Summary
Электрофизиологическая методика внутриклеточной регистрации демонстрируется и используется для определения спектральной чувствительности одиночных клеток фоторецепторов в соединении глаза бабочки.
Abstract
Внутриклеточные записи представляет собой мощный метод, используемый для определения того, как одна клетка может реагировать на данный стимул. В исследовании зрения, внутриклеточный записи исторически был распространенный метод используется для изучения чувствительности отдельных клеток фоторецепторов к различным световых раздражителей, которые до сих пор используются сегодня. Тем не менее, остается недостаток детальной методологии в литературе для исследователей, желающих повторить эксперименты внутриклеточные записи в глаза. Здесь мы представляем насекомое как модель для изучения физиологии глаза в более общем плане. Насекомых клетки фоторецепторов расположены вблизи поверхности глаза и, следовательно, легко добраться, и многие из механизмов, участвующих в видении сохраняются через животных фил. Мы опишем основные процедуры для внутриклеточной регистрации в естественных условиях фоторецепторных клеток в глазу бабочки, с целью сделать эту технику более доступной для исследователей с небольшим предшествующим опытом в еlectrophysiology. Введем основное оборудование, необходимое, как подготовить живую бабочку для записи, как вставить стекла микроэлектрода в одну ячейку, и, наконец, саму процедуру записи. Мы также объяснить основной анализ исходных данных отклика для определения спектральной чувствительности отдельных типов клеток. Хотя наш протокол фокусируется на определении спектральной чувствительности, другие стимулы (например, поляризованный свет) и вариации способа применимы к этой установке.
Introduction
Электрические свойства клеток, таких как нейроны наблюдаются путем измерения потока ионов через клеточные мембраны, как изменение напряжения или тока. Разнообразие электрофизиологических методов были разработаны для измерения биоэлектрического событий в клетках. Нейроны, найденные в глазах животных доступны и их схема часто менее сложна, чем в головном мозге, что делает эти клетки хорошими кандидатами для электрофизиологического исследования. Общие применения электрофизиологии в глаза , включают электроретинография (ЭРГ) 1,2 и микроэлектродного внутриклеточный записи. ERG включает в себя размещение электрода или на глаза животного, применяя легкий стимул, и измерения изменения напряжения в виде суммы ответов всех соседних ячеек 3-6. Если кто-то конкретно интересует, характеризующих спектральную чувствительность отдельных клеток фоторецепторов, часто несколько типов клеток одновременно реагировать на различные сильные на данный стимул; Таким образом,может быть трудно определить чувствительность специфических типов клеток из данных ERG особенно если существует несколько различных видов спектрально-подобных фоторецепторов в глазу. Одним из возможных решений является создание трансгенная Drosophila с фоторецепторов (опсина) гена интереса , проявленного в клетках большинство R1-6 в глаза , а затем выполнить эрг 7. Не потенциальные недостатки этого метода включают в себя не с низким уровнем экспрессии белка фоторецепторов 8, и долгое временные рамки для генерации и скрининга трансгенных животных. Для глаз с меньшим количеством видов спектрально различных фоторецепторов, адаптация глаз с цветными фильтрами может помочь при снижении вклада некоторых типов клеток к ЭРГ, позволяя тем самым оценку спектральной чувствительности максимумов 9.
Внутриклеточные записи другой метод, где тонкая электрод пронзает клетки и стимул применяется. Электродные записывает только что Indivответ idual ячейки таким образом , чтобы запись, и анализа нескольких отдельных клеток может дать определенные чувствительностей физиологически различных типов клеток 10-14. Хотя наш протокол фокусируется на анализе спектральной чувствительности, основные принципы внутриклеточной регистрации с острыми электродами изменяемый для других применений. Использование другого подготовку образца, например, и с помощью острых кварцевых электродов, можно записывать с глубже в зрительном доли или других областей в головном мозге, в зависимости от нами вопроса. Например, время отклика отдельных клеток фоторецепторов 15, активность клеток в зрительном кулачков 16 (пластинку, мозговое вещество или lobula 17), мозг 18 или других ганглиев 19 также могут быть записаны с подобными методами, или цветовые стимулы могут быть заменены с поляризацией 20 -22 или движение раздражители 23,24.
Фототрансдукции, процесс, посредством которого светэнергия поглощается и преобразуется в электрохимический сигнал, является древней чертой общей для почти всех присутствующих день животных фил 25. Зрительный пигмент, содержащийся в клетках фоторецепторов и отвечает за инициирование визуальной фототрансдукции является родопсина. Родопсины у всех животных состоят из белка опсина, член 7 трансмембранного G-белками семейства рецепторов, и связанный с хромофором , который является производным от сетчатки глаза или подобной молекулы 26,27. Opsin аминокислотной последовательности и структуры хромофора влияют на абсорбцию родопсина на различных длинах волн света. Когда фотон поглощается хромофора родопсина активируется, инициируя G-белка каскада в клетке , что в конечном итоге приводит к открытию мембраносвязанных ионных каналов 28. В отличие от большинства нейронов, фоторецепторов клетки подвергаются градуированные возможные изменения, которые могут быть измерены как относительное изменение амплитуды отклика с изменением светового стимула. Как правило, даннаятип фоторецепторов выражает лишь один ген Opsin (хотя существуют исключения 8,10,29-31). Сложное цветовое зрение, подобного во многих позвоночных животных и членистоногих, достигается с помощью сложного глаза сотен или тысяч фоторецепторов каждый, выражающих еще один или иногда типов родопсина. Визуальная информация фиксируется путем сравнения ответов по поводу фоторецепторов мозаики с помощью комплекса вниз по течению нейронной сигнализации в глаза и головного мозга, в результате чего в восприятии изображения в комплекте с цветом и движением.
После измерения исходных ответов фотоэлектрического клетки на различных длинах волн света через внутриклеточной регистрации, то можно вычислить его спектральной чувствительности. Этот расчет основан на принципе Univariance, в котором говорится , что реакция фоторецептора ячейки зависит от числа фотонов , она впитывает, но не от конкретных свойств фотонов она поглощает 32. Любой фотон, который абсоrbed по родопсина будет вызывать такой же ответ. На практике это означает , что амплитуда отклика сырой клетке будет увеличиваться за счет либо увеличения интенсивности света (фотонов больше впитывать), или к сдвигу длины волны к его пиковой чувствительности (высокая вероятность родопсина поглощать эту длину волны). Мы используем этот принцип в соотнесении клеточных реакций при известной интенсивности и той же длины волны в ответах на разных длинах волн и с той же интенсивностью, но неизвестной относительной чувствительности. Типы клеток часто определяются длиной волны, при которой их пики чувствительности.
