Summary
세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.
Abstract
세포 내 기록 단일 셀은 주어진 자극에 응답 할 수 있는지 결정하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다. 비전 연구에서는 세포 내 기록은 역사적으로 오늘날 사용되는 다른 빛의 자극에 각각의 광 수용체 세포의 민감도를 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술하고있다. 그러나, 눈에 세포 내 기록 실험을 복제하고자하는 연구자의 문헌에서 상세한 방법론의 부족이 남아있다. 여기에 우리가 더 일반적으로 눈의 생리를 조사하기위한 모델로 곤충을 제시한다. 곤충 시각 세포는 눈의 표면 근처에 위치하기 때문에 달성하기 용이 한 시각에 관련기구의 대부분은 동물 phyla의 걸쳐 보존되어있다. 우리는 전자에 약간의 사전 경험이있는 연구자들에게이 기술을 더 접근 할 수 있도록 목표로, 나비의 눈에서 광 수용체 세포의 생체 내 세포 내 녹음을위한 기본 절차를 설명lectrophysiology. 우리는 단일 셀에 유리 미세하고, 마지막으로 기록 절차 자체를 삽입하는 방법, 녹화 라이브 나비을 제조하는 방법에 필요한 기본 장비를 소개한다. 또한 각각의 세포 종류의 분광 감도를 판정하기위한 원료 응답 데이터의 기본 분석을 설명한다. 우리 프로토콜 분광 감도를 결정하는 단계에 중점을두고 있지만, 다른 자극 (예를 들면, 편광) 및 상기 방법의 변형이 설정에 적용될 수있다.
Introduction
이러한 신경 세포 등의 전기적 특성은 전압 또는 전류의 변화로 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 측정함으로써 관찰된다. 전기 생리 다양한 기술 세포 생체 이벤트를 측정하기 위해 개발되었다. 동물의 눈에있는 뉴런 액세스 할 수 있습니다 및 회로는 전기 생리 연구를 위해이 세포 좋은 후보를 만들고, 뇌보다 자주 덜 복잡하다. 눈에서 전기 생리학의 일반적인 응용 프로그램은 전위도 (ERG) 1, 2, 미세 세포 내 기록을 포함한다. ERG는 또는 동물의 눈에 전극을 배치하는 광 자극을인가하고, 모든 주변 셀 3-6의 응답의 합과 같은 전압에서의 변화를 측정하는 것을 포함한다. 하나의 개별 시각 세포의 분광 감도 특성에 특별히 관심이 있다면, 종종 여러 종류의 세포를 동시에 주어진 자극에 다른 힘에 반응; 따라서를눈의 스펙트럼과 유사한 시각 세포의 여러 가지 종류가 특히 ERG 데이터에서 특정 세포 유형의 감도를 결정하기 어려울 수있다. 하나의 잠재적 인 해결책은 눈 R1-6 대부분 세포에서 발현 관심 감광체 (옵신) 유전자로 형질 전환 된 초파리 만들고 ERG의 7 수행하는 것이다. 이러한 방법의 잠재적 인 단점은 감광체 단백질 (8)의 저 발현에는, 형질 전환 동물의 생성 및 스크리닝 긴 시간 프레임을 포함하지 않는다. 스펙트럼 별개의 광 수용체의 적은 종류의 눈에 들어, 컬러 필터와 눈의 적응함으로써, ERG 일부 세포 유형의 기여를 낮추는 분광 감도 최대 9의 추정을 허용 도움이 될 수 있습니다.
세포 내 기록 미세 전극 셀 impales 다른 기술되고 자극이인가된다. 전극 레코드는 해당 개인 노멀idual 세포의 반응은 기록 및 다수의 개별 셀을 분석하는 것은 생리 학적으로 서로 다른 세포 유형 10-14의 특정 감도를 얻을 수 있도록. 우리의 프로토콜은 분광 감도의 분석에 초점을 맞추고 있지만, 날카로운 전극 기록 세포의 기본 원칙은 다른 응용 프로그램에 대한 수정이다. 예를 들어, 시료의 다른 제제를 사용하여 날카로운 석영 전극을 이용하는 경우, 하나의 요구되는 문제에 따라서, 뇌 광섬유 로브 또는 다른 지역의 깊이에서 기록 할 수있다. 예를 들어, 각각의 감광 셀 (15)의 응답 시간은 광 세포 활성은 19과 같은 유사한 기술로 기록 될 수 있고, 또는 컬러 자극 편광 20로 대체 될 수있다 (16) (얇은, 골수 또는 lobula 17), 머리 (18) 또는 다른 신경 로브 -22 또는 운동은 23, 24을 자극.
Phototransduction, 프로세스의 광에 의해에너지를 흡수하고 전기 신호로 변환, 거의 모든 오늘날 동물 문 (phyla) (25)에 공통 고대 특징이다. 광 수용체 세포에서 발견 비주얼 phototransduction을 시작 책임이 시각 색소는 로돕신입니다. 모든 동물 Rhodopsins 망막 또는 유사한 분자 (26, 27)에서 파생 옵신 단백질 7 트랜스 G 단백질 결합 수용체 부류의 구성원과 연관된 발색단으로 구성된다. 아미노산 서열 및 발색 구조 옵신 광의 상이한 파장에 로돕신의 흡수에 영향을 미친다. 광자 발색단에 의해 흡수되면 로돕신은 궁극적으로 막 결합 이온 채널 (28)의 개구부를 리드 셀 G 단백질 캐스케이드를 개시 활성화된다. 대부분의 신경 세포와는 달리, 감광 셀은 빛 자극 변화에 응답하여 진폭 상대적인 변화로 측정 할 수있다 그레이드 전위 변화를 겪는다. 일반적으로 주어진감광체 종류 하나만 옵신 유전자 발현 (예외 8,10,29-31 존재하지만). 정교한 색각는 다양한 척추 동물 및 절지 동물에서 발견되는 종류의 각각은 하나 이상의 때때로 로돕신 유형을 나타내는 시각 세포 수백 또는 수천의 복소 눈으로 달성된다. 시각 정보는 컬러 및 모션 완전한 화상의 인식 결과 눈과 뇌 신경 신호 전달 복합체 하류를 통해 감광 모자이크 통해 응답을 비교함으로써 캡처된다.
세포 내 기록 통한 광의 상이한 파장에 대한 시각 세포의 원료 응답을 측정 한 결과, 분광 감도를 계산할 수있다. 이 계산은 시각 세포의 반응이 아니라 그것이 흡수 된 광자 (32)의 특정 특성에,이 흡수 된 광자의 수에 의존한다고 Univariance의 원리에 기초한다. abso 어떤 광자응답의 동일한 종류를 유도 할 것이다 로돕신 의해 rbed. 실제로, 이것은 셀의 원료 응답 진폭 (로돕신 높은 확률 그 파장을 흡수) (흡수 이상의 광자)의 광 강도의 증가 중 인해 증가 또는 피크 감도 향해 파장 시프트에 것을 의미한다. 우리는 알려진 강도와 다른 파장에서 반응 동일한 파장과 같은 강도하지만 알 수없는 상대 감도 세포 반응을 관련이 원리를 사용합니다. 세포 유형은 종종 파장에서 자신의 감도 피크로 식별됩니다.
