Summary
Hormoonverstorende stoffen (EDC) vormen een aanzienlijk risico voor het aquatisch milieu. Gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallaties zijn belangrijke bijdragen aan de oestrogene potentie van oppervlaktewater. De methodologie in dit document maakt een evaluatie van de doeltreffendheid en de geschiktheid van afvalwaterzuiveringsprocessen opzichte van EDC verwijderd.
Introduction
Bezorgdheid over de negatieve effecten van hormoonontregelende stoffen op de natuur reproductieve gezondheid heeft ertoe geleid dat de Europese Unie tot twee oestrogene stoffen (estradiol en ethinylestradiol) te plaatsen op een "watch list" in het kader van de Kaderrichtlijn Water (KRW). EDC omvatten een verscheidenheid aan chemische klassen, met inbegrip van natuurlijke en synthetische steroïde oestrogenen, drugs, pesticiden en industriële chemische stoffen en bestanddelen van consumentenproducten met bekende negatieve gevolgen voor de flora en fauna. Sommige van deze verbindingen kunnen een impact hebben volksgezondheid 1.
Onderzoek heeft aangetoond dat afvalwater van RWZI zijn oestrogene te vissen 2 en als gevolg daarvan veel ontvangende wateren zijn ook oestrogene te vissen 3. Deze werd voor het eerst aangetoond door middel van nationale onderzoeken in het Verenigd Koninkrijk, dat verhoogde concentraties vitellogenin vertoonde (een vrouwelijke specifieke dooier eiwit voorloper 4) in het bloed van de wilde mannelijke vissen en een hoog prewaardigheid van intersex (het ontwikkelen van eieren en / of vrouwelijke reproductieve kanalen in de testis van de mannelijke vissen) in normaal gonochoristic vissoorten 5,6.
Conventionele rioolwaterzuivering is meestal een drie fasen, bestaande uit een eerste screening, gevolgd door primaire en secundaire behandeling die zowel verwijdert opgeloste en gesuspendeerde organische stof. De werkzaamheid van het verwijderen van individuele EDC afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen van de stoffen en de effectiviteit van het behandelproces toegepast. Voor veel EDC verwijderen via adsorptie en biologische afbraak kan significant, maar onvolledig zijn. Tertiaire behandeling, zoals zandfiltratie, kunnen effectief zijn bij het verhogen EDC verwijdering 7 dat geavanceerde behandeling met geavanceerde oxidatie (zoals ozon) of actieve kool kan efficiënt om vrijwel volledige verwijdering 7 zijn.
De beoordeling van elke nieuwe technologie voor de behandeling van afvalwater needs de doeltreffendheid van de voorgestelde werkwijze EDC verwijderd bepalen. Een batterij van tests, met inbegrip van gerichte chemische analyse naast ecotoxicologie testen, met behulp van in vivo en in vitro bioassays, biedt uitgebreide gegevens voor dit doel. Hoewel zeer nuttig voor onderzoeksdoeleinden, gerichte chemische analyse alleen gegevens over de verbindingen (en specifieke metabolieten) gecontroleerd. Bioassays toestaan dat de "detectie" van ongunstige effecten van metabolieten en behandeling gegenereerde afvalwater transformatie bijproducten die anders onopgemerkt 8,9. Dit document beschrijft het gebruik van een reeks van chemische en ecotoxiciteit laboratoriumbepalingen om de werkzaamheid van een aantal geavanceerde en opkomende afvalwaterzuiveringsprocessen het verwijderen van de oestrogène potentie van ruwe en behandelde afvalwater en waterlopen beoordelen.
Protocol
Ethiek statement: protocollen voor de beoordeling van hormoonontregelende werking van stoffen / mengsels in vis zijn door Brunel University London's Animal Welfare goedgekeurd en ethische toetsingscommissie (AWERB) en door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken in het kader van de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Water Sample Collection, Behoud en Extraction
- Monstername en conservering
- Voor gebruik flesjes te reinigen met een geschikt oppervlakteactief reinigingsmiddel. Na het reinigen, spoel de flessen met water, afvoer en droog.
- Verzamel monsters in glazen flessen van 2-L capaciteit die een conserveermiddel bestaande uit 0,5 g koper (II) nitraat en 6 ml 3,6 M zoutzuur. WINKEL monsters onder 10 ° C. Extraheren en analyseren zo spoedig mogelijk na verzamelen en bewaren.
- Monster extractie en clean-up (voor steroïde oestrogeen analyse) 10
- Vastefase-extractie (SPE)
- Voorafgaand aan de winning, voor zwevende stoffen, filter watermonsters met behulp van 1 micrometer poriegrootte filter papier te verminderen.