Здесь мы покажем один из способов внутриклеточной регистрации и анализа спектральной чувствительности фоторецепторов в глазу бабочки, с акцентом на что делает этот метод более доступным для более широкого научного сообщества. Хотя внутриклеточная записи остается распространенным явлением в литературе, особенно в отношении цветового зрения у насекомых, мы обнаружили тхаТ описания материалов и методов, как правило, слишком коротка, чтобы позволить для воспроизведения техники. Мы представляем этот метод в видео-формате с целью разрешения ее более простой репликации. Мы также опишем технику с использованием легкодоступных и доступного оборудования. Мы обращаемся общие оговорки, которые часто не сообщается, которые замедляют исследования при оптимизации нового и сложная техника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны, как гуманно, насколько это возможно. Насекомые были погружены как куколок из Коста-Рики энтомологического снабжения, Коста-Рика.
1. Heliconius Куколки Уход
- Повесьте все куколки на расстоянии 2-3 см друг от друга в увлажненной камере с использованием насекомых булавками.
- После вылупления, дайте крылья, чтобы высушить затем сохранить бабочек в живых в течение, по крайней мере 1 день в увлажненной камере и подачи разбавленного раствора меда ежедневно перед записью.
- Развести мед с водой до примерно 20% -ного раствора меда по объему, и вылить в неглубокую чашку Петри.
- Принесите отдельных бабочек в чашку Петри, один за другим. После прикосновения раствора с их передней лапок, бабочки автоматически расширяют свои хоботных и пить из чашки Петри. Если их хоботок не распространяется автоматически, используйте пинцет, чтобы вытащить хоботок, и ввести его в раствор меда.
2. Оптический дорожки, калибровки и измерения дement экспериментальной условий освещения
- Поместите 150 Вт ксеноновой дуговой лампы с корпусом и универсальный блок питания и примыкающей конденсатора блок линз на одном конце стола, по меньшей мере один метр длинной, чтобы доставить яркий белый свет.
ВНИМАНИЕ: дуговые лампы ксеноновые лампы производят чрезвычайно яркий свет с сильными УФ-интенсивности. Защитные очки следует носить в любое время и лампа должна использоваться в соответствии с указаниями производителя, чтобы предотвратить накопление озона, вызванное взаимодействием УФ-излучения с атмосферным кислородом. - Настройка оптического следа одного метра в длину для света , выходящего из корпуса узла , чтобы пройти через (Рисунок 1).
- Место в следующем порядке на оптическом пути с приближенными далеко друг от друга: 1) выпуклый диоксид кремния или кварц линзы 40 см от узла конденсатора, 2) нейтральный фильтр плотности колеса (без фильтров в настоящее время в пути прохождения света) 22 см дальше вдоль трек, 3) затвор с приводным устройством 14 см от ND фильтраs, 4) вогнутая диоксид кремния или кварц линзы непосредственно примыкающей после затвора, и 5) коллиматорный пучка зонд 6 см дальше вдоль дальнего конца дорожки.
- Наклейте диаметр 600 мкм волоконно-оптический кабель для зонда коллиматорный пучка.
Примечание: В зависимости от интенсивности света, кабель оптический диаметр волокна 5-10 мм, может потребоваться, чтобы доставить достаточное количество света для других Preps и может быть заменен на это. - Отрегулируйте расстояние, высоту и угол наклона каждого оптического элемента таким образом, чтобы луч света, выходящий из узла находится на самом высоком интенсивности возможно.
- Поскольку оптические элементы дорожки могут незначительно отличаться с различными приложениями, убедитесь, что все элементы передачи света в UVA и видимой области спектра (315-700 нм).
- После того, как оптический трек собран, измеряют свет, который проходит через установку с помощью спектрометра. Калибровка спектрометра первого с использованием калибровочной лампы с известным спектром и программное обеспечение производителя.
Заметка: Мы опишем следующие настройки с использованием продуктов Ocean Optics для ясности , но и других производителей (например, Avantes) продают сопоставимые продукты.- Включите вольфрамовой калибровочной лампы не менее 45 мин до проведения измерений.
- Для калибровки, подключите спектрометр через USB к компьютеру с соответствующим программным обеспечением. Затем подключите спектрометр, предназначенный для калибровки вольфрамовой лампы с помощью УФ-видимой передающей косинусного корректора.
- Выберите "New Absolute Irradiance Measurement" на вкладке "Файл" и выберите спектрометр в качестве «источника».
- Следуйте инструкциям, чтобы создать новый файл калибровки "CAL". При появлении соответствующего запроса загрузите прилагаемый файл данных для известного спектра калибровочного вольфрамовой лампы в видимом диапазоне света (300-800 нм) в программное обеспечение, которое автоматически вычисляет исправленный спектр с выхода спектрометра.
- Сохраните файл калибровки. Загрузите этот файл, когда INITIального программного обеспечения для всех будущих измерений светового спектра с помощью спектрометра.
- После того, как спектрометр калибруется, используйте этот параметр для записи светового спектра от экспериментальной установки. В дальнейшем, когда программа открыта, выберите "New Absolute Irradiance Measurement" и загрузите ранее сохраненный файл калибровки. Затем возьмите темновой спектр, перекрывая весь свет на спектрометре.
- С помощью спектрометра в настоящее время измерения желаемых условий эксперимента света, настроить время интегрирования (4 мс), сканирование в среднем (5), и ширина грузовой вагон (5), поэтому спектр правильно масштабируется и сглажены. Хранить настройки одинаковы для всех спектральных измерений, так что можно сравнить, что интенсивность света от различных измерений.
- Измерение спектров для незатухающей белого света, для всех фильтров нейтральной плотности , которые будут использоваться в ходе экспериментов, и для каждого полосового интерференционного фильтра (рисунок 2).
- Мeasure белого света спектр без каких-либо фильтров на пути прохождения света, прикрепляя свободный конец волоконно-оптического кабеля с шага 2.2.2 спектрометра. С помощью файла калибровки, загруженного с шага 2.3, за исключением белого светового спектра с использованием программного обеспечения спектрометра в виде текстового файла.