여기에서 우리는 넓은 연구 커뮤니티에이 방법이 더 접근하기를 중심으로, 세포 내 기록과 나비의 눈에서 광 수용체의 분광 감도의 분석을위한 하나의 방법을 보여줍니다. 세포 내 기록 특히 곤충 색맹에 대하여, 문헌에 공통 남아 있지만, 우리는 그쪽 발견대상 및 방법의 t 설명은 일반적으로 기술의 재생을 허용하기에 너무 짧은 있습니다. 우리는 쉽게 복제를 허용의 목적으로 비디오 형식에서이 방법을 제시한다. 우리는 또한 쉽게 얻을 수 저렴한 장비를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 새롭고 복잡한 기술을 최적화 할 때 연구를 느리게 자주보고되지 않습니다 일반적인주의 사항을 해결합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물을 인도적으로 가능한 처리 하였다. 곤충은 코스타리카 곤충학 공급, 코스타리카에서 번데기로 제공되었다.
1.에 Heliconius 번데기 케어
- 꽉 모든 번데기는 곤충 핀을 사용하여 가습 실에서 2~3cm 간격을두고.
- 우화 후, 날개 후 건조 가습 챔버 내에서 적어도 하루 동안 살아 나비를 유지하고 기록하기 전에 매일 묽은 꿀 솔루션을 공급 할 수 있습니다.
- 볼륨 약 20 %의 꿀 용액에 물과 꿀을 희석하고, 얕은 페트리 접시에 붓는다.
- , 페트리 접시에 하나씩 개별 나비를 가져옵니다. 자신의 앞에 tarsi와 솔루션을 터치하면, 나비는 자동으로 proboscides을 확장하고 페트리 접시에서 마신다. 자신의 코가 자동으로 확장되지 않으면 밖으로 코를 끌어와 꿀 솔루션을 소개하는 집게를 사용합니다.
2. 광학 트랙, 교정 및 지표 성과실험 빛 조건의 장담
- 주택 및 범용 전원 공급 장치 및 밝은 백색광을 제공 할 하나 이상의 미터 길이의 테이블의 한쪽 끝에 부착 된 집광 렌즈 어셈블리와 150 W 크세논 아크 램프를 배치합니다.
주의 : 크세논 아크 램프는 강력한 UV 강도와 매우 밝은 빛을 생산하고 있습니다. 보안경 언제나 사용할 것 및 대기 산소와 UV 광의 상호 작용에 의한 오존의 축적을 방지하기 위해 제조자의 지시에 따라 램프가 사용되어야한다. - (그림 1)를 통과 하우징 어셈블리를 빠져 나가는 빛의 길이 광학 트랙 일m을 설정합니다.
- 떨어져 대략적인 거리와 광학 트랙에 다음과 같은 순서로 장소 : 1) 40cm 콘덴서 어셈블리에서 볼록 실리카 또는 석영 렌즈, 2) 또한 함께 빛의 경로에 현재없는 필터) 22cm와 감광 필터 휠 ( 트랙, 3) 드라이브 유닛과 셔터 ND 필터에서 14cm의, 4) 오목 실리카 또는 석영 렌즈 트랙의 끝을 따라 6cm 더 바로 셔터 다음과 인접하고, 5) 평행 빔 프로브.
- 평행 빔 프로브 직경 600 μm의 광섬유 케이블을 고정.
주 : 광 강도에 따라 직경 5~10mm 광섬유 케이블을 다른 상태로 준비 충분한 광을 제공하기 위해 요구 될 수 있고,이 대체 될 수있다. - 조립체를 빠져 나가는 광 빔 높은 강도 가능하도록 간격, 높이, 각 광학 소자의 각도를 조정한다.
- 광학 트랙 요소가 다른 응용 프로그램과 약간 다를 수 있으므로, 모든 요소가 UVA와 가시 범위 (315-700 nm의)에 빛을 투과 있는지 확인합니다.
- 광 선로가 조립되면, 분광기를 이용하여 설치 통과 광을 측정한다. 제 알려진 스펙트럼 제조업체의 소프트웨어 교정 램프를 이용하여 분광계를 보정.
노트: 우리는이 (예를 들면 Avantes)을 명확하지만, 다른 제조업체 오션 광학 제품을 사용하여 설정 다음 설명 유사한 제품을 판매합니다.- 측정하기 전에 텅스텐 교정 램프에 적어도 45 분을 돌립니다.
- 보정하려면, 설치 관련 소프트웨어를 컴퓨터에 USB를 통해 분광계를 연결합니다. 그리고 UV-볼 송신 코사인 보정을 통해 텅스텐 교정 램프 분광계를 연결합니다.
- "파일"탭에서 "새 절대 조도 측정"을 선택하고 같은 분광계 선택 "소스를."
- 새로운 보정 "CAL"파일을 만들 지시를 따릅니다. 프롬프트되면, 자동 분석 장치의 출력으로부터 상기 보정 스펙트럼을 계산 소프트웨어로 가시광 영역 (300 ~ 800 ㎚)에서 교정 텅스텐 램프 공지 스펙트럼 제공된 데이터 파일을로드.
- 교정 파일을 저장합니다. 때 initi이 파일을로드분광계를 사용하여 빛 스펙트럼의 모든 미래의 측정을위한 소프트웨어를 지향 모델.
- 분광계를 보정하면 실험 장치로부터의 광 스펙트럼을 기록 할 때 사용. 소프트웨어가 열릴 때 이하, "새 절대 조도 측정"을 선택하고 이전에 저장된 교정 파일을로드합니다. 다음 분광계 모든 빛을 차단하여 어두운 스펙트럼을.
- 현재 바람직한 실험 조명 조건을 측정하는 분광계, 적분 시간 (4 밀리 초)을 조정, 검사 (5) 평균하고, 박스 카 폭 (5)이므로 스펙트럼 적절히 스케일링 및 평활화되어있다. 다른 측정에서의 광 강도가 비교 될 수 있도록, 모든 스펙트럼 측정에 대해 동일한 설정을 유지합니다.
- 모든 감광 필터는 실험시 사용 되려면 감쇄 백색광 스펙트럼을 측정하고, 각각의 대역 통과 간섭 필터 (도 2).
- 엠분광계 단계 2.2.2에서 광섬유 케이블의 자유 단부를 부착하여 광 경로의 필터없이 백색광 스펙트럼을 easure. 단계 230에서로드 교정 파일, 텍스트 파일 분광계의 소프트웨어를 사용하여 백색광 스펙트럼을 저장한다.
