Summary
예로서, 뮤린 ABC 수송 Bcrp1 (ABCG2)을에 실리 프로토콜은 마우스 조직에서 발현하는 유전자로 대체 프로모터 사용량을 검출하고, 리포터 분석법을 사용하여 확인 된 다른 프로모터의 기능을 평가하기 위해 제공된다.
Abstract
일반적으로 번역되지 않은 - - 첫 번째 엑손 다른 조직에서 유전자 발현은 종종 독특한와의 mRNA의 합성 결과 다른 프로모터에 의해 제어된다. E1U, E1A, E1B 및 E1C : Bcrp1 (ABCG2)는 ABC 트랜스 포터 유방암 저항 단백질 (BCRP, ABCG2)의 쥐 orthologue는, 생산 대응하는 네 개의 대안 첫 번째 엑손에 의해 지정된 적어도 네 개의 대안 발기인이 있습니다. 여기에 실리 프로토콜은 Bcrp1에 대한 대체 발기인 사용량을 예측하기 위해 제공됩니다. 또한, 리포터 분석 방법은 다른 프로모터 리포터 작 제물을 제조하고,이 상류 식별 대안 제 엑손의 추정 프로모터의 기능을 결정하기 위해 설명된다.
Introduction
더 많은 인간 유전자의 절반 이상은 다른 발기인 (1)에 의해 조절된다. 각 대안 프로모터는 다른 대안 발기인에서와 다를 수 있습니다 조절 요소를 포함 할 수 있습니다. 하나의 조직에 사용되는 프로모터 (들) 다른 조직에서 사용되는 것과 다를 수 있습니다. 예를 들면, 소정의 신호 전달 경로의 활성화는 하나의 조직에 이용되는 유전자 대안 적 프로모터를 실행하면서도에 영향을 미치지 또는 다른 조직에서 이용되는 것과 같은 유전자에 대한 별도의 다른 프로모터를 금할 수있다.
Bcrp1 유전자의 발현은 다른 발기인이 적용됩니다. Bcrp1은 인간의 유방암 저항 단백질 (BCRP) 유전자의 쥐 orthologue입니다. BCRP는 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 트랜스 포터, 공식적으로 지정 ABCG2 2, 3입니다. 정점 세포막 단백질로서, BCRP / Bcrp1 기능 천연 및 생체이 다양한 기질을 유출하는
정상 및 종양 세포에서 BCRP 식의 규정을 이해하는 초기 연구에서 cDNA를 종료 (5'-RACE) BCRP의 mRNA의 분석 5 '빠른 증폭 정확한 전사 개시 사이트 (13)을 결정 하였다. 뿐만 아니라 다수의 발견 전사 개시 사이트시켰다 또한 BCRP에 번역되지 않은 첫 번째 엑손, 세 가지 다른 형태가되었다가 발생했습니다. 이러한 대안 첫 번째 엑손 - E1A 지정, E1B, E1C는 - 인체 조직의 다양한 다르게 표현했다. 두 개의 추가적인 제 엑손 변이체 BCRP 13 번째 엑손을 사용하여 인간의 EST 데이터베이스의 BLAST 검색에서 발견되었다. 네 경기는 상류 E1u를 지정되었다 엑손 2에서 첫 번째 엑손> 70킬로바이트를 한 것으로 밝혀졌습니다; 네 개의 다른 경기는 E1- (13)를 지정되었다 완전히 첫 번째 엑손 부족 BCRP의 mRNA를 밝혔다. 대안 리더 엑손의 존재는 다른 프로모터 사용 (14)의 표현 인 것으로 간주된다.
마우스에서, Bcrp1 네 다른 제 엑손 다른 마우스 조직에서 Bcrp 한 전사를 제어하는 프로모터 대신에 대응할 수 것이 기재되어있다; 이러한 엑손 / 발기인 E1U, E1A, E1B 및 E1C을 지정하고, 약있는 70, Bcrp1 엑손 2 5, 15 상류 58, 15, 및 5킬로바이트 E1A mRNA의 이소 형은 murin에서 지배적 인 것으로 밝혀졌다즉 조혈 줄기 세포, 심장, 폐, 비장, 뇌의 E1B 이성체가 골수 5, 15 마우스 대장, 태아 간 세포 및 적혈구 전구 세포에서 발현 된 반면. 상류 E1B로부터 프로모터 포스 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질 (p-CREB) 그 대안 고유 CREB 반응 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절 마우스 장내 Bcrp1 전사를 지배하는 중요한 대안 프로모터 것으로 나타났다 Bcrp1 프로모터 (16). E1C mRNA의 이성체가 주로 성인 쥐의 간 및 신장 (5)로 표현된다. E1U 이소 형은 5 표현 지배적 인 이소 인 쥐의 고환을 제외하고 테스트 대부분의 조직에서 발견 할 수없는 것입니다. Bcrp1은 (는 말기 정자 4를 보호 할 수있는 정액을 운반하는 내피 세포에서) 모두 체세포 (내피 꽉 접합, 세뇨관 myoid 세포와 세르 톨리 (Sertoli) 세포)와 배아 세포에서 발견되는 쥐의 고환에 표현했다. 등록상류 E1U에서 이온 steroidogenic 인자 -1 (SF-1) 5 기능 응답 요소가 포함되어 있습니다. Bcrp1의 mRNA와 단백질은 크게 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서 Bcrp1 발현 SF-1 (5)에 의해 제어되고 있음을 시사 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 SF-1 녹아웃 생쥐의 고환에서 감소된다.
구체적 방법을 제시 프로토콜에 실리 Bcrp1 대체 엑손 제를 검출하고, 상류 식별 된 다른 제 엑손에서 추정 프로모터 루시페라아제 기반 리포터 분석법을 확립.
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Protocol
마우스 EST 데이터베이스의 BLAST 분석을 사용하여 Bcrp1의 대안 첫 번째 엑손의 실리 예측 1.
참고 :이 프로토콜을 확인하기 위해 게놈 서열에 일치하는 EST 서열을 정렬하는 방법을 다음 마우스 표현 된 시퀀스 태그 (EST) (포함 번역 시작 사이트) Bcrp1의 2 엑손하는 서열의 유사성과 EST를위한 데이터베이스를 검색하는 방법에 대해 설명 자신의 Bcrp1 엑손 (2)의 5 '말단에 마우스 Bcrp1 유전자의 상대적인 위치.
- 의 Ensembl 게놈 브라우저 (17)의 검색 창에 mRNA를 참조 시퀀스 ID (NM_011920.3)를 입력하여 마우스 Bcrp1 엑손 2의 순서를 얻기를 클릭 "GO." 다음 화면에서, 전체 길이 시퀀스 (16 개의 엑손을 포함) 선택 :
- 다음 화면 ( "대본 기반 디스플레이")에서 "16 엑손 '을 선택합니다. 이 Bcrp1의 모든 엑손의 서열을 포함하는 화면이 표시됩니다. Bcrp1의 엑손 2 5 "읽9; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "기준 18에 도시 된 것과 유사한 것이다 얻어진 결과..
- "다운로드 순서"옵션을 클릭합니다. 다음 화면에서, FASTA 형식을 선택하고 다음을 클릭합니다 "미리보기." 다음 화면에서 클립 보드에 엑손 2의 미리보기 시퀀스를 복사합니다.
- 생명 공학 정보 (NCBI)의 웹 사이트 (20)를위한 국가 센터에 BLAST 홈페이지 (19)로 이동합니다.
- "마우스"게놈을 선택합니다. 쿼리 상자에 클립 보드에서 엑손 2 시퀀스를 붙여 넣습니다.
- 데이터베이스 드롭 다운에서 "EST를"를 선택하여 최적화 "매우 유사한 서열,"다음 선택 "BLAST를." 실행 시간은 몇 분 정도 걸릴 것입니다. 폭발 실행이 완료되면, "결과"페이지가 나타납니다.
- 은 "결과"페이지의 "설명"소호에서 (전체를 "ALL"다음 "다운로드"를 선택한 다음 "FASTA를 선택"드롭 다운 메뉴에서 다음 선택"순서) 계속 "A .txt 파일이 나타납니다;. 열려있는 클립 보드에 전체 파일을 복사 .txt 파일을 마우스 Bcrp1의 exon2 높은 서열 유사성을 가진 모든 EST를의 시퀀스가 포함되어 있습니다. 하지만 관계에서의 위치는 Bcrp1 유전자에 2 엑손합니다.
참고 : 2015 년 4 월 15 수행 분석이 Bcrp1 엑손 2. 정렬이 표 1에 나와있는 14 쥐 EST를 식별.
- Bcrp1 유전자에 2 엑손하는 5 '를 인 EST 서열의 위치를 확인합니다. 마우스 Bcrp1 유전자는 염색체 6 인접 NC_000072.6 (: 372099104 GI)에 위치하고 있습니다.