Примечание: Спектры сохранены в виде списка текстовых файлов длины волны (координаты х) в одной колонке, а интенсивность света (Y координаты) во втором столбце, так что данные могут быть загружены в таблицу для шага 2.6. - Используя ту же установку, как на стадии 2.5.1, запись спектра от каждой оптической плотности (OD) (0-3.5 OD), используемых в экспериментах при вращении нейтральной плотности (ND) фильтр колеса в оптическом пути, и сохраните текстовый файл для каждый из ОП.
- Используя ту же установку, как на стадии 2.5.1, поместите нм половину помех полосы пропускания 10 фильтров один за другим в пути света и записывают спектр наблюдаемого для каждого фильтра. Повторите эту процедуру для каждого из 41 различных интерференционных фильтров шПиковые Ith коэффициентов пропускания через каждые 10 нм от 300 до 700 нм. Фильтры разнесены дальше друг от друга (20 нм) являются приемлемыми для большинства применений (для спектров, смотрите Рисунок 2).
- Мeasure белого света спектр без каких-либо фильтров на пути прохождения света, прикрепляя свободный конец волоконно-оптического кабеля с шага 2.2.2 спектрометра. С помощью файла калибровки, загруженного с шага 2.3, за исключением белого светового спектра с использованием программного обеспечения спектрометра в виде текстового файла.
- Корректное различия в интенсивности света, когда интерференционные фильтры расположены на пути прохождения света. Каждый интерференционный фильтр позволяет передавать другое общее число фотонов, а низкая передача некоторых фильтров затрудняет дальнейшее затухают интенсивности так, чтобы все фильтры позволяют одинаковое количество фотонов.
- Для вычисления относительной интенсивности (I) для каждого 10 нм интерференционной полосы пропускания фильтра, решить для I в выражении, I = T / сек, где Т представляет собой площадь под спектральной кривой каждого узкополосного фильтра 10 нм (от 2.5.3) и s является максимальная абсолютная освещенность (у значение сохраненного текстового файла из 2.5.1) белого света на длине волны пика каждого фильтра (см рисунок 2 для примера при длине волны 520 нм).
- Разделите всю рассчитанную intensitх годов по значению максимальной интенсивности, рассчитанной в 2.6.1 для нормализации к одному, и взять обратную относительных нормированных значений для использования в качестве поправочного коэффициента применяются к необработанным чувствительности на каждой длине волны (см Шаг 6.4).
- Выполните шаги с 2.1 до 2.6 и только один раз перед набором экспериментов. В течение эксперимента периодически записывать абсолютную плотность потока излучения дуги ксеноновой лампы при ярком свете и фильтры нейтральной плотности, чтобы убедиться, что интенсивность светового стимула не изменяется.
- В ходе эксперимента, если какой-либо клеточный ответ на свет, пропускаемый через интерференционные фильтры приближается к максимальной амплитуды отклика, использовать фильтры ND, чтобы ослабить сигнал. Если ND фильтры используются во время эксперимента, приходится соответствующее уменьшение интенсивности во время расчета спектральной чувствительности.
- Настройка оптической дорожки, калибровки и фильтры дней или недель до того, эксперименты начинаются. Держите фильтрыпокрыты, чтобы предотвратить накопление пыли.
Установка 3. Запись оборудования
- Поток один и тот же волоконно - оптический кабель , используемый для калибровки через клетку Фарадея , и крепление на гониометрического устройстве , например, карданным рычага периметра (см рисунок 3 диаграммы). Кабель будет составлять около 10 см от глаз образца.
- Поместите сцену металла на колебательно изолированных стол с держателем электрода монтируется непосредственно над сценой под контролем микроманипулятора (рисунок 4). Поместите руку Карданный так, что голова особи находится в центре шара, созданного вращательного движения руки.
- Используя внутриклеточный систему предусилитель, которая включает в себя усилитель (вне клетки Фарадея) и предусилитель (headstage, рядом с преп внутри клетки Фарадея) Установите headstage над сценой металла, где будет помещен образец.
- Подключите коаксиальный кабель к headstage ЧЕРЕЗBNC соединение. Лопнуть только кончик на другом конце коаксиального кабеля, и отделить наружную металлическую оболочку кабеля от внутреннего провода.
- Припой внешнюю оболочку (удержан заземлены) на одном конце изолированного медного провода с зажимом аллигатора на другом конце. Этот крокодил будет прикрепить к опорному металлического электрода на платформе образца (этап 5.1.4).
- Припой внутренний провод коаксиального кабеля к тонкой серебряной проволоки, чтобы служить в качестве регистрирующего электрода. Этот провод должен быть достаточно тонким, чтобы быть в раствор подают заполненные стеклянного электрода на этапе 5.2.3.
- Поместите стереомикроскопа, прикрепленный к поворотного кронштейна и основания на деревянной скамье вне клетки Фарадея, так что он может быть повернут, чтобы опустить электрод в глаза, и качнулся обратно снова после того, как электрод находится в глазу.
- Убедитесь, что все металл внутри клетки Фарадея правильно заземлен.
- За пределами клетки Фарадея, прикрепите preamplifэ ко входу шума редуктора 50-60 Гц (опционально), и подключить выход к одному каналу осциллографа с помощью BNC T-адаптер.
- С помощью другой конец Т-образного адаптера, подключите сигнал, проходящий через осциллографу к одному каналу аппаратных средств. Прикрепите это оборудование к компьютеру с помощью кабеля USB, который позволит ответы, записанные с предусилителя для чтения программного обеспечения на компьютере.
- Установите драйвер затвора от оптической дорожки ко второму каналу осциллографа с помощью другого T-адаптер и подключить к импульсным генератором, который будет регулировать частоту и продолжительность вспышек света, доставленных в глаза (шаг 5.5).
Примечание: Установка самой буровой установки должны только сделать один раз. Перерыв не здесь, пока готовы начать запись.
4. Prep в день записи
- Включите ксеноновой лампы, по крайней мере за 45 мин до начала эксперимента и включите стекло микроэлектродов съемника по крайней мере за 30 минут до имплин стеклянные электроды.
- Включите все записи оборудования (затвора, усилитель, шум выпрямитель, генератор импульсов, осциллограф, и сбора данных оборудования) и убедитесь, что затвор закрыт по умолчанию, поэтому свет не проходит через волоконно-оптический кабель.