주 : 스펙트럼 저장된 텍스트 파일 목록으로 파장 (X 좌표) 및 하나의 열 번째 열에서 빛의 강도 (y 좌표)에서, 데이터는 단계 2.6 스프레드에로드 될 수 있도록. - 단계 2.5.1과 동일한 설정을 사용하여, 광학 트랙 (ND) 필터 휠 감광 회전하여 실험 동안에 사용 된 각각의 광학 밀도 (OD) (0-3.5 OD)으로부터 스펙트럼을 기록하고 대한 텍스트 파일을 저장 각 OD.
- 단계 2.5.1과 동일한 설정을 사용하여, 광로에 의해 10 nm의 절반 대역 간섭 필터를 배치하고, 각 필터의 관측 스펙트럼을 기록한다. (41) 다른 간섭 필터의 각 w에 대해이 절차를 반복합니다i 번째 피크의 투과율은 300 내지 700 nm의 매 10 nm의 간격. 더 떨어져 (20 나노 미터) 간격 필터는 대부분의 응용 프로그램에 대한 허용 (스펙트럼을 위해, 그림 2 참조).
- 엠분광계 단계 2.2.2에서 광섬유 케이블의 자유 단부를 부착하여 광 경로의 필터없이 백색광 스펙트럼을 easure. 단계 230에서로드 교정 파일, 텍스트 파일 분광계의 소프트웨어를 사용하여 백색광 스펙트럼을 저장한다.
- 빛의 강도의 차이에 대한 정확한 간섭 필터는 광 경로에 배치되는 경우. 각각의 간섭 필터는 광자의 다른 갯수가 통과 할 수 있고, 일부의 필터 모두 낮은 송신 필터 광자 동수 허용되도록 어려운 더 강도를 감쇠시킬 수있다.
- 각각 10 nm의 대역 간섭 필터 상대 강도 (I)를 계산하기 위해, T는 (2.5.3부터) 각각 10 nm의 간섭 필터의 분광 곡선 아래의 면적 인 식 I이 = T / 초에서 I 풀기 및 S는 각각의 필터 (520 nm에서의 예를 들면도 2 참조)의 피크 파장에서 백색광의 최대 절대 조도 (2.5.1에서 저장 한 텍스트 파일의 Y 값)이다.
- 모든 계산 intensit 나눈다2.6.1에서 산출 된 최대 휘도 값에 의해 IES한다 (단계 6.4 참조)을 정규화 한 각 파장의 감도에인가 원시 보정 팩터로서 사용하기에 상대적으로 정규화 된 값의 역수를 취한다.
- 한 번만 실험 세트 전에 단계 2.6을 통해 2.1을 수행합니다. 실험의 과정을 통해 주기적으로 빛 자극의 강도가 변경되지 않도록하기 위해, 밝은 빛과 중성 밀도 필터에서 크세논 아크 램프의 절대 조도를 기록합니다.
- 간섭 필터를 투과 한 광에 대한 세포 반응이 최대 진폭 응답에 근접하는 경우의 실험 과정에서, 상기 신호를 감쇠시키는 ND 필터를 사용한다. ND 필터는 실험시 사용하는 경우, 분광 감도를 계산하는 동안 강도의 대응 감소를 차지한다.
- 실험을 시작하기 전에 광학 트랙, 교정 및 필터 일 또는 몇 주를 설정합니다. 필터 유지먼지 축적을 방지하기 위해 덮여있다.
3. 녹음 장비 설치
- 이러한 카아 던 팔 둘레 (다이어그램 그림 3 참조) 패러데이 케이지를 통해 교정에 사용 된 것과 같은 광섬유 케이블을 공급하고, 고니 오 미터 장치에 탑재합니다. 케이블은 약 10cm 떨어진 시험편의 눈에서 것이다.
- 전극 홀더를 진동 절연 테이블 금속 단계 장소 미세 조작기의 제어에 따라 스테이지의 바로 위에 (도 4)에 장착. 시료의 헤드 아암의 회전 운동에 의해 생성 구의 중심에 위치하도록 카아 아암 놓는다.
- (패러데이 케이지 내부의 준비 근처 headstage) (패러데이 케이지 외부) 앰프와 프리 앰프 시편이 배치됩니다 금속 단계 위의 headstage 마운트를 포함하는 세포 내 프리 앰프 시스템을 사용.
- 를 통해 headstage에 동축 케이블을 연결합니다BNC 연결. 동축 케이블의 다른 쪽 끝을 개방 단에 팁을 분할하고, 상기 내부 배선의 케이블의 외부 금속 외피를 분리한다.
- 타단에 악어 클립 절연 구리 와이어의 일단 (접지 전위로 유지) 외피 납땜. 이 악어 입 클립 시험편 플랫폼 (단계 5.1.4)의 금속 기준 전극에 접속된다.
- 기록 전극의 역할을하는 얇은 은선에 동축 케이블의 내부 와이어를 납땜. 이 전선은 충분히 얇은 단계 5.2.3에서 솔루션 채워진 유리 전극에 공급 될 수 있어야합니다.
- 눈에 전극을 낮출에 스윙, 그리고 밖으로 다시 전극이 눈에 한 번 다시 요동 할 수 있도록, 패러데이 케이지 외부 나무 벤치에 스윙 암과베이스에 부착 된 실체를 놓습니다.
- 패러데이 케이지가 제대로 접지되어 내부에 있는지 모든 금속을 확인합니다.
- 패러데이 케이지 밖에서 preamplif을 첨부(선택 사항) 50 ~ 60 Hz의 잡음 감속기의 입력에 어 및 BNC T-어댑터를 사용하여 오실로스코프의 한 채널에 출력을 연결합니다.
- T 어댑터의 다른 쪽 끝을 사용하여, 하드웨어의 한 채널 오실로스코프 통과 신호를 연결한다. 프리 앰프로 기록 응답 컴퓨터 소프트웨어에 의해 판독 될 수 있도록 USB 케이블에 의해 컴퓨터에이 하드웨어 첨부.
- 또 다른 T-어댑터를 사용하여 오실로스코프의 제 2 채널에 광학 트랙에서 셔터 드라이버를 부착하고 눈 (단계 5.5)로 전달되는 빛을 점멸의 빈도와 지속 시간을 제어하는 펄스 발생기에 연결합니다.
참고 : 장비 자체의 설정은 한 번만 수행해야합니다. 녹음을 시작할 준비가 될 때까지 여기에 휴식.
기록의 날 4. 준비
- 실험 전에 크세논 램프에 적어도 45 분을 켜고 PUL 전에 유리 미세 전극 풀러 적어도 30 분을 켭니다링 유리 전극.
- 모든 녹음 장비 (셔터, 앰프, 소음 제거기, 펄스 발생기, 오실로스코프, 데이터 수집 하드웨어)를 켜고 셔터가 그래서 빛이 광섬유 케이블을 통과하지 기본적으로 폐쇄되어 있는지 확인합니다.
- 미세 보로 실리케이트 (또는 알루미 노 실리케이트) 유리 미세 전극 풀러를 사용하여 유리 미소 전극을 (100-250 MΩ 저항이 이상적입니다) 당깁니다. 끌려 단지 몇 시간 이내에 유리 전극을 사용한다.
- 3 M 염화칼륨 (KCl을)와 전극을 백필. 분사 염색 등이 용액 연구자의 필요에 따라 변형 될 수 있습니다.
5. 시료 준비 및 녹화 절차
- 시편 준비
- 헤드와 고정되어 상기 튜브의 일단 부로부터 돌출하므로 핫 왁스와 작은 플라스틱 튜브 내부 개별 나비 부착. 코, 안테나, 날개 (그림 5) 아래로 왁스.
- t 누른 상태에서그는 왁스의 건조 조각으로 복부와 복부 뒤에 튜브 내부에 젖은 조직을 배치하여 가습 튜브를 유지. 시편이 완전히 고정되어 있는지 확인합니다.
- 자기베이스에 부착되는 볼과 소켓 조인트 작은 플랫폼에 왁스의 작은 조각을 사용하여 튜브를 탑재.
- 해부 현미경, 기준 전극으로 사용될 구기를 통해 헤드에 0.125 mm 직경은 와이어를 삽입한다. 실험 전에 완전히 플랫폼 기록 용 스테이지에 배치되면 단계 3.3.2의 동선이 클립에 수있는 방식으로 플랫폼에 와이어를 고정한다.
- 기준 전극은 적절한 위치에 있으면이를 빠르게 용융하고 와이어 주위 왁스를 냉각하여 장소에 보관 될 수있다.
- 작은 조각을 파괴 탄소 강철 면도날, 블레이드 홀더 블레이드의 그립 부분을 사용하고 끊다하면 각막 절삭에 사용.
- ~ (10 ommatidi을 작은 구멍을 잘라왼쪽 각막 직경) 탈수를 방지하기 위해 바셀린과 구멍을 면도칼을 사용하여 밀봉.
- 각막이 절단되면, 눈 체액이 신속하게 경화되므로 최대한 빨리 눈에 기록 전극을 삽입 불가능 전극을 삽입 할 수 있습니다. 가능하면 녹음이 일어날 장비에 절개를 수행합니다.
참고 :이 광학 디 포커스 바와 같이 바셀린은 눈의 나머지 부분에 번지 수 없습니다.- 아니 이미 무대 경우, 녹음 장비의 무대에 탑재 된 표본과 플랫폼을 배치합니다. 악어 클립을 사용하여 표본 플랫폼에서 기준 전극 단계 3.3.2에서 headstage 접지선을 연결합니다.
참고 : 동물을 조명하는 빨간색 필터를 사용 가능합니다. - 눈에 기록 전극을 낮추면서 입체경에서 표본을 간단히 불을 구즈넥 첨부 파일이있는 광원을 사용합니다.
- 에서유리 미세 전극의 뒷면에서의 KCl 용액에 단계 3.3.3에서 headstage에 연결된 실버 와이어를 르트. 전극 홀더에 유리 전극을 탑재합니다.
- 미세 전극 이전에 각막 위의 mm에 대해, 각막 잘라 구멍 바로 위에 있도록 전극 홀더를 조정합니다. 오실로스코프의 전위 (MV)의 큰 변화에 의해 나타낸 바와 같이 회로가 완료 될 때까지 미세 조작기를 사용하여 눈에 미세 전극을 낮춘다.
- 아니 이미 무대 경우, 녹음 장비의 무대에 탑재 된 표본과 플랫폼을 배치합니다. 악어 클립을 사용하여 표본 플랫폼에서 기준 전극 단계 3.3.2에서 headstage 접지선을 연결합니다.
- 일단 눈, 패러데이 케이지 외부 입체경 스윙하고, 표본을 조명 광원의 전원을 끄십시오. 눈이 적응 어두운가되도록 방은 어두운 보관해야합니다.
- 앰프에서 1 nA의 전류를인가 전압의 변화에 주목하여 전극의 저항을 확인합니다. 저항은 통상적으로 100 내지 250 MΩ의 범위에 있어야한다. 높은 저항은 차단 또는 전극의 굽힘 및 ELECTR의 낮은 저항을 나타내는입니다송시 파손.
- 셔터 50 msec의 지속 기간을 가진 광의 플래시 매 0.5 초를 허용하도록 열리고 펄스 발생기를 활성화하고 실험 기간 동안 점멸 지속 할 수있다.
- 이 50 밀리 초 시간의 섬광을 할 수 있도록 펄스 발생기를 조정합니다. 깜박 간의 지속 시간 0.5 초 일시 정지는 실험 기간 동안 가능한 적응 어두운 근처로 표본을 유지합니다. 오십 밀리 긴 플래시 지속 시간 등의 반응 동일한 진폭을 유도 할 가장 짧은 플래시 지속 시간에 가깝습니다.
- 시작과 실험 (단계 5.16)의 끝에서 모두 다시 측정 응답. 약 이십분 실험 과정 동안,이 플래시 설정 시간 이상 반응을 저하시키지 않는다. 다른 준비합니다 다음 플래시 설정을 조정해야 할 수 있습니다.
- 광섬유 케이블의 눈을 향해 지향되도록 카아 아암을 위치.
- 각각의 빛 플래시와 전압 변화에 대한 오실로스코프를 확인합니다.전압의 음의 변화는 전극이 아직 셀을 입력하지 않았 음을 의미한다.
- 이 최대 전압 응답이있는 눈에 각도로 위치 할 때까지 시편 주위에 카아 던 팔을 이동합니다.
- 가볍게 전극 홀더의베이스를 탭 또는 전치 증폭기에 버즈 기능을 사용하는 동안 양 방향으로 매우 작은 전극의 수직 움직임을 야기 앞뒤로 미세 조작기를 돌린다. 탈분극 광 응답 오실로스코프 (그림 6)에 표시 될 때까지 작은 조정을 계속합니다.
- 빛의 플래시 최대 규모의 탈분극 신호를 생성 입사각을 찾기 위해 다시 카아 던 팔을 조정합니다. micromanipulator에 작은 조정하고 전극이 안정적으로 셀을 기록하고 전체 실험 셀에 머물 것입니다 있는지 확인하기 위해 필요에 따라 앰프 버즈 기능을 사용하여 (단계 5.11 참조).
- 설정이 안정되면, RECO 시작rding. (: 노이즈 비율 1 신호 적어도 10) 안정된 녹화가 가능한, 낮은 소음, 그리고 지속적으로 큰 탈분극 응답을 휴식에 변화가 거의 있어야합니다.
- 컴퓨터의 소프트웨어를 실행, 4 채널 팝업 창을 열 것이다 "새로운 실험을"시작합니다.
- 500 MV에 소프트웨어 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 전압의 크기를 조정합니다. 제 2 채널이 함수 발생기에 의해 생성되는 사각 파를 기록하는 반면 신호 오실로스코프를 통해 데이터 수집 하드웨어에 공급되는 경우, 셔터가 열렸을 때 제 채널 나타내는, 실시간 전극으로부터 기록 된 응답을 표시 . 다른 두 개의 채널이 불필요하다.