- Eenmaal gefilterd, aar monsters met interne standaard door het toevoegen van 100 pi van stekelige gedeutereerde interne standaard voorraad oplossing die 2,4,16,16-d4 -estrone: 2,4,16,16-d4 -17β-estradiol (E2) en 2,4,16,16-d 4 -17α-ethinylestradiol (EE2) (alle bij 40 ug / l in methanol) 1000 ml effluent (of 100 ml influent) resulteert in interne piek van 2 ng / L voor rioolwater effluent monsters, en 20 ng / l voor afvalwater influent monsters.
- Bevestig wegwerp ventiel liners, styreen divinylbenzeen SPE-cartridges, en de patroon reservoirs aan de SPE-apparaat. Schakel de vacuümpomp om de apparatuur te testen adequaat wordt verzegeld.
- Pipetteer 5 ml ethylacetaat in elk reservoir, om de cartridges te conditioneren. Schakel de vacuümpomp (10 inHg tot onder een stroomsnelheid van minder dan 10 ml per minuut mogelijk)en haal deze door de vloeistof. Laat de SPE-cartridges uitdrogen. Herhaal dit met 5 ml methanol, gevolgd door 5 ml water.
- Vul elke patroon reservoir met water en sluit 1/8 "PTFE buizen tussen de patroon en reservoirs glazen monsterflessen. Zet het vacuüm bij een stroomsnelheid van minder dan 10 ml per minuut en laat het gehele monster door de patroon te passen. Leeg de kolf afval als dat nodig is.
- Droog de SPE-cartridges onder vacuüm (of met behulp van lucht of stikstof) totdat de inhoud cartridge van kleur veranderen (bijvoorbeeld van donkerbruin tot lichtbruin).
- Leg schone, droge 10 ml glazen collectie flacons in rack en plaats in de winning spruitstuk. Controleer dat elke liner is boven een flacon. Pipet 8 ml dichloormethaan in elk monster reservoir, schakelaar op de vacuümpomp (debiet van minder dan 10 ml per minuut) en trek de vloeistof door in de collectie flesjes.
- Verwijder 10 ml flesjes van het SPE spruitstuken gebruik een concentrator om het volume te reduceren tot 1 ml. Transfer elk monster in de auto-sampler flacon en verder te concentreren tot 100 ul met behulp van stikstof te blazen naar beneden apparatuur.
- Voorafgaand aan de winning, voor zwevende stoffen, filter watermonsters met behulp van 1 micrometer poriegrootte filter papier te verminderen.
- Gelpermeatiechromatografie (GPC) sanering
- Injecteer 95 pi van het geëlueerde monsterextract in de GPC uitgerust HPLC gebruikmakend van de in Tabel 1 beschreven omstandigheden. Concentreer de GPC-extract tot 200 gl met een concentrator en stikstof blazen neer inrichting en vervolgens tot 2,0 ml met hexaan.
- SPE clean-up
- Bevestig wegwerp ventiel liners, aminopropyl cartridges, en de patroon reservoirs aan de SPE spruitstuk. Leg schone, droge 10 ml glazen collectie flacons in rack en plaats in de winning spruitstuk. Pipetteer 2 ml hexaan in elk reservoir, om de cartridges te conditioneren. Laat de vloeistof door de cartridges te passen.
- Pipetteer de GPC monsterextract in het reservoir en opnieuw laat de vloeistofpasseren de cartridge. Verzamel de monstereluaat in de flacon en te verwijderen uit het spruitstuk. Do eluaat niet weg.
- Zet een nieuwe schone droge 10 ml collectie flacon in rack en plaatsen in de winning spruitstuk. Om de cartridge wassen, voeg 2 ml ethylacetaat in hexaan (v / v 30%) aan het reservoir en trek de vloeistof door de patroon. Herhalen met een verdere 2 ml ethylacetaat in hexaan en gooi alle wassingen.
- Plaats het origineel met 10 ml collectie flacon (stap 1.2.3.2) terug in de rek in de winning spruitstuk. Pipetteer 2 ml ethyl acetaat in aceton (50% v / v) in het reservoir, schakelt de vacuümpomp (tot onder 2 inHg een stroomsnelheid van minder dan 2 ml per minuut mogelijk) en trek de vloeistof door in het flesje . Herhaal het proces met een andere 2 ml ethylacetaat.