- Вытащите тонкую боросиликат (или алюмосиликат) стекла микроэлектродов (100-250 сопротивление МОм идеально) с использованием стеклянного микроэлектрода съемник. Используйте стеклянные электроды в течение всего нескольких часов, чтобы быть тянул.
- Засыпка электродов с 3 М хлорида калия (KCl). Обратите внимание , что это решение может быть изменено в соответствии с потребностями исследователя, например , краситель инъекции.
5. Образец Prep и порядок записи
- Подготовить Specimen
- Приклеивать отдельные бабочку внутри небольшой пластиковой трубки с горячим воском, так что голова неподвижна и выступает из одного конца трубы. Воск вниз хоботок, усики и крылья (рисунок 5).
- Удерживайте тон брюшко с сухим куском воска и держать трубку увлажненного путем размещения мокрой ткани внутри трубы позади брюшной полости. Убедитесь, что образец полностью неподвижен.
- Установите трубу с помощью небольшой кусочек воска на небольшой платформе с шаровым шарниром, который присоединен к магнитному основанию.
- Под микроскопом рассекает, вставить серебряной проволоки диаметром 0,125 мм в головке с помощью ротовых для использования в качестве опорного электрода. Перед проведением эксперимента, постоянно фиксировать провода к платформе таким образом, чтобы медный провод в шаге 3.3.2 может клип на нее, как только платформа находится на стадии записи.
- После того, как эталонный электрод находится в подходящем положении она может быть закреплена на месте с помощью быстро тает, а затем охлаждения воска вокруг провода.
- Использование ломким из углеродистой стали лезвие, рукоятка часть лопасти с держателем ножа и отломить небольшой кусочек, чтобы использовать для резки роговицу.
- Вырезать небольшое отверстие (~ 10 ommatidiв диаметре) в левой роговицы с помощью бритву и загерметизировать отверстие с вазелином, чтобы предотвратить высыхание.
- После того, как роговица разрезается, вставить электрод записи в глаз так быстро, как это возможно, потому что лимфа в глаза будут быстро затвердевать и сделать его невозможно вставить электрод. Если это возможно выполнить рассечение в вышке, где запись будет иметь место.
Примечание: Вазелин не должны быть смазаны на остальной части глаза, как это будет расфокусировки оптики.- Если уже не на сцене, поместите установленный образец и платформу на сцену в вышке записи. Подключите headstage провод заземления от шага к 3.3.2 эталонного электрода на платформе образца с помощью зажимов-крокодилов.
Примечание: Если возможно использовать красный фильтр, чтобы осветить животное. - Используйте источник света с Gooseneck вложениями кратко освещают образец под стереоскоп при опускании электрода записи в глаз.
- ВSert в серебряную проволоку, соединенную с headstage с этапа 3.3.3 в раствор хлорида калия на задней стеклянной микроэлектроде. Установите стеклянный электрод на держателе электрода.
- Отрегулируйте держатель электрода так микроэлектродов непосредственно над отверстием предварительно разрезанную в роговице, около миллиметра выше роговицы. Опустить микроэлектрода в глаз с помощью микроманипулятора, пока цепь не будет завершено, как показано большим изменением потенциала (мВ) на осциллографе.
- Если уже не на сцене, поместите установленный образец и платформу на сцену в вышке записи. Подключите headstage провод заземления от шага к 3.3.2 эталонного электрода на платформе образца с помощью зажимов-крокодилов.
- После того, как в глаза, качаться стереоскоп вне клетки Фарадея, и выключите источник света, освещающий образец. Помещение должно быть темным, поэтому глаз становится адаптируются к темноте.
- Проверьте сопротивление электрода путем подачи тока 1 нА от усилителя, и отмечая изменение напряжения. Сопротивление должно быть, как правило, в диапазоне от 100-250 МОм. Более высокие сопротивления свидетельствуют о закупорке или изгиб электрода и низких сопротивлений Электрода поломка.
- Активируйте генератор импульсов, так что затвор открывается позволяет вспышку света с 50 мсек через каждые 0,5 сек, и позволить ему продолжать мигать в течение всего срока эксперимента.
- Отрегулировать генератор импульсов, так что позволяет вспышки до 50 мсек. Эта длительность и 0.5 сек пауза между вспышками сохраняет образец как можно ближе к темноте, адаптированной, насколько это возможно во время эксперимента. Пятьдесят Мс близка к короткой продолжительности вспышки, которые будут вызывать ту же амплитуду в ответ, как более длительные вспышки длительностью.
- Re-мера ответы как в начале и в конце эксперимента (шаг 5,16). В течение примерно двадцать минут эксперимента эти параметры вспышки не ухудшают реакцию в течение долгого времени. Различные Preps может потребовать корректировки этих настроек вспышки.
- Расположите руку Карданный таким образом, что волоконно-оптический кабель направлен в сторону глаза.
- Проверьте осциллограф для изменения напряжения с каждой вспышкой света.Отрицательное изменение напряжения означает, что электрод еще не вошел в клетку.
- Перемещение рычага Карданный вокруг образца до тех пор, пока не будет расположена под углом по отношению к глазу, при котором существует максимальный отклик напряжения.
- Поверните микроманипулятор назад и вперед, в результате чего очень небольшие вертикальные движения электрода в обоих направлениях, слегка нажав на основание держателя электрода или с помощью функции Живой ленты на предусилитель. Продолжайте вносить небольшие корректировки , пока на экране осциллографа (рисунок 6) , пока не появится ответ деполяризующее света.
- Отрегулируйте руку Карданный снова, чтобы найти угол падения, где вспышка света производит самый большой сигнал деполяризующее. Сделайте небольшие корректировки с микроманипулятора и использовать функцию Buzz на усилителе по мере необходимости, чтобы убедиться, что электрод стабильно записи ячейки и что он будет оставаться в клетке в течение всего эксперимента (см Шаг 5.11).
- После того как установка стабильна, начинают RecoВИДЕОЗАПИСЬ. Стабильная запись должна иметь практически никакого изменения потенциала покоя, низкий фоновый шум, и последовательно большой отклик деполяризующее (по крайней мере, 10: 1 соотношение сигнал-шум).
- Запустите программу на компьютере, и начать "новый эксперимент", который откроется всплывающее окно с четырьмя каналами.