- 녹음을 시작하고, 소프트웨어는 실험 기간 동안 실행할 수 있도록 오른쪽 하단에 "시작"을 클릭합니다. 응답이 분명 너무 축 × (시간)와 y (전압)의 줌을 조정합니다.
- 첫째, 흰색 빛으로, 3.5 OD (약 5 ~ 10 초)에서 ND 필터 휠 (10) 개별 응답까지 기록한다.
- 다음 레코드 OD 0.0까지의 모든 조합에서 OD 3.3에서 반응 동일한 수 후 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1 등. ND 필터 시리즈 이러한 응답 진폭 백화가 발생하면, 제 6에 응답하여 로그 강도 곡선을 제공하는 실험 과정 밝은 자극 적은 점멸을 사용할 것이다.
- 간섭 필터를 사용하여 모든 파장에 세포의 반응을 기록한다.
- 첫 번째 피크 파장을 찾을 수 있습니다. 광로 (0.0 OD)의 ND 필터없이 광로 UV 투과 필터를 배치하고 간단히 응답 진폭을 관찰한다. 피크 응답 할 영역의 일부 개념을 제공한다 청색 투과 필터, 녹색 송신 필터 및 적색 투과 필터와 반복한다.
- 약에 필터를 사용하면 350, 450, 550, 650 nm의은에 최대 감도의 일반적인 영역을 찾을 수단계 5.14.1. 모든 파장은 다음 단계에 기록되기 때문에 정확한 파장이 초기 탐색 단계에서 문제가되지 않는다. 추정치가 최대 민감도 존재하거나 나란히 기록되어있는 경우, 사용 파장 공지 빠르게 응답 피크의 동정을 행 하였다.
- 피크 응답 한 번 또는 가까운이 확인 된 경우, 10 응답 (약 5 초)이 파장에서 기록.
- 10 nm의 단계에서 300-700 nm의에서, 다른 간섭 필터와 피크 응답, 기록의 파장에서 녹화 후. 피크에서 시작하고 피크 응답이 520 nm의 경우,이 파장 먼저, 다음 510 nm에서 기록적인 응답, 530 다음에 예 (하나의 광 경로 하나에서 필터를 교환하여 모두 짧고 긴 파장 향해 단계 나노 미터, 500 나노 미터, 540 나노 미터, 490 나노 미터, 550 나노 미터 등 없음) 응답이 없을 때까지.
- 필터 당 최대 10 개의 응답 (5 초마다)을 가능하게합니다. 간섭 필터를 교환 할 때, 셀 RESP 허용번째 피크 응답이 시간이 지남에 따라 저하 여부를 모니터링하는 데 도움이되는 빛의 경로에있는 모든 필터가없는 백색의 1-2 점멸합니다. 응답 수를 줄이거 나 표백가 발생하는 경우 OD을 증가시킨다.
- 간섭 필터 하에서 반응이 0 OD 백색광 하에서 최대 응답에 너무 가까운 경우에, ND 필터를 감쇠. 간섭 필터와 본 실험에 사용 된 광섬유 케이블의 크기는 크게 광 강도를 감쇠 때문에 ND 필터는 일반적으로 필요하지 않다.
- 기록 이전 응답 진폭을 확인하기위한 pseudoreplicate 역할을하고 시간이 저하되지 않은 응답을 확인하는 데 도움이 피크 반응 주위 안정한 재 기록 파장이 남아있는 경우. 일단 모든 파장이 기록, 재 녹음 단계 5.12에서와 ND 시리즈에서 응답.
- 기록은 소프트웨어에 대한 완전한 클릭 "정지", 그리고 분석을 위해 녹음을 저장하면.
- 실험 후, 동결, 또는 신속하게 머리를 절단하고 가슴을 분쇄 한 다음 몇 분 동안 냉각에 의해 개인을 희생.
- 모든 장비를 종료합니다. 분석을 수행하기 전에 필요한 경우 여기에 휴식.
6. 스펙트럼 민감도 분석
- 원시 응답을 기록하는 데 사용되는 소프트웨어로, ND 시리즈 각각의 간섭 필터의 각 필터 (10)의 개별 응답의 평균 응답의 진폭을 계산한다.
- 단계에 기록 된 ND 필터 시리즈 5.12-5.13 (그림 7)의 응답 - 로그인 강도 (VlogI) 함수를 만듭니다. Y 축은 각 강도 X 축의 강도 (OD), 및 응답의 로그 단위를 플로팅함으로써 이것을한다.
- 다른 파장에서 셀의 분광 감도를 유도하기 위해, 일반적으로 단계 6.2에서 데이터에 나카 Rushton 방정식에 맞게, 그리고 서로 다른 파장의 t의 실험적으로 얻은 스펙트럼 응답을 관련이 식을 사용(이 경우 흰색 빛) 일정한 파장에 따라 그 반응을 유도하는 데 필요한 O를 상대 광자.
참고 : 나카 Rushton 방정식은 다음과 같습니다 나는 자극의 강도는 V / V 최대 = 내가 N / (I N + K의 N), V는 응답 진폭, V 최대 최대 응답 진폭이고, K는 자극이다 ½ V 최대를 제공 강도, n은 지수 기울기이다. 다양한 방법이 곡선 피팅 소프트웨어 또는 코드 기반 통계 패키지를 포함 VlogI 데이터를이 방정식에 맞게 사용될 수있다. - 간단한 계산 및 스프레드 시트 프로그램을 사용 나카 Rushton 방정식을 맞추기 위해 각 자극의 강도에 대한 VlogI 응답 데이터 변환 : 로그 [(최대 V / V) - 1]. 그 다음 최적의 라인의 식을 얻기 위해 변환 된 데이터의 선형 회귀를 수행한다.
참고 : V 맥스는 측정 된 응답보다 커야합니다; 이 일관성을 유지하기 위해,이 방법은 V 최대 1 % GRE로 추정가장 높은 측정 된 응답보다 ater에. - 회귀 직선의 식 (K)의 y 절편 / n은 음의 기울기를 취함으로써 지수 (N)를 추정 및 로그.
- 다른 파장에서 셀의 분광 감도를 유도하기 위해, 일반적으로 단계 6.2에서 데이터에 나카 Rushton 방정식에 맞게, 그리고 서로 다른 파장의 t의 실험적으로 얻은 스펙트럼 응답을 관련이 식을 사용(이 경우 흰색 빛) 일정한 파장에 따라 그 반응을 유도하는 데 필요한 O를 상대 광자.
- 추정 된 V 맥스, n 및 K의 매개 변수되면, (V)로 주어진 파장에서 측정 된 스펙트럼 반응에 연결하여 각 파장에있는 셀의 스펙트럼 반응을 유도하는 데 필요한 광자와 해결의 상대적인 수를 결정 I.에 대한
- 각 파장 (단계 2.4.3)에서 각각의 간섭 필터에 대한 보정 계수함으로써 단계 6.3에서 계산 된 자극의 세기 (I)를 곱한다.
- 그들이 비교 될 수 있도록 감도를 얻기 위해 모든 강도는 V 로그-I 곡선과 관련된해야합니다. V 최대 또는 K 1/2 각 파장의 강도를 관련하여이 작업을 수행 할 단계 6.2.3에서 계산.
- K. 각 보정 파장의 강도를 (6.4 단계) 빼기
- 그런 다음 각 파장의 강도를 들면, "이 추가거리 K "값에서, 및 다중 (-1)로 K합니다.
- 다음으로 각 파장에 직렬로 낮은 데이터 포인트의 절대 값을 가산함으로써 포지티브 모든 데이터 포인트를 가져온다.
- 단계 6.5.1에서 새로 계산 된 농도의 역수를 취함으로써 각각의 파장에서 감도를 찾을 수 있습니다. 감도 스펙트럼은 0과 1 사이에 오도록 데이터를 변환.
- 동일한 유형 평균 이상의 셀로부터 표준 오차 막대 또는 95 % 신뢰 구간 (도 8)와 최종 응답 플롯을 기록한 후에.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
녹화 설정의 많은 요소를 들어, 서면 설명은 충분한 정보를 제공하지 않는다.도 1은 완전한 녹화 설정에 관련된 구성 요소의 도면이다. 도 2에서, 스펙트럼 보정 팩터가 필요한 이유를 이해하고 이것이 정정을 계산하기 위해 필요하다 수득 백색광 각 간섭 필터 그려진다. 3 사진 및 이들에 사용되는 카아 아암의 다이어그램을 나타낸다 실험.도 4는 기록 단계 및 미세 조작기를 나타내는 합성 화상이다.도 5는 실험 나비 제제의 여러 단계를 도시한다.
기록이 시작되면, 플래시 광에 응답하여 음의 전압 변화는 전극이도 6a에서와 같이 셀의 외부에 있다는 것을 의미한다. 반응의 강도가 전극 근방에 따라시각 세포 및 플래시 광의 입사 각도로 기울어. 응답은 커야한다 (> 30 MV) 끝이 푹 찌르다하는 셀에 충분히 가까이 전에. 6B 그림은 시각 세포로 항목을 상징하는 빛 자극에 대한 명확한 탈분극 응답을 보여줍니다. 절대 진폭이 상당히 달라질 수 있지만, (적어도 40 MV) 휴지 전위는 안정적이어야하며 응답 진폭 커야한다. 우리는 상대 응답을 측정하므로이 신호 대 잡음비가 높은 것이 더 중요하다. 전위 변화를 크게 쉬고 경우 응답 파형을 보이는 비정상적 또는 최대 응답은 모든 간섭 필터가 불가능해진다 걸쳐 다음 대하여 응답을 비교 너무 낮다. 불가능한 기록의 예는도 6C, 6D에 나타내었다.
레코딩 완료 후, ND 응답 플롯되어야하며 나카 Rushton 식은 데이터 (33)에 장착해야이야hown 그림 7.이 수치는 간섭 필터없이 ND 필터 시리즈를 사용하여 그려집니다. 기록이 안정적이면 ND 필터 일련의 데이터는 이전과 이후의 실험과 유사해야한다. 프로토콜의 제 6의 계산에 설명 된 바와 같이 분광 감도는 주어진 파장에서 각 응답 (V)에 대한 (I)에 대한 해결 한 다음,도 7에 VlogI 플롯에 나카 Rushton 방정식 피팅에 의해 결정된다.
하나의 기록에서 파생 된 분광 감도의 대표적인 예는 (이 예제를 참고하시기 바랍니다 실제 계산 된 데이터를 보여 주지만,이 결과가 게시되지 않은 그대로 피크가 이동 된)도 8a에 도시된다. 세포 유형은 동일한 파장에서 최고 민감도 및 민감도 스펙트럼의 전체적인 형상으로 분류 될 수있다. 유사 세포 유형은 평균화되어 평균 감도 Figu의 각 파장에서의 표준 오차 막대 플롯도 8b를 다시. 곤충에서 발견되는 세 가지 일반적인 유형의 세포의 분광 감도가도 8c에 도시되어있다 (크기 및 오차 막대는 실제 데이터를 사용하여 계산되지만, 피크 시프트된다).
그림 1 :. 빛의 경로 기록 구성 요소의 도식은 설치 표본 및 하드웨어를 기록하는 표시됩니다. 광학 트랙은 패러데이 케이지 외부 나무 벤치에 앉아있다. 크세논 (Xe), 크세논 아크 램프, CD, 콘덴서 조립, LX, 볼록 렌즈, ND, 감광 필터 휠, Cf를, 간섭 필터, S, 셔터, LC, 오목 렌즈, 공동 , 평행 광 프로브 FO, 광섬유 케이블. 패러데이 케이지에 앉아시편 주위에 나무 벤치. 나무 벤치 위에 앉아하지만 아래를 진동 격리 된 대리석 테이블을 터치하지 않습니다. (RC)를 기록 및 기준 (RF) 전극 headstage (HS)에 부착된다. Rc를는 눈 (E)로 도입되고, Rf는 신체의 다른 부분 내로 도입된다. headstage는 패러데이 케이지 외부 전치 증폭기 (PA)의 설치 부분이다. 신호 협잡 노이즈 리듀서 (HB)를 통해 전치 증폭기에서 전달하고, 오실로스코프 (OS)로된다. 오실로스코프에서 신호는 PowerLab의 하드웨어 (PLB)를 통해이 Labchart 소프트웨어에 의해 판독 된 노트북 컴퓨터 (CPU)에 전달된다. 셔터는 오실로스코프의 제 2 채널 통과 함수 발생기 (FG)에 의해 제어되고,이 신호뿐만 아니라 기록하는 경우는 또한 하드웨어 PowerLab의 제 2 채널을 통해 전달 될 수있다.
그림 2 :. 화이트 라이트와 간섭 필터 스펙트럼 교정 인자를 계산하는 데 사용되는 프로토콜의 단계 2.5에서 측정 된 스펙트럼은 백색광뿐만 아니라 각각의 41 간섭 필터를 들어, 300에서 700 나노 미터로 표시됩니다. 각각의 간섭 필터 스펙트럼 광로 만 필터로 측정된다. T (520)는 520 nm의 피크를 가진 스펙트럼 필터 하부의 영역에 대응하고, S (520)는 필터, 520 nm의 피크 파장 백색광의 강도에 대응한다. 이러한 값은 프로토콜의 단계 2.6에 기재된 바와 같이 (이 경우에 520 nm의) 각 필터에 대한 보정 계수를 계산하는 데 사용된다.
도 3. 실험에 사용 카아 팔 둘레 설명 카아 아암 광섬유 케이블 보유 완전한 구형 회전 광이 기록되는 셀에 입사 적절한 각도로 전달 될 수 있도록 각도 조정을 허용한다. (A) 하향식보기. 각도 측으로부터 (B) 볼. 숫자는 모든 패널에서 같은 부분에 해당합니다. (1) 바닥 판의 수평면 내의 모든 원형 회전을 허용한다. (2) 수직 플레이트 수직면 아암의 전체 순환 회전을 허용한다. (3)이 실린더 단부에 광섬유 케이블 금속 지지대를 보유하고, (2)에 수직 인 원형 회전 2 수직 평면을 허용한다. (4) 광섬유 케이블이 유지되고 난n 개의 아암의 단부에 배치하고 빛이 실험 장치에서의 시료의 위치에 관한 것이다.
그림 4 :. 녹화 설정의 구성 요소 (A) 플라스틱 튜브는 시료를 보관하는 데 사용. (B) 시편과 튜브가 장착 된 플랫폼의 오버 헤드보기. 자기베이스 (1)와 볼과 관절 플랫폼 (C) 측면보기. 기준 전극은 플랫폼 (2)의 측면에 접착제 및 왁스 움직이지 유지했다. 기준 전극 악어 클립 감싸 및 headstage 기준 전극은 클립 수 첨부 영역 (3)을 제공하는 위치에 결합. 20X 배율 아래 (D) 전극 팁. 스케일 바, 25 μm의. (E) 단계, 전극 홀더 및 미세 조작기의 설치. headstage (1)와 상기 고정 장치기록은 와이어 (2) 악어 클립과 기준 전극 (3) 첨부. 전극 홀더 (4)가 수동으로 고정 미세 조작기 (5) 아래에서 포스트가 수직 이동을위한 노브로 조절 될 수 있거나 또는 가압 전극 홀더의 수평 운동으로 당겨질 수있다. 시료와 자기 플랫폼은 전극 홀더 아래 단계 (6)에 앉아있다. (F)는 패러데이 케이지 아래 앞까지 당겨 지거나 할 수있는 화면 녹화 설정을 둘러싸고 있습니다. 알루미늄 호일 위에 고무 패드로 모든 장비 아래에 배치됩니다. 광섬유 케이블 (1)은 외부 광 트랙 케이지 리드 및 스테이지 (3)를 향해 카아 아암 (2)에 의해 지시된다. 기록 무대와 조작 장치는 설정 아래에 대리석 테이블에 쉬고 모래 상자 (4)에 배치됩니다. 다른 모든 장비는 대리석 테이블에 닿지 않도록 나무 벤치 위에 달려있다. 모래 상자 구멍에 대리석 테이블 위에 앉아시편이 완전히 진동 적 나무 탁상에 장비에서 분리되도록, 나무 테이블에서 잘라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 나비 준비 (A) 나비 관과 머리, 날개에 삽입되고, 안테나 뜨거운 왁스로 고정된다. 무관심 전극 (1) 건조 왁스 편이 복부 (2) 웨트 티슈 시편 뒤에 배치를 보유하는 데 사용되는 입 부분에 삽입된다. (B) 머리의 근접 아래로 왁스 칠. 눈은 (1) 왁스 또는 파편으로부터 명백 유지에서 기록되어야하고, 상기 기준 전극 (2)의 입 부분에 삽입되어 제자리에 유지 위에 핫 왁스가 신속히 용융된다.(C) 핑크 화이트 시각 세포 층을 볼 수있는 눈으로 절단 구멍. 검은 색 안료과 노란색 체액은 존재하지 않는다. (D) 눈에 배치 유리 기록 전극 (1) 무관심 전극과 시편의 측면보기 (2) 오실로스코프에 표시되는 회로를 완료해야합니다 머리 스테이지에 부착. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
그림 6 :. 샘플 녹음에서 원시 응답 각 응답은 50 밀리 초 시간 (검은 막대)의 단일 빛 플래시에 해당합니다. (A) 막보아야 큰 음의 전압 변화의 일례셀에 들어가기 전에. (B) 깨끗한 기록은 일반적으로 적어도 40 MV를 약간의 배경 소음과 큰 탈분극 응답을 가져야한다. 인해 주 피크 (화살촉) 후에 음의 전위 변화 (C) 불량한 기록 예. (D) 나쁜 기록의 또 다른 예. 휴지 전위 변동이 큰 (빨간색 막대)과 응답 (화살촉)의 진폭을 가릴 수있는 배경 잡음의 다량 겪고있다.
그림 7 :. 응답-강도 로그 - 선형 기능 솔리드 원은이 실험적인 설정에, 0 OD 3.5에서 셀의 측정 된 응답을 보여줍니다. 빛의 강도는 로그 스케일에 있습니다. 매우 높은 농도에서 반응은 포화되고, 매우 낮은 강도에서 작은 응답 대신 제로 라인을 따라 낙하 지속. 티그는 나카 Rushton 식 (33)이 비선형 형상 (점선)에 설치된다.
도 8. 분광 감도 예 (A) 하나의 대표적인 셀의 응답을 기록하고, 상대 분광 감도를 계산 하였다. 이 세포의 피크는 푸른 빛에 최선가 응답 의미, 440 nm에서입니다. 단일 셀 데이터는 시끄러운 (380 nm에서 피크)를 보일 수 있습니다. 동일한 상대 피크 모양 (B) 세포를 함께 평균을 표준 오차 막대가 추가됩니다. 여기에, 일곱 개인의 일곱 파란색 셀은 셀 타입은 440 nm에서 빛을 최대로 구분이 종에서 존재한다는 강력한 증거를 제공하는 평균되었다. (C) 본 공정은 발견 된 모든 세포 타입에 대해 반복하고 같이 나타내 어질 수있다. 곤충 눈들은 분광 감도 그러나 일반적인 기능에 다양요법은 370 nm의, 440 nm의, 510 nm에서, 여기에 표시된 피크를 가질 수있다. 이들 분광 감도는 모두 데이터를 사용하여 계산되지만, 데이터가 아직 종 번역되지 않기 때문에 피크가 시프트되어, 주.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
세포 내 기록 때문에 관련된 많은 기술적 인 단계를 마스터하기 어려운 기술이 될 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 몇 가지 중요한 점을 고려해야합니다. 우선, 실험을 수행하는 적절를 진동 절연 테이블을 갖는 것이 중요하다. 많은 연구자들은 완전히 우수한 제진주는베이스로부터 분리 탁상 공기 테이블을 사용한다. 우리의 설치는 미세 조작기 / 전극 홀더 / 표본 스테이지 장치를 배치되는 상단에 샌드 박스와 두꺼운 대리석 테이블을 포함한다. 이 사내 가스 또는 압축 공기에 대한 액세스가 제한 사항입니다 특히, 공기 테이블에 효과적이고 더 저렴한 대안입니다. 추가의 진동 흡수 수단이 수동 에어 서스펜션 또는 테이블 다리 완충 요소의 첨가 등 취할 수있다 (예를 들어, 테니스 공, 자전거 튜브 두꺼운 겔 패드를 열림). 또한, 실험 장치는 내부에 필수적이다모든과 패러데이 케이지가 제대로 접지. 패러데이 케이지는 녹음 할 때 쉽게 케이지 내부에서 작업 할 때 제거하고 교체 할 수있는 앞의 금속 메쉬 스크린을 가져야한다. 주변 전기 노이즈 (주 AC 전원 공급 장치에서 특히 50 Hz의 잡음) 심지어 소량 그렇지 않으면 좋은 기록을 사용할 수 있습니다.
ommatidia, 개안을 둘러싼 시료, 체액 및 안료 층을 준비 할 때 성공적인 녹음을 방지 할 수있다. 각막에 구멍이 너무 큰 절단되면, 체내에서 체액 정상적인 펌핑 불안정 기록 결과 절단 부위에서 위아래로 이동하기 액면시킨다. 구멍이 절단되면, 체액 및 표면 색소 층이 바셀린 밀봉에도 뚫을 딱지로 급속 응고되므로, 가능한 한 빨리 눈에 전극을 얻는 것이 중요하다. 링거 용액 대신 바셀린 사용될 수있다. 접지 전극으로 도입 될 수있다구기 또는 절단 안테나의 그루터기로.
또한, 어두운 적응 가능한 동물을 유지하는 것이 도움이된다. 이 방법의 경우, 단계는 패러데이 케이지, 짧은 기간의 자극이 깜박입니다 (30 ~ 50 밀리 초) 및 플래시 (0.5 이상) 사이에 충분히 낮은 주파수를 입력에서 크세논 램프에서 미광을 차단, 매우 어두운 녹음실을 유지하는 것을 포함한다. 시각 색소가 광자를 흡수 할 때, 로돕신에서 발색단은 모든 -3- hydroxyretinal로 11- 시스에서 전환 - 트랜스 옵신 단백질의 구조적 변화를 유도하고, G 단백질을 시작 metarhodopsin로 전체 단지를, 활성화, 레티 날 종속. 높은 강도의 빛이 물리적으로 옵신 단백질에서 분리하는 발색단을 발생 때 사진 표백가 발생합니다. 이 나오며 전에 전극 만 안정적 일정 시간 동안 세포 내에서 응답을 기록하기 때문에 시간이 실험에서 제한 요소이고또는 멤브레인이 손상되었습니다. 이러한 이유로 우리는 세포가 복구 할 수 있도록 휴식하지 않지만, 우리는 우리가 시간이 지남에 따라 세포의 반응을 저하하지 않는 발견 플래시 지속 시간 및 주파수를 사용합니까. 이 사진 표백가 발생했을 경우 빛의 양 빈도와 강도를 감소하는 것이 중요하다.
막 관통 할 때 기록하는 동안, 전극에 의해 큰 전극의 끝 부분이나 큰 운동은 세포에 손상을 줄 수 있습니다. 만 좋은 팁 기록 셀을 접근 할 때 (이상 ~ 100 MΩ)과 작은 움직임이 사용되어야한다. 세포 내 기록이 뇌 레코딩과 같은 다른 애플리케이션에 적용되는 경우, 극히 작은, 튼튼한 전극은 석영 유리를 이용하여 인출 될 수 있지만, 특별한 풀러 이들 전극에 사용되어야한다. 제 프로그램 당기는 전극을 제조 할 때, 우리는, 전극을 메우기 모의 설정에 전극 홀더에 고정하고, 생리 식염수의 선단부와 접지 전극을 배치하여 선단 저항을 조사했다. 엔내선 우리는 오실로스코프의 전압의 변화를 측정하는 전류를 적용했다. 우리는 두 개의 축을 따라 이동하는 수동 미세 조작기를 사용하는 전극의 끝 부분을 이동합니다. 다른 조작기 세 축을 따라 이동 가능하고 이러한이 또는 더 복잡한 응용 프로그램에 사용될 수있는 디지털 것들을 포함하여 존재한다. 기록 단계를 구축하는 방법은 여러 가지가 있으며, 하드웨어와 소프트웨어의 다양한 유형의 기록에 사용 관측 데이터 분석이있다. 우리의 설치는 기록 장비 중 하나, 간단한 쉽고, 저렴한 설치를 나타냅니다.
VlogI 곡선을 작성하는데, 함수 나카 및 33 Rushton 등 플롯 응답 비선형 부분들 (34, 35)에 의해 개발 된 계정. 다양한 방법이 데이터 커브를 피팅하는데 사용되며, 다른 방법이 또한 적합하다하더라도, 우리는 곡선 피팅 소프트웨어를 필요로하지 않는 한 이러한 방법의 결과를 플롯 36,37 (
방법의 한계는 연구 유기체가 눈에 하나 이상의 유사한 옵신 유전자를 발현하는 경우가 mRNA의 가능성 시각 세포의 어느 스펙트럼 클래스에 대응하는 옵신 확인하는 것이 어려울 수 있다는 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위해,이 방법은 염료 주사와 동일계 하이브리드 또는 성공적 opsins를 식별하는 면역 결합 된 기록 셀 (10)을 표현.
우리의 방법은 간단하고 시각적 인 전기 생리학에 익숙하지 않은 연구자 액세스 할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학에서 흔히 있지만, 고유하고 명확한 방법은 재현이 방법은 어렵게, 문헌에 존재하지 않는다. 이 기술의 많은 변형이 존재하지만, 우리는 화합물 눈에 분광 감도를 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 생리 학적 데이터를 시각적 생태학과 진화 (41)의 이야기에서 증거의 중요한 부분입니다. 옵신 서열 변화는 표현형 변화의 유전 적 기초 조사 연구를위한이 방법 이상적, 시각 세포의 감도와 긴밀하게 연결되어 있습니다. 시각 세포의 감도 측정은 색각 42-46에서 중요한 차별 임계 값에 대한 생리 학적 기초를 보여주는 행동 색상 차별 분석와 결합 될 수있다. 예를 들어 초파리의 유전 적 또는 치료 적 조작,이 technique는 눈이나 뇌뿐만 아니라 47, 48의 적절한 생리 기능을 측정하는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 우리가 첫 번째 또는 두 눈의 세포 내 기록의 가장 복잡한 방법은 아니지만, 우리의 희망은 우리가 공식적인 신경 과학의 외부 연구 프로그램에서 재생 및 통합을위한 더 쉽게이 방법을 사용할 수 있도록 할 수 있다는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 격려를 우리에게 장비를 대출에 대한 카단 팔 둘레, 킴벌리 제이미 슨, 매튜 맥 헨리, 및 라주 Metherate의 제조 후반 루디 림 부르 흐, 감사 및 Almut Kelber와 켄타로 아리카. 이 작품은 ADB에 대한 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 KJM에 친목 및 NSF 부여 IOS-1257627에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