- 은 "전문 폭발"부제목 아래 BLAST 홈페이지에서 선택 "BLAST (bl2seq)를 사용하여 두 개 (또는 그 이상)의 순서를 맞 춥니 다."
- 쿼리 상자에 클립 보드에서 텍스트 파일을 붙여 넣기와 피사체의 순서 상자에 372099104를 입력합니다. 프로그램에서 "매우 유사한 서열"최적화선택 및 실행 BLAST.
- 결과 창이 나타나면, 그래픽 "선형"창에서 "그래픽"을 클릭하여 정렬을 볼 수 있습니다. 오른쪽 및 왼쪽 화살표를 사용하고 Bcrp1 / ABCG2와 서열 정렬에 초점을 확대합니다.
- 순서 정렬을 저장 : "설명"상자에 "ALL"을 선택한 후 "다운로드"드롭 다운 메뉴에서 "테이블 (CSV)를 히트"를 선택하고 다음을 클릭합니다 "계속합니다." 이 파일은 Bcrp1 엑손 2의 서열 정렬 및 마우스 염색체 6 인접에있는 뉴클레오티드의 번호를 기준으로 Bcrp1 Exon2에 서열 유사성을 가진 모든 EST 서열의 정렬이 포함되어 있습니다. 각 전체 EST 시퀀스는 Bcrp1 엑손 2 중첩 시퀀스를 포함하여 2 엑손하는 지역 5 '및 3'에 걸쳐 여러 정렬을 생성 할 수 있습니다.
- 엑손 (2)의 5 '말단의 위치는 6 번 염색체에 인접 뉴클레오티드 58655638에 대응하는 바와 같이,으로 지정할+1하고는 58,655,638 각각 EST (5 ')의 부분 서열의 위치를 계산한다. 14 EST를위한 결과는 표 1에 나타내었다.
참고 : 5 '잠재적 첫 번째 엑손로 (즉,이 음의 염기 값) +1에 있습니다 EST 서열을 분석하는 데주의해야합니다. 예를 들어, 표 1 (AI647825 및 AI664571)에 도시 Bcrp1 엑손 2 정렬 EST를 두 가지의 나머지 순서는 3 2 엑손하기 '입니다.
2. 평가 Bcrp1의 대체 발기인 기능
- 기자의 디자인 Bcrp1 E1U, E1A, E1B 및 E1C 프로모터에 대한 구축
- 에서 EST 데이터베이스를 검색 얻은 E1U의 시퀀스를 이용하여, +1로 E1U의 제 5 '뉴클레오티드를 나타낸다.
- 세균 인공 염색체 (BAC)의 상류 Bcrp1 / ABCG2 유전자 서열과 순서를 적어도 1백킬로바이트 포함 마우스 염색체 6의 복제를 얻Bcrp1 / ABCG2 유전자 (재료 및 장비의 목록 참조).
- 이러한 루시퍼 라제 리포터 플라스미드 pGL3-기본으로 적합한 기자 벡터를 식별합니다.
- 기자 벡터의 여러 복제 사이트를 확인합니다. KpnI으로, SacI로, Mlu1, 된 NheI,를 SmaI, XhoI에, BglII에 및 HindIII로 배향 '3'5에서 pGL3-기본 벡터의 다중 클로닝 부위에서 제한 효소 부위이다.
참고 : 소화 사이트의 순서는 제한 효소를 생산하는 회사의 제품 카탈로그에서 사용할 수 있습니다. - E1U 엑손의 모든 소화 사이트와 E1U는 DNA5 같은 소프트웨어 프로그램을 사용 '을 2킬로바이트 영역 (5)을 확인합니다. E1U 또는 2킬로바이트 상류 지역에서 발견되지 않은 pGL3-기본 다중 클로닝 부위에 적어도 두 개의 소화 사이트를 식별합니다.
참고 : 확인하기 위해 역방향 프라이머 위해 선택된 하나의 상류 인 정방향 프라이머에 대한 여러 복제 사이트 제한 사이트를 선택해야하는 삽입 줘야난 올바른 방향으로합니다.
- 앞으로 준비 및 상업 유전자 / 프라이머 합성 서비스 나 프라이머 선택 소프트웨어 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 선택된 pGL3-기본 다중 클로닝 부위의 제한 효소 사이트에 대한 시퀀스를 포함하는 PCR 용 프라이머 역. E1U 순서와 E1U 시퀀스 내에서 역방향 프라이머에서 ~ 2킬로바이트 상류에 위치하는 정방향 프라이머를 선택합니다. 저자들에 사용 된 프라이머 '전작 순방향 프라이머에서의 SacI 부위 및 역방향 프라이머의 된 NheI 부위를 포함하고, 상기 제 5 +64 약 -1,906의 게놈 영역을 증폭'로 지정 E1U의 뉴클레오티드 + 1 (위의 단계 2.1.1 참조), 참조 (16)에 제공됩니다.
- PCR은 0.01 BAC의 μg의 1이 프라이머를 사용하여 E1U 게놈 영역을 증폭하고, PCR 마스터 믹스에 변성 높은 충실도 Taq 중합 효소를 (재료 및 장비의 목록 참조) 포함(30) 72 ℃ (2 분)에서 확장자 초 후 PCR의 35 내지 40 사이클 및 어닐링에 사용되는 프라이머의 용융 특성에 기초하여 용해 온도가 95 ° C.
주 : 고성능 Taq 중합 효소의 사용은 높은 GC 함량이 시퀀싱 프로모터 영역에 대해 필수적이다. 예 주형 인 BAC 큰 게놈 DNA 단편을 사용하는 경우, 게놈 DNA의 2 차 구조가 곤란 PCR 프라이머가 결합 할 수 있도록 할 수있다. 이런 문제가 발생하면 긴 게놈 DNA 템플릿의 PCR 반응 전에 초음파에 의해 부드럽게 전단 경우 더 PCR 결과를 얻을 수있다. - 0.8 % TAE 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 1 킬로바이트 DNA 래더에 대해 비교하여, 증폭 된 PCR 산물의 길이를 확인한다.
- PCR은 0.01 BAC의 μg의 1이 프라이머를 사용하여 E1U 게놈 영역을 증폭하고, PCR 마스터 믹스에 변성 높은 충실도 Taq 중합 효소를 (재료 및 장비의 목록 참조) 포함(30) 72 ℃ (2 분)에서 확장자 초 후 PCR의 35 내지 40 사이클 및 어닐링에 사용되는 프라이머의 용융 특성에 기초하여 용해 온도가 95 ° C.
- 얻어진 PCR 생성물 및 pGL3-기본 벡터 다이제스트 제한을 사용하여 전방에 도입 된 제한 효소 부위에 특이적인 엔도 뉴 클레아 제 및 기능에 따라 역방향 프라이머제한 효소 소화가 공급 tructions.
- 키트 프로토콜 (21) 다음과 같은 상업 SV 젤과 PCR 클린 업 시스템 키트 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 소화 반응을 정화.
- 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 미가공 벡터에 대해 비교하여 벡터의 소화 및 선형화 확인 후 절단하고 절단 벡터 DNA 밴드를 정제. 정제 된 PCR 제품의 농도와 UV 분광법을 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 정제 벡터를 측정한다.
- 키트 프로토콜 (21) 다음과 같은 상업 SV 젤과 PCR 클린 업 시스템 키트 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 소화 반응을 정화.
- 정제를 결찰하여 E1U 기자 구문을 준비, 제한 효소는 소화 PCR 제품 및 pGL3-기본 반딧불이 루시퍼 라제 리포터 벡터 (리포터 분석 키트에 포함, 재료 목록 및 장비를 참조) 삽입에 : 11, 21, 31의 벡터 비율, 이에 E1U 연구 제조 키트 지시 (22)에 따라, "T4 DNA 리가 퀵 라이 게이션 키트"를 사용하여pGL3-E1U 이름 eporter 구조.
- 클론 적 조교 복제 키트 pGL3-E1U 다음 지침을 확장하는 박테리아를 변환하는 pGL3-E1U 플라스미드를 사용 (재료 및 장비의 목록 참조).
- 서열 분석에 의해 삽입의 방향과 충실도를 확인합니다.
- 준비 기자 E1U에 관해서는 비슷한 방법을 사용 E1A, E1B 및 E1C에 대한 구성한다. 섹션 2.1.5.2에서와 같이 염기 서열에 의한 삽입의 충실도를 확인합니다.
참고 : E1A, E1B 및 E1C의 프로모터 삽입이 있어야 할 약 -1,875 / + 10, -1,847 / + 60 및 E1A, E1B의 (+1로 지정) 처음 5 '뉴클레오티드에 -1,904 / + 83 기준, 각각 또는 E1C.
- 리포터 분석 방법
참고 : 기자 분석의 일반적인 전략 : 유전자의 추정 프로모터 (5 '업스트림 영역 것은)는 "reporte를 포함하는 빈"기자 "벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입다중 클로닝 부위로부터 하류 R 유전자 "(예를 들어, 개똥 벌레 루시퍼 라제). 벡터이어서 관심의 유전자를 발현 진핵 세포 내로 형질 감염된다. 활성화해야 이들 세포에서 관심있는 유전자의 발현을 촉진 트랜스 - 작용 인자 형질 리포터 벡터의 프로모터, 용이하게 발광 분석법으로 정량 할 수 반딧불이 루시퍼 라제의 발현을 일으키는.- 리포터 분석에 사용하기위한 적절한 세포주를 선택한다.
주 : E1U 다른 프로모터 리포터 구조물의 활성을 평가하기 위해, 즉 E1U 프로모터의 제어하에 Bcrp1 발현 세포로 형질 구축 할 필요가있다. TM4 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포 라인 (재료 목록 및 장비를 참조)는 Bcrp1 단백질을 표현하고 Bcrp1의 mRNA는 E1U뿐만 아니라 E1A, E1B 및 E1C 5를 포함. 음성 대조군으로, Bcrp1 단백질 또는 mRNA를 표현하지 않는 세포주를 사용하는 것이 좋습니다. - TM4 가전 문화200,000 세포의 초기 밀도 / 웰의 1에서 24 웰 플레이트에서 LLS : 햄 F12 배지와 1.2 g / L 중탄산 나트륨을 가진 둘 베코 변형 이글 배지 1 혼합물은 15 mM의 HEPES 5 % 말 혈청, 2.5 % 이전 5 바와 같이 37 ° C, 5 % CO 2에서 소 태아 혈청, 페니실린 (100 IU / ㎖) 및 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖).
- 여섯 시간 배양 세포를 배치 한 후, 빈 pGL3-기본 벡터 0.2 μg의과 또는 -1,906 / + 64 E1U 또는 -1,875 / + 10 E1A 또는 -1,847 / + 60 E1B를 포함 pGL3 벡터 0.2 μg의와 세포를 형질 또는 -1,904 / + 83 E1C Bcrp 1 삭제 상업 DNA 형질 전환 키트 제조 업체의 프로토콜 23을 사용하여, 내부 통제 등의 pRL-TK (A 레 닐라 루시퍼 라제 발현 벡터)의 4 NG와 함께 구성 (재료 및 장비의 목록 참조) .
- 30 시간 다음과 같은 형질의 cultur에서 성장 미디어를 제거혼성 세포를 형질. PBS 200 μl를 한 번 세포를 세척 한 후 세척 용액을 제거.
- 개똥 벌레 및 레 닐라 측정 된 루시퍼 라제 활성은 제조자의 프로토콜 (24)에 따른 상업용 키트를 사용.
- 내부 (레 닐라 루시퍼 라제) 제어부에 의해 분할 된 반딧불 루시퍼 라제 활성의 비율로 각 튜브에 대한 활성을 발현; 각 리포터의 활성은 1의 값을 특정하는 빈 pGL3 기본 벡터로 형질 감염된 세포의 상대적인 구성으로 전체적인 결과는 일반적으로 표현된다.
- 리포터 분석에 사용하기위한 적절한 세포주를 선택한다.
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Representative Results
리더 엑손의 분석에 의해 마우스 고환에서 Bcrp 한 다른 프로모터 활용의 식별
NCBI의 EST 데이터베이스 프로토콜 1에서 설명 된 단계 (2015 에이프릴) 프로브되었을 때, EST를 게놈에서의 위치와 함께, 하나의 mRNA를 표 1에 나타낸다 Bcrp의 엑손 (2)의 5 '말단으로 연속적인 것으로 나타났다 엑손 E1U (표 1)에 대응하는 mRNA를 엑손 2 ~ 70킬로바이트 상류 게놈 DNA의 서열을 갖는다 Bcrp 1 2 엑손에 인접 인 C57BL / 6J 마우스 정소 유래의 2 원 EST의 시작 DNA 상대. 마찬가지로, E1A, E1B 및 E1C에 해당하는 EST를 검출되었다. 참고로 E1C에 해당하는 두 개의 EST를 또한 E1C의 5 '말단에 접합 E1B를 포함한다는 것입니다. 이러한 예측 첫 번째 엑손의 위치에마우스 염색체 6에 Bcrp1 엑손 2의 관계는 그림 1과 같다.
Bcrp 한 다른 프로모터 기능의 평가
E1U, E1A에 해당하는 일반적인 루시 페라 제 분석 결과, TM4 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (2.2 절 참조)에 형질 E1B 및 E1C 프로모터 루시 페라 제 기자의 구조는 그림 2A에 표시됩니다.
이전의 연구에서, SF-1 응답 요소는 E1U 프로모터 5에있을 것으로 예상했다. 이 추정 SF-1 반응 요소가 마우스 정소에서 Bcrp1 전사의 조절에 관여하는 경우 E1U 프로모터 리포터 구조체에 해당 응답 요소 (이전 용지 (5)에 설명) 다음, 돌연변이 그 구조에 의해 생성 된 루시퍼 라제 활성을 줄일 로 형질 전환 된 때TM4 세포. 전형적인 실험의 결과는도 2b에 도시되어있다. 돌연변이 구조도 (이전의 용지 (5)에 기재되어 있음) SF-1의 강제 식 세포 빈 pGL3-기본 벡터의 것과 유사한 활성을, 미 돌연변이 구조보다 낮은 루시페라아제 활성을 나타내고있다. SF-1의 강제 발현 돌연변이 하나의 그 미 돌연변이 구조의 활성을 증가 아니지만.
그림 1. 쥐의 염색체 6.이 정렬 4 월에 수행 dbEST의 BLAST 검색에서 확인되었다와 Bcrp1 엑손 2 서열 동일성을 가진 EST를의 게놈 배열의 다이어그램, 2015 개의 별개의 정렬이 다른 첫 번째 엑손 E1U, E1A를 Bcrp1에 해당하는, 발견 E1B 및 E1C. 이 수치는 이전 발행 5에서 재생된다. 
그림 2. BALB / C 세르 톨리 (Sertoli) 세포 유래 TM4 세포에서 (A) 리포터 Bcrp1 발기인에 대한 분석 E1U, E1A, E1B 및 E1C. 데이터는 다른 날에 일 평균과 세 가지의 실험 표준 편차를, 절에 나와 2. 데이터를 설명하는 방법을하는 사용, 레 닐라 루시퍼의 정규화 반딧불 루시 페라 제의 발광으로 표현된다. 별표는 t -test의 (P <0.01)를 사용하여 빈 pGL3 벡터 제어에서 상당한 차이를 나타낸다. 이 수치는 이전 발행 5에서 재생된다. Bcrp1 E1U 재에서 SF-1 응답 요소의 돌연변이의 (B) 효과포터는 루시 페라 제 활동을 구성. Bcrp1 기자 (UN 돌연변이 돌연변이 나)와 TM4 세포로 형질 전환 된 추정 SF-1 결합 영역으로 구성한다 (SF-1 형질) 및 (형질 벡터)에 도시 된 SF-1. 데이터의 강제 발현없이 평균이다 3 가지의 실험, 다른 일에 수행; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 실험에 대한 개별 분석은 중복으로 수행되었다. T 개의 -test를 사용 E1U 프로모터 구조물에 비해 통계적으로 유의 한 차이 (B)됨을 의미한다 (P <상기 도면에서, (A)는 (P <0.05)를 t -test를 이용하여 빈 벡터 pGL3 제어에서 상당한 차이를 나타낸다 0.05). 이 그림은 이전의 출판물 5에서 재생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. Bcrp1 25 -28의 두 번째 엑손의 순서에 대해 마우스 EST 데이터베이스의 폭발 검색 할 수 있습니다. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 방법과 대표적인 결과의 대부분은 2013 5 년에 출판되었다 "마우스 고환에서 B의 crp1 전사 상류 steroidogenic 요소-1에 의해 규제 소설 첫 번째 엑손 (E1U)의 프로모터에 의해 제어된다"라는 이전 작업에 설명되어 있습니다 . 여기에 도시 된 대표적인 결과에 더하여, 이전의 논문은 5'-RACE PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하여 대안적인 제 엑손 활용 추정치를 제공 하였다. 또한, 인 실리코 상류 E1U 중 프로모터의 추정 SF-1 반응 요소의 인식을 수행하고, 염색질 면역 (칩) 분석은 SF-1은 추정 SF-1 반응 요소에 결합 된 것을 증명 하였다. 기능 연구는 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서, Bcrp 한 전사가 E1U 프로모터의 SF-1 응답 요소를 통해 SF-1에 의해 제어되는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능성 연구에 의해 TRA TM4 셀 SF-1의 상향 조절을 포함nsfection 또는 Bcrp 1 E1U의 mRNA의 강화 된 표현의 결과 히스톤 디 아세틸 라제 억제제 (vorinostat), 및 기자 분석에서 Bcrp 1 E1U 프로모터의 Bcrp 1 단백질의 증가뿐만 아니라 활동의 사용에 의해. 마지막으로,이 연구는 성인 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 SF-1 녹아웃 마우스의 고환에, Bcrp 1 E1U의 mRNA의 발현은 총 Bcrp 1의 mRNA 및 Bcrp1 단백질이 현저 5 감소 하였다는 증거를 제공했다. 같은 연구는 신장, 간, 고환, 뇌, 심장, 폐, 근육 및 비장을 비롯한 5 뮤린 조직의 다양한 이성체 Bcrp1 mRNA의 발현 패턴을보고 하였다.
모델로 Bcrp 하나의 조직 - 특이 적 조절을 이용하여 - - 여기에 설명 된 프로토콜의 차이를 결정하는 임의의 유전자의 전사의 복잡성을 해명하기 용이 한 실험 프레임 워크를 제공한다다양한 조직 또는 세포 아형의 식입니다. 에 실리 평가에 기술 된 프로토콜 단계에서 얻은 결과는 시간에 따른 소프트웨어 및 변경 될 수 있습니다 사용되는 데이터베이스를 수용하는 다양한 웹 사이트 이후 수 있음을 강조해야합니다. 여기에 제시된에 실리 방법은 EST 데이터 세트에있는 모든 인간 유전자의 약 18 %가 대체 발기인을 사용하는 것으로 추정 이전에 29 일보고 한 EST 데이터베이스 (dbEST)를 검색 이용한다. 에 "올리고 캡"방법을 사용하여 사람의 조직에서 cDNA를의 180 만 5'- 말단 시퀀스를 생성하기 위해 - - 다른 연구자가 있기 때문에 dbEST이 다른 첫 번째 엑손을 과소 평가 할 수 있습니다 검색 인간의 유전자와 추정에 대한 추정 전사 시작 사이트를 식별 할 수 있었다 연구 인간 나온 RefSeq 유전자의 52 %는 아마도 다른 발기인 1에 의해 규제되었다. 흥미롭게도, 후자 연구 발견 그가장이었다 고환과 뇌 추정 대안 발기인을 활용 한 조직; 또한, 그들은 전달 경로 신호에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 조직 특이 적 대안 발기인 1을 채택 할 가능성 것을 발견했다. 언급 한 단점에도 불구하고, dbEST은 최소한의 노력으로 여러 조직에서의 특정 유전자의 5 'UTR 사용량 거친 개요를 제공 분석한다.
dbEST 분석이 다른 첫 번째 엑손 사용에 용이 한 엿볼을 제공하지만, 우리는 매우 조사에서 조직 또는 세포 라인에서 첫 번째 엑손 사용을 확인하기 위해 cDNA를 종료 (5'-RACE) 분석 5 '빠른 증폭을 수행하는 것이 좋습니다. 상업 키트 (재료 및 장비의 목록 참조) 제조업체에서 제공하는 상세하고 간단한 절차, 5'-RACE 사용할 수 있습니다. 다소 시간 소모적이지만, 5'-RACE 실험은 실제 존재를 평가뿐만 아니라 제 대안 예들의 시퀀스를 제공한다관심의 mRNA의 기능; 또한, 복수의 전사 개시 부위의 존재는도 13을 검출 할 수있다. 충분한 표현을 보장하기 위해, 적어도 15-25 클론의 염기 서열이 필요합니다. 시퀀싱 전에 5 'RACE 제품에서 오염 벡터의 염기 서열을 제거하는 것이 필수적이다. 이렇게하지 않으면 BLAST 분석은 마우스 게놈 서열 정렬을 검출하도록 완전히 실패 할 수있다. 제 엑손 사용량이 확립되면, 5'-RACE 결과는 다른 제 엑손 후속 정량 RT-PCR 분석을 검증하는데 사용될 수있다. 일반적으로, 저자의 이전 작업 5'RACE 의해 회수 제 엑손 mRNA의 클론의 비율과 동일한 조직 또는 세포 라인 (5)로부터 소정의 다른 제 엑손 위해 회수 PCR 생성물의 비율과 상관 관계가 있다는 것을 발견했다. 또한, 상관 관계는 다른 Bcrp1 발기인에 대한 루시 페라 제 프로모터 구조의 활동 사이에서 발견 된차 특정 셀 라인 (5)에 대응하는 대안 첫 번째 엑손의 발현.
전체 기관을 사용하는 경우 조직 특이 적 대안 촉진제 사용에 대한 검색에서, 하나는있는 대안 발기인 / 첫 번째 엑손 등의 경우 등 선의 요소, 혈관, 간질, 같은 기관의 조직 이질성을 반영된다는 점에 유의해야합니다 예를 들어, 고환 체세포 (간질, 버팀, myoid 및 내피) 세포 및 종자 (반수체) 세포뿐만 아니라 혈관의 혼합이다. 조직 - 특이 제 엑손 발현을 조사하기 위해, 기관의 특정 조직을 분리 할 필요가있다.
다른 방법은 다른 프로모터의 사용 및 관리를 식별하기위한보고되었다; 그러나 이러한 차세대 시퀀싱을 필요 정보학 제조 많은 양의 데이터를 분석 할 수있는 컴퓨팅. 이러한 방법은 전체 transcriptosome 시퀀싱 (RNA의 서열), 그리고 칩 - 서열을 포함이러한 프로모터 (30)에 우선적으로 결합 H3K4me3, 같은 히스톤. 이러한 방법은 포커스가 몇 가지 특정 유전자의 발현 및 조직에있을 때, 디 노보 수행 고가 일 수 있지만, 기존의 데이터 마이닝은보다 실용적인 방법 일 수있다.
여기에 제시된 프로모터 활성을 추정에 대한 분석은 반딧불 루시 페라 제 유전자의 상류 여러 복제 영역을 포함하는 pGL3-기본 벡터를 사용한다. 발기인 활동은 상업적 루미 (재료 및 장비의 목록 참조) 발광 측정에 의해, 보조 인자의 추가 및 발광 기판 후, 쉽게 정량화 반딧불 루시 페라 제의 생산에 의해 측정된다. 관련 pGL4 벡터가 안정적으로 형질 감염된 세포의 생산을 가능하게 선별 마커 (예, 네오 마이신, 하이 그로 마이신, 퓨로 마이신)를 포함 할 수있다. 이 논문에 주어진 프로토콜은 일시적인 형질을 사용한다. PROMOT에 대한 일반적 기자 분석어 활성은 세포 수의 변화 및 형질 전환의 효율을 제어하기 위해, 구조적 레 닐라 (바다 팬지) 루시 페라 제 (의 pRL-TK)를 발현하는 벡터로 공동 형질을 사용하여 수행됩니다. 특정 유전자의 프로모터 분석을 확립에 중요한 단계는 관심의 유전자가 기자 구조와 형질 전환 된 세포주에서 발현되어 있는지 확인하는 것입니다. 다른 프로모터의 사용은 존재하는 경우 두 번째로, 이는 형질 전환 세포주에서 발현되는 첫 번째 엑손의 대안에 대응하는 프로모터 구조체를 사용하는 것이 중요하다. 예를 들어, 단독 E1B 프로모터의 제어하에 Bcrp1 발현하는 세포로 형질 전환 된 E1U 프로모터 구조에 대한 발광을 볼 것으로 예상하지 않는다. 대안 적으로, 음성 대조군으로는 리포터 유전자 형질 또는 관심 mRNA의 이성체는 반딧불이 루시퍼 라제의 NO 생성 초래한다 발현하지 않는 세포주에 구축.
는 C대체 발기인 사용의 onsequences는 같은 단백질의 생산, 서로 다른 단백질 29의 다른 N 말단, 또는 생산과 단백질의 생산을 포함한다. 여러 Bcrp1 / BCRP의 경우 (조직 - 또는 세포 형 특이 적) 프로모터 같은 단백질의 생성을 제어한다. 유사한 패턴은 CYP19 (아로마) 유전자 29, 31 존재한다. 여기에 제시된 프로토콜은 하나의 조직 또는 세포 라인에 대한 관심의 단백질의 전사 제어의 복잡한 메커니즘을 해독하는 데 사용할 수있는 기본적인 단계를 제공합니다.
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Disclosures
더글러스 D. 로스와 메릴랜드 대학, 볼티모어 인간 BCRP에 대한 특허권을 보유.
Acknowledgments
이 작품은 더글러스 D. 로스와 재향 군인 담당 부서에서 아리프 후세인에 대한 공로 검토 포상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
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