- Отрегулируйте шкалу напряжения в верхнем правом углу окна программы до 500 мВ. Первый канал будет отображать ответы, записанные с электрода в режиме реального времени, в то время как второй канал будет записывать меандр, вырабатываемый генератором функции, если сигнал подается на аппаратные средства сбора данных с помощью осциллографа, показывающий, когда затвор открыт , Остальные два канала не нужны.
- Нажмите кнопку "Пуск" в нижнем правом углу, чтобы начать запись, и позволяет программное обеспечение для запуска на протяжении всего эксперимента. Регулировка масштабирования х (времени) и у (напряжения) оси так, что ответы очевидны.
- Во-первых, с белым светом, записывать до 10 отдельных ответов с ND фильтром колеса 3,5 OD (примерно 5-10 сек).
- Следующая запись одинаковое количество откликов на 3,3 OD, затем 3,1, 3,0, 2,5, 2,3, 2,1 и т.д., в каждой комбинации до 0,0 OD. Эти амплитуды отклика к серии фильтров ND обеспечит ответ лог кривой интенсивности в разделе 6. В случае отбеливания, использовать меньшее количество вспышек ярких стимулов в ходе эксперимента.
- Записывают ответ клетки на всех длинах волн, с помощью интерференционных фильтров.
- Сначала найдите пиковую длину волны. Без фильтров ND в пути прохождения света (0,0 OD), поместите УФ-фильтр передающий на пути прохождения света и на короткое время наблюдать амплитуду отклика. Повторите с синим фильтром, передающим зеленого передающего фильтра, и красный передающий фильтр, который должен дать некоторое представление о том, где пик ответ будет.
- Используйте фильтры при температуре около 350, 450, 550, 650 нм, чтобы найти общую область пика чувствительности вшаг 5.14.1. Точная длина волны не имеет значения в этой начальной фазе поиска, поскольку все длины волн будут записаны в следующем шаге. Если оценки существуют пика чувствительности, или они были ранее записаны, использовать известные длины волн быстро определить максимальную чувствительность.
- После максимальной реакции или близко к ней идентифицирован, запись на этой длине волны в течение 10 ответов (около 5 сек).
- После записи на длине волны пика ответа, запись с другими интерференционных фильтров, от 300-700 нм при 10 нм шагов. Начните с вершины и выйти к обоим более коротких и более длинных волн путем замены фильтров из пути прохождения света по одному (например , если пик отклика при длине волны 520 нм, записывать ответы на этой длине волны, а затем 510 нм, а затем 530 нм, 500 нм, 540 нм, 490 нм, 550 нм, и так далее до тех пор, не существует никакого ответа).
- Разрешить до 10 ответов на фильтр (5 секунд каждый). При обменивать интерференционных фильтров, позволяют клетке Респ1-2 вторых вспышки белого света без какого-либо фильтра в пути прохождения света, который является полезным для мониторинга ли пик отклика деградирует с течением времени. Сокращение числа ответов или увеличение OD, если происходит отбеливание.
- Если ответ под любым интерференционным фильтром находится слишком близко к максимальной реакции под белым светом при температуре от 0 OD, а затем затухают с фильтрами ND. Интерференционные фильтры и размер волоконно-оптического кабеля, используемого в этом эксперименте, сильно затухают интенсивность света, и поэтому ND фильтры, как правило, не требуется.
- Если запись остается стабильной, перезаписать длины волн вокруг пика ответа, который служит в качестве pseudoreplicate для подтверждения предыдущих амплитуд отклика и помогает обеспечить реакцию не деградировал в течение долгого времени. После того, как все длины волн регистрируются, перезаписать ответы в рамках серии ND, как на этапе 5,12.
- После завершения записи нажмите "Стоп" на программное обеспечение, и сохранить запись для анализа.
- После того, как эксперимент, принести в жертву индивидуума путем замораживания или охлаждения в течение нескольких минут, а затем быстро оторвав голову и грудную клетку дробления.
- Выключите все оборудование. Перерыв здесь, если это необходимо, прежде чем делать анализ.
6. Спектральный анализ чувствительности
- С помощью программного обеспечения, используемого для записи исходных ответов, вычислить среднюю амплитуду отклика 10 индивидуальных ответов для каждого фильтра в серии ND и для каждого узкополосного фильтра.
- Создание функции отклика лог интенсивности (VlogI) из серии ND фильтра , записанного в шагах 5.12-5.13 (рисунок 7). Сделайте это путем построения блоков журнала интенсивности (OD) на оси X, и ответ на каждой интенсивности на оси у.
- Для получения спектральной чувствительности клетки на разных длинах волн, как правило, соответствуют уравнению Нака-Руштон к данным на шаге 6.2, и использовать это уравнение связать экспериментально полученные спектральные характеристики различных длин волн тO относительные фотоны, необходимые для выявления этой реакции при постоянной длине волны (в данном случае белый свет).
Примечание: Уравнение Нака-Раштон является: V / V макс = I п / (I п + К п), где я есть интенсивность стимула, V амплитуда отклика, V макс максимальная амплитуда отклика, K является стимулом интенсивность дает ½ V макс, а п является экспоненциальный наклон. Различные способы могут быть использованы, чтобы соответствовать этому уравнению к данным VlogI, в том числе подбора кривой программного обеспечения, или на основе кода статистических пакетов. - Для того, чтобы соответствовать уравнению Нака-Раштон , используя простые вычисления и программы работы с электронными таблицами, преобразования данных отклика для каждого VlogI интенсивности стимула: войти [(V макс / V) - 1]. Тогда выполнения линейной регрессии по преобразованных данных, чтобы получить уравнение линии наилучшего соответствия.
Примечание: В макс должно быть больше , чем любые измеренными; сохранить этот последовательный, этот метод оценки V макс 1% GREAter, чем самый высокий взвешенный ответ. - Из уравнения линии регрессии, оценить показатель (п), беря отрицательный наклон, и войти (K) = у-перехватывают / п.
- Для получения спектральной чувствительности клетки на разных длинах волн, как правило, соответствуют уравнению Нака-Руштон к данным на шаге 6.2, и использовать это уравнение связать экспериментально полученные спектральные характеристики различных длин волн тO относительные фотоны, необходимые для выявления этой реакции при постоянной длине волны (в данном случае белый свет).
- После того, как параметры для V макс, п и К были оценены, определения относительного числа фотонов , необходимых для выявления спектральный ответ клетки на каждой длине волны, вставив измеренной спектральной характеристики на данной длине волны , как (V) и решения для I.
- Умножьте рассчитанное интенсивности стимула (I), полученного на стадии 6.3, с помощью поправочного коэффициента для каждого узкополосного фильтра (со стадии 2.4.3) на каждой длине волны.
- Чтобы получить чувствительность, все интенсивности должны быть связаны с V лог-I кривой так, их можно сравнить. Делайте это, связывая каждую длину волны интенсивностью до ½ V макс или K, вычисленная на шаге 6.2.3.
- Вычтите каждую исправленную интенсивность длины волны (шаг 6.4) от K.
- Тогда для каждой длины волны интенсивности, добавьте этот "расстояние от значения К "К, и умножить на (-1).
- Затем довести все точки данных положительные, добавляя абсолютное значение самой низкой точки данных в серии для каждой длины волны.
- Найти чувствительности на каждой длине волны, принимая обратную всех вновь рассчитанных интенсивностей с шага 6.5.1. Преобразовать данные таким образом, что спектр чувствительности падает от 0 до 1.
- После того, как запись с более чем одной ячейки одного и того же типа в среднем окончательные ответы и сюжет со стандартными ошибками или 95% доверительный интервал (Рисунок 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для многих элементов установки записи, письменное описание не дает достаточное количество деталей. На рисунке 1 представлена схема компонентов , участвующих в полной начальной установки записи. На рисунке 2, спектры построены для белого света и каждого узкополосного фильтра , чтобы дать ощущение того , почему необходим коэффициент коррекции и что необходимо для расчета этой поправки. Рисунок 3 показывает фотографии и схему руки карданного , который используется для этих эксперименты. фиг.4 представляет собой составное изображение , показывающий стадии записи и микроманипулятор. на рисунке 5 показаны несколько шагов в подготовке бабочку для эксперимента.
После того, как начинается запись, отрицательное изменение напряжения в ответ на световой вспышки означает , что электрод находится вне клетки, как показано на рисунке 6а. Сила реакции зависит от близости электроданаклонить к фоторецепторов ячейки и угла падения света вспышки. Ответ должен быть большим (> 30 мВ) до того , как наконечник находится достаточно близко к клетке накалывать. Рисунок 6b показывает четкий ответ деполяризующее на световой раздражитель, обозначая вход в клетки фоторецептора. Потенциал покоя должен быть стабильным и амплитуда отклика должно быть большим (по крайней мере 40 мВ), хотя абсолютная амплитуда может значительно изменяться. Мы измерить относительный ответ, так что более важно, что отношение сигнал-шум высок. Если потенциал покоя изменений в значительной степени, что форма сигнала отклика выглядит необычно, или максимальный ответ слишком низкое, то сравнение относительных ответов во всех интерференционных фильтров становится невозможным. Примеры непригодных записей показаны на рисунке 6в, 6г.
После завершения успешной записи, ответы ND должны быть построены и уравнение Нака-Руштон должны быть установлены на данных 33, Shown на рисунке 7. На этом рисунке изображена с помощью фильтра серии ND без каких - либо помех фильтров. Если запись является стабильной, то данные из серии фильтров ND должен быть аналогичен до и после эксперимента. Спектральная чувствительность определяется путем аппроксимации уравнения Нака-Руштон к участку VlogI на рисунке 7, то для решения (I) для каждого ответа (V) при заданной длине волны, как объяснено в расчетах раздела 6 протокола.
Характерным примером спектральной чувствительности происходит от одной записи показана на фигуре 8а (обратите внимание , этот пример показывает реальный расчетные данные, но пик был перенесен в этот результат не был опубликован). Типы клеток могут быть классифицированы по пиковой чувствительности на аналогичной длине волны и общей формы спектра чувствительности. Подобные типы клеток затем усредняются и средняя чувствительность построена со стандартными ошибками на каждой длине волны в FIGU8b повторно. Спектральной чувствительности трех типичных типов клеток , обнаруженных в насекомое показаны на рисунке 8в (амплитуды и ошибок полосы рассчитываются на основе реальных данных, но пики смещаются).
Рисунок 1: Схема. Компонентах записи Компоненты на пути прохождения света, образец установки и записи оборудования указаны. Оптический трек сидит на деревянной скамье вне клетки Фарадея. Xe, ксеноновой дуговой лампы, Cd, конденсатор в сборе, Lx, выпуклая линза, ND, нейтральный фильтр плотности колесо, УТС, интерференционный фильтр, S, затвор, Л.К., вогнутая линза, Co , коллиматорный луч зонда, Fo, волоконно - оптический кабель. Клетка Фарадея сидит надеревянные скамьи вокруг образца. Деревянной скамье сидит выше, но не касается колебательно изолированной мраморный стол под ним. Запись (Rc) и опорный (RF) электроды присоединены к headstage (Hs). Rc вводится в глаз (Е) и Rf вводится в другой части тела. Headstage является частью предусилителя (Па) установки вне клетки Фарадея. Сигнал передается от предварительного усилителя через редуктор шума Humbug (Hb), и в осциллографе (Os). От осциллографа сигнал передается через PowerLab аппаратных средств (PLB) и в портативный компьютер (центральный процессор) , где он считывается программным обеспечением LabChart. Затвор управляется с помощью функции генератора (Fg) , который проходит через второй канал на осциллографе, а также может быть пропущен через второй канал на PowerLab аппаратных средствах , если этот сигнал будет записан , как хорошо.
Рис . 2: Белый свет и фильтр помех Spectra Используется для расчета поправочных коэффициентов Спектры измерены в шаге 2.5 протокола показаны от 300 до 700 нм, для белого света, а также каждого из интерференционных фильтров 41. Каждый спектр интерференционный фильтр измеряется только с этим фильтром на пути прохождения света. Т 520 соответствует площади под спектра для фильтра с пиком 520 нм, и с 520 соответствует интенсивности белого света на длине волны пика фильтра, длине волны 520 нм. Эти значения используются при расчете поправочных коэффициентов для каждого фильтра (в данном случае 520 нм), как описано в пункте 2.6 в протоколе.
Рис . 3: Описание карданных Arm Периметр Используется в экспериментах Кардан рука держит волоконно - оптический кабель и позволяет полностью сферическую вращение и угловую регулировку таким образом , что свет может быть доставлен под правильным углом падения к ячейке записывается. (A) Вид сверху вниз. (B) Вид со стороны под углом. Числа соответствуют той же части во всех панелях. (1) Нижняя пластина обеспечивает полное круговое вращение в горизонтальной плоскости. (2) Вертикальная пластина позволяет полное круговое вращение рычага в вертикальной плоскости. (3) Этот цилиндр имеет металлический рычаг с волоконно-оптического кабеля на конце, и это позволяет вторую вертикальную плоскость кругового вращения перпендикулярна (2). (4) Волоконно-оптический кабель проходит яп место в конце рычага, и свет направлен в сторону расположения образца в экспериментальной установке.
Рис . 4: Компоненты настройки записи (A) Пластиковая трубка используется для удержания образца. (Б) Вид сверху на платформу , на которой установлены образца и трубки. (C) Вид сбоку шарового совместная платформа с магнитным основанием (1). Эталонный электрод хранится неподвижен с клеем и воском на стороне платформы (2). Электрод, обернутые вокруг аллигатора клипа и припаяны на месте, обеспечивая область прикрепления, где опорный headstage электрод может зажим (3). (D) наконечник электрода под 20X увеличением. Шкала бар, 25 мкм. (E) Стадия, держатель электрода, и установка микроманипулятор. Headstage (1) фиксируется над устройством сзаписи серебряный провод (2), а опорный электрод с крокодил (3), который прилагается. Держатель электрода (4) крепится к ручному микроманипулятором (5) с пост ниже, который может быть отрегулирован с помощью ручки для вертикального перемещения, или может быть толкают или тянут для горизонтального перемещения держателя электрода. Магнитная платформа с образцом сидит на сцене (6) чуть ниже держателя электрода. (F) Клетка Фарадея окружает установку записи с экрана , который можно стянуть вверх или вниз в передней части . Алюминиевая фольга помещается под всем оборудованием с резиновыми накладками на вершине. Волоконно-оптический кабель (1) приводит в клетку из оптической дорожки снаружи, и направлен под руку карданным (2) по направлению к стадии (3). Устройство записи и этап Манипулятор помещается в песочнице (4) покоится на мраморном столе под установкой. Все остальное оборудование лежит на деревянной скамье сверху, что не задевает мраморный стол. Песочнице сидит на вершине мраморный стол в отверстиивырезать из деревянного стола, так что образец полностью вибрационно изолирован от оборудования на деревянном столе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5:. Бабочка Prep (А) Бабочка вставляется в трубку и головы, крыльев и усиков обездвижены с горячим воском. Индифферентный электрод вставляется в ротового (1), кусок сухого воска используется для удержания вниз живота (2), и мокрой ткани помещается позади образца. (Б) Крупным планом головы вощеной вниз. Глаза должны быть записаны из (1) хранится ясно из воска или мусора, а также эталонный электрод (2) вставляется в ротового и горячий воск быстро растаял над ним, чтобы держать его на месте.(C) отверстие врезаются в глаза , где розово-белый слой фоторецепторов клеток можно увидеть. Черный пигмент и желтый гемолимфы отсутствуют. (D) Боковой вид образца с записывающим электродом из стекла (1) , помещенный в глаза, и индифферентного электрода (2) , прикрепленный к стадии головы, которая должна завершить схему , как показано на экране осциллографа. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Рис . 6: Сырые Ответы от образца Recordings Каждый ответ соответствует одной световой вспышки от 50 мсек (черные полосы). (А) Пример большого отрицательного изменения напряжения , которые следует рассматривать толькоперед входом в клетку. (Б) Чистый запись должна иметь небольшой фоновый шум и большой отклик деполяризующее, как правило , по меньшей мере 40 мВ. (C) Пример плохой записи из - за отрицательного изменения потенциала после основного пика (стрелки). (D) Другой пример плохой записи. Потенциал покоя претерпевает значительные колебания (красная полоса) и большое количество фоновых шумов может скрыть амплитуду отклика (стрелки).
Рис . 7: Реагирование-Intensity Логлинейный Функция Темными кружками показаны измеренные ответы ячейки от 3,5 до 0 OD, для этой экспериментальной установки. Интенсивность света в логарифмическом масштабе. При очень высокой интенсивности отклик насыщается, и при очень низких интенсивностях небольшой ответ сохраняется вместо отбрасывания к нулю вдоль линии. TУравнение он Нака-Руштон 33 установлен в этой нелинейной формы (пунктирная линия).
Рассчитывалась Примеры спектральной чувствительности (А) ответы одного представителя клетки были записаны и относительная спектральная чувствительность: Рисунок 8.. Пик этой ячейки при 440 нм, то есть он реагирует лучше всего синего света. Данные одноклеточ- может выглядеть шумным (пик при 380 нм). (В) Клетки с той же относительной пика и формы усредняются и стандартные Отрезки ошибок добавлены. Здесь семь синих клеток из семи человек были усреднены убедительное доказательство, что тип клеток у этого вида максимально чувствительных к свету при 440 нм существует. (C) Этот процесс может повторяться для всех типов клеток , найденных, и наносили на график вместе. Насекомых глаза широко различаются по своей спектральной чувствительности но типичных иновЕСТ может иметь пики, показанные здесь, при длине волны 370 нм, 440 нм и 510 нм. Обратите внимание, эти спектральные чувствительности все вычисляются с использованием реальных данных, а пики были сдвинуты, так как данные еще не опубликованы для этого вида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внутриклеточные записи может быть сложной техникой освоить из-за многочисленных технических этапов. Для успешных экспериментов необходимо учитывать несколько важных моментов. Во-первых, важно иметь правильно колебательно-изолированные стол, на котором выполняется эксперимент. Многие исследователи используют воздушные таблицы, которые полностью отделить столешницу от основания, что дает превосходную изоляцию от вибрации. Наша установка включает в себя толстый мраморный стол с песочницей на вершине, в который помещается сценическое устройство микроманипулятор / держателя электрода / образца. Это эффективный и более доступной альтернативой столу воздуха, особенно если доступ к в доме газа или сжатого воздуха является ограничением. Дополнительные меры вибропоглощающие могут быть приняты , такие как пассивной пневматической подвеской, или добавление амортизирующих элементов к столу ног (например, открытый теннисные мячи, велосипедные трубы, густой гель колодки). Кроме того, важно, что экспериментальная установка быть внутриКлетка Фарадея со всем надлежащим образом заземлены. Клетка Фарадея должен иметь экран металлической сетки в передней, которые могут быть удалены при работе внутри клетки и легко заменены при записи. Даже небольшое количество окружающего электрического шума (особенно 50 Гц шум от основного источника питания переменного тока) может сделать иначе хорошей записи непригодными для использования.
При подготовке образца, лимфа и пигментных слоев, окружающих омматидиев может помешать успешной записи. Если отверстие в роговице разрезается слишком большой, нормальная насосная гемолимфы в организме приводит к поверхности жидкости двигаться вверх и вниз на участке резки, что приводит к нестабильной записи. После того, как отверстие вырезается, гемолимфы и поверхностные слои пигмента быстро сворачивается в непроницаемый парши даже при герметичном вазелином, поэтому важно, чтобы получить электрод в глаза как можно скорее. раствор Рингера также может быть использован вместо вазелина. Заземляющий электрод может быть введен вротового или в пень усеченного антенны.
Кроме того, часто бывает полезно держать животное, как адаптируются к темноте, насколько это возможно. Для этого метода шаги включают в себя поддержание записи комнате очень темный, блокируя рассеянный свет от ксеноновой лампы от входа в клетку Фарадея, короткой длительности стимула вспышки (30-50 мс), а также достаточно низкую частоту между вспышками (0,5 или выше). Когда зрительный пигмент поглощает фотон, хромофора в родопсина переключается с 11- цис - 3-hydroxyretinal всем - транс -retinal, вызывая конформационные изменения белка опсина, и активируя весь комплекс как Метарходопсин, который инициирует белок G каскада. Фото-отбеливание происходит при высокой интенсивности света вызывает хромофора физически отделить от белка опсина. Время является ограничивающим фактором в данном эксперименте, так как электрод будет только стабильно записи ответов в пределах соты в течение определенного периода времени, прежде чем она выпадаетили мембрана повреждена. По этой причине мы не ломаются, чтобы позволить клетке восстановиться, но мы используем длительность вспышки и частоту, которую мы нашли не ухудшает реакцию клетки с течением времени. Важно, чтобы уменьшить как частоту и интенсивность света, если происходит фото-отбеливание.
Во время записи большого конца электрода или большое движение с помощью электрода может привести к повреждению клетки при проникновении через мембрану. Только прекрасные советы (по крайней мере ~ 100 МОм) и небольшие движения должны быть использованы при приближении к ячейке для записи. Если внутриклеточный записи применяется к другим приложениям, таким как записи мозга, чрезвычайно тонкие, прочные электроды могут быть выведены с использованием кварцевого стекла, а специализированный съемник должен быть использован для этих электродов. При первом изготовления электрода тяговое программу, мы проверили сопротивление наконечника путем засыпки электрода, закрепив его к держателю электрода в макете установки, и помещая кончик и заземляющий электрод в солевом растворе. Nвнутр мы применили ток для измерения изменения напряжения на осциллографе. Чтобы переместить кончик электрода мы используем ручной микроманипулятора, который перемещается по двум осям. Другие манипуляторы существуют в том числе цифровые, которые позволяют движение по всем трем осям, и они могут быть использованы для этого или более сложных приложений. Есть много способов построить сцену для записи, и существует много различных типов аппаратных средств и программного обеспечения, используемых в записи и анализа наблюдаемых данных. Наша установка представляет собой одну простую, легкую и доступную установку буровой установки записи.
При построении кривой VlogI, функции , разработанная Нака и Раштон 33 и другие 34,35 счета для нелинейных участков наносимых ответов. Различные методы используются , чтобы соответствовать этой кривой к данным, и мы нанесены результаты одного такого способа , который не требует аппроксимирующей кривую программного обеспечения, хотя и другие методы также пригодны 36,37 (
Одним из недостатков этого метода является то, что если исследование организм выражает более одного генетически подобный опсином в глаза, это может быть трудно определить, какие опсина мРНК, вероятно, соответствует которому спектральный класс клетки фоторецептора. Чтобы преодолеть эту проблему, этот метод в сочетании с красильной инъекций и гибридизация или иммуногистохимии , чтобы успешно идентифицировать опсины в выраженной в клетках , записанных 10,
Наш метод прост и доступен для исследователей незнакомых с визуальным электрофизиологии. Эта технология обычна в нейробиологии, но конкретные и четкие методы отсутствуют в литературе, что делает этот метод трудно воспроизвести. Хотя многие вариации этой методики существуют, мы предлагаем простой способ измерения спектральной чувствительности в соединении глаза. Физиологический данных является важной частью доказательств в истории визуальной экологии и эволюции 41. Изменение Opsin последовательность тесно связана с чувствительностью клетки фоторецептора, что делает этот метод идеально подходит для исследований по изучению генетической основы для фенотипического изменения. Измерение фоторецепторных клеток чувствительности также может быть сопряжен с поведенческими цветоразличение анализов, показывая физиологические основы для важных порогов дискриминации в цветового зрения 42-46. В генетических или терапевтических манипуляций в дрозофилы, например, это тechnique может быть хорошим способом для измерения правильной физиологической функции глаза или головного мозга , а также 47,48. Хотя наш не первый или самый сложный метод внутриклеточной регистрации в глаза, наша надежда состоит в том, что мы можем сделать этот метод более легко доступной для воспроизводства и интеграции в научно-исследовательских программ за пределами формальной нейробиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим покойного Rudy Лимбург для изготовления карданной периметра руку, Kimberly Jamison, Мэтью Макгенри, и Раджу Metherate для кредитования нам оборудование, и Альмут Kelber и Кентаро Арикава, для поощрения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Graduate Fellowship к Исследовательского KJM и NSF гранта IOS-1257627 АБР
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss - Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
- Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
- Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
- Knox, B. E., et al.
- Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
- Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
- Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
- Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
- Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
- Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
- Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
- Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
- Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
- Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
- Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
- Yang, E. -C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
- Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
- Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
- Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
- Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
- Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
- Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
- Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
- Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
- Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
- Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
- Hardie, R. C., Raghu, P.
- Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
- Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
- Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
- Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Lipetz, L. E. Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. Loewenstein, W. R. 1, Springer. Berlin Heidelberg. Ch. 6 191-225 (1971).
- Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
- Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
- Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
- Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
- Bernard, G. D.
- Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
- Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
- Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
- Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
- Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
- Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
- Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
- Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
- Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).