- Verwijder het monsterflesje en gebruik een concentrator om het extract volume te verlagen tot 1 ml. Breng het monster in een kleine glazen flesje en gebruik stikstof blaast af apparatuur, verdampen thij uit te pakken naar beginnende droogte.
- Voeg 100 ul methanol en meng. Breng het extract een autosampler flesje (0,3 ml insert) en dop het flesje. Analyseer de monsters met behulp van LCMS / MS (zie hoofdstuk 2).
- Vastefase-extractie (SPE)
| Kolom: | PL gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 urn |
| Guard Column: | PL gel, 50 x 7,5 mm, 5 urn |
| Mobiele fase: | dichloormethaan |
| Doorvoersnelheid: | 1 ml per minuut |
| Column temperatuur: | 25 ° C |
| UV-detector: | 210 nm |
| Injectie volume: | 95 ul |
| Injectie-modus: | Standard |
| Trekken snelheid: | 500 ml per min |
| Eject snelheid: | 500 ml per min |
| Draw positie: | 3 mm |
| Fraction verzameld: | 3 ml fractie (7-10 min) in 10 ml flesjes |
Tabel 1. Voorwaarden en parameters voor gelpermeatiechromatografie (GPC) clean-up van de afgezogen afvalwater monsters. Tabel Gegevens GPC-kolom, mobiele fase, temperatuur, injectie volume, en de golflengte detector.
- Monster extractie (voor Yeast Oestrogeen Screen)
- Filter monsters zoals beschreven in paragraaf 1.2.1.1. Bevestig wegwerp ventiel liners, C18 SPE patronen en cartridge reservoirs aan de SPE-apparaat. Schakel de vacuümpomp om de apparatuur te testen adequaat wordt verzegeld.
- Pipetteer 5 ml methanol in elk reservoir, de C conditioneren18 cartridges. Zet vacuüm (tot ongeveer 5 inHg om een stroom van ongeveer 5 ml per minuut toe te staan) en laat de vloeistof lopen door, pauzeren gedurende 1 min halverwege. Laat de cartridges drooglopen. Herhaal de procedure met ofwel HPLC-kwaliteit of dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O). Wederom niet drooglopen.
- Extract watermonsters zoals beschreven in paragraaf 1.2.1.4. Ga door het vacuüm gedurende ten minste 30 minuten goed drogen van de cartridges.
- Leg schone, droge 10 ml collectie flacons in een rek in de winning spruitstuk. Controleer dat elke liner is boven een flacon. Voeg 5 ml methanol aan elk reservoir. Zet het vacuüm (maximale stroming van 5 ml / min) en de vloeistof door de patroon overgaan in het flesje, pauzeren gedurende 2 min halverwege.
- Voorafgaand aan de analyse met behulp van de JA-scherm, vermindering van het extract om beginnende droog met behulp van stikstof en reconstrueren met 500-1.000 ui ethanol. Sluit de deksels van het monster flacons om verdamping te voorkomen en bij 4 ° C (in een vonk-vrijkoelkast).
2. Chemische analyse met behulp van LCMS / MS
- Optimaliseren van de werkomstandigheden van het LCMS / MS systeem met behulp van instructies van de fabrikant.
- Analyseer kalibratie standaardoplossingen, het monster extracten, blank en analytische kwaliteitscontrole (AQC) monsters met behulp van de vloeistofchromatografie en massaspectrometrie voorwaarden en toezicht op de ion overgangen zoals uiteengezet in tabel 2. Bepaal de concentratie van steroïde oestrogenen in het monsterextract met behulp van interne 10 normen.
| LCMS | |||||
| vloeistofchromatografie | |||||
| Kolom: | C18 (2) 150 x 4,6 mm, 5 urn. | ||||
| Injectie volume: | 20 gl | ||||
| Stroom: | 0,5 ml per minuut. | ||||
| Mobile fase: | Oplosmiddel A: water met 0,1% ammonia. | ||||
| Oplosmiddel B: acetonitril. | |||||
| Gradient programma: | |||||
| Tijd (min) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| A: B verhouding oplosmiddel | 90:10:00 | 50:50:00 | 0.479167 | 0.479167 | 90:10:00 |
| Massaspectrometrie | |||||
| Bron: | Elektrospray (negatieve ionen) | ||||
| Gas en bron: | CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi | ||||
| TEM: 600 ° C, CAD gas 5 en IonSpray voltage -900 | |||||
| MRM overgangen: | |||||
| E1: | 269/145 en 269/143 | ||||
| E2: | 271/145 en 271/143 | ||||
| EE2: | 295/145 en 295/143 | ||||
| E1-D4: | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| EE2-D4: | 299/145 | ||||
Tabel 2. Details parameters en condities van LCMS / MS analyse van steroïde oestrogenen in afvalwater extracten. Tabel geeft monsterinjectie volume en debiet, mobiele fase omstandigheden eennd verloop.
3. oestrogene activiteit met behulp van in vitro Gist Oestrogeen Screen (YES) Assay 8
- Bereiden en opslaan minimaal medium en medium componenten volgens Tabel 3 (a) tot (g).
| (a) minimaal medium (pH 7,1): |
| Bereid een Fe 2 (SO 4) 3 door toevoeging van 40 mg Fe 2 (SO 4) 3 tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) |
| Voeg 1 L DDH 2 O naar een 2 L glazen beker |
| Voeg de volgende onderdelen aan de beker: |
| 13.61 g KH 2 PO 4 |
| 1,98 g (NH 4) 2 SO 4 |
| 4,2 g KOH |
| 0,2 g MgSO 4 |
| 1 ml van de Fe 2 (SO 4) |
| 50 mg L-leucine |
| 50 mg L-histidine |
| 50 mg adenine |
| 20 mg L-arginine-HCl |
| 20 mg L-methionine |
| 30 mg L-tyrosine |
| 30 mg L-isoleucine |
| 30 mg L-lysine-HCl |
| 25 mg L-fenylalanine |
| 100 mg L-glutaminezuur |
| 150 mg L-valine |
| 375 mg L-serine |
| Zet de beker op verwarmde opruier met een magnetische vlooien en roer tot alles is opgelost |
| Controleer of de pH 7,1 en indien nodig bijstellen |
| Met behulp van een 50 ml steriele spuit afzien van 45 ml hoeveelheden in glazen flessen met metalen schroefdop deksels |
| Steriliseer de minimaal medium bij 121 ° C gedurende 10 min in een autoclaaf |
| Bewaren bij kamertemperatuur |
| (b) D - (+) - glucose: |
| Bereid een 20% w / v oplossing in DDH 2 O |
| Doseer 20 ml porties in te glazen flesjes met metalen schroefdop deksels |
| Steriliseer de Glucose oplossing bij 121 ° C gedurende 10 min in een autoclaaf |
| Bewaren bij kamertemperatuur |
| (c) L-Asparaginezuur: |
| Maak een voorraad oplossing van 4 mg / ml in DDH 2 O |
| Doseer 20 ml porties in te glazen flesjes met metalen schroefdop deksels |
| Steriliseer het L-asparaginezuur oplossing bij 121 ° C gedurende 10 min in een autoclaaf |
| Bewaren bij kamertemperatuur |
| (d) Vitamine Oplossing: |
| Bereid een biotine door toevoeging van 2 mg biotine 100 ml DDH 2 O |
| Weeg 8 mg thiamine, 8 mg pyridoxine, 8 mg pantotheenzuur, 40 mg inositol. Voeg alle droge componenten en 20 ml van de biotine-oplossing 180 ml DDH 2 O |
| Maak 10 ml steriel porties door te filteren door middel van een 0,2-um poriegrootte disposable filter in steriele glazen flessen, in een laminaire luchtstroom kabinet |
| Bewaren bij 4 ° C |
| (e) L-Threonine: |
| Bereid 100 ml 24 mg / ml L-threonine in DDH 2 O |
| Doseer 10 ml porties in te glazen flesjes met metalen schroefdop deksels |
| Steriliseer de L-threonine oplossing bij 121 ° C gedurende 10 min in een autoclaaf |
| Bewaren bij kamertemperatuur |
| Bereid 25 ml van een 20 mM Koper (II) sulfaat oplossing in DDH 2 O |
| Voeg 5 ml steriel aliquots door filtreren door een 0,2-um poriegrootte filter in steriele glazen flesjes in een laminaire flowkast |
| Bewaren bij kamertemperatuur |
| (g) chloorfenol rood-β-D-galactopyranoside (CPRG): |
| Bereid 25 ml van een 10 mg / ml oplossing van CPRG in DDH 2 O |
| Voeg 5 ml steriel aliquots door filtreren door een 0,2-um poriegrootte filter in steriele glazen flesjes in een laminaire flowkast |
| Bewaren bij 4 ° C |
Tabel 3. Gist Oestrogeen Screen test; bereiding en de opslag van minimaal medium en middellange componenten.
- Voorbereiding en Storage van 10x geconcentreerde gistcultuur
- Op dag 1, bereid groeimedium (zoals beschreven in 3.4.1) en giet in een steriele erlenmeyer. Voeg 125 ul van 10x geconcentