次日，将病毒分装并置于-80 °C冷冻保存。 开始此操作时，需剃除麻醉小鼠头部的毛发，以准备注射部位。将4%异氟烷导入鼻罩。随后将小鼠置于立体定位仪中。将其门齿插入咬合杆的凹槽内，并固定耳杆。确保动物身体位于加热垫上，鼻部处于鼻罩内。接着，通过捏压足部确认麻醉效果。然后涂抹人工泪液以润滑眼睛。随后用聚维酮碘和利多卡因擦拭已剃毛的头部。现在沿头皮中线做一个小切口。用棉签将颅骨擦干，并涂抹过氧化氢以帮助观察前囟。使用解剖显微镜，在颅骨上定位前囟，并将钻头置于其上方。将数字立体定位仪的 X、Y 和 Z 三个平面的坐标设为零。为确保头部在前后方向的 Y 轴上保持水平，将钻头置于人字缝处，并调整头部位置，使前囟和人字缝处的 Z 坐标均大致为零。为确保头部在 X 轴方向上保持水平，将钻头置于前囟与人字缝之间的中点位置，并从中点向两侧各一毫米处测量 Z 坐标，确保两侧读数相等。在将钻头移至目标坐标前，先将异氟烷浓度降至2%，然后小心地钻透颅骨。钻完所有孔后，将装有病毒的注射器固定在立体定位仪上。将注射器对准孔位中心，并将Z轴坐标在颅骨表面设为零。缓慢将注射器降至最深的Z轴位置，然后使用立体定位注射器以每分钟0.25 µL的速度开始注射。在最深Z轴位置完成注射后，等待一分钟，再将注射器提升至下一个Z轴坐标并再次开始注射。重复此过程，直至完成所有Z轴注射坐标的注射。最后一次注射后，等待两分钟再移除注射器。随后将小鼠从立体定位仪中取出，并缝合头皮。在手术部位涂抹利多卡因和抗菌药膏，并在将动物转移至加热恢复室前给予镇痛药物。此10倍视野荧光图像显示，高滴度逆转录病毒感染了大量细胞，可通过荧光标记物的表达来评估这些细胞的形态。在本示例中，表达GFP或mCherry的病毒被共同注射到齿状回。利用逆转录病毒系统，可使用一种携带GFP标记的病毒进行一种基因操作，同时使用另一种携带mCherry标记的病毒进行第二种基因操作，进而分别或联合评估每种病毒所引起的单一或叠加效应。这是注射范围的三维重建图像，其中在21个连续切面上追踪了病毒扩散的闭合轮廓。随后将这些轮廓 tracing 进行对齐，以生成用于体积定量的三维图像。总的病毒扩散区域以绿色显示，而齿状回局部扩散区域以紫色显示。该图像显示病毒沿注射针道和胼胝体扩散，同时填充了齿状回的头尾轴方向。 在体内病毒注射后，我们采用其他方法，如组织学、电生理学或活体显微镜下的双光子成像，来研究基因操作对神经元发育的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调由CAG重复扩增引起，导致易于聚集的蛋白质产生。本方案描述了载体构建、立体定位注射以及包涵体和神经元标志物丢失的分析方法，为研究神经退行性疾病的发病机制及评估靶向治疗策略提供了一个可控的实验平台。...

慢病毒诱导的纹状体病理作为多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调的临床前模型

学习利用CRISPR/Cas9系统设计和包装高滴度逆转录病毒与慢病毒，并通过立体定向注射精准递送至成年小鼠脑内特定区域。该方法无需构建转基因动物即可实现基因敲除，为研究神经系统疾病相关基因功能提供高效工具。

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

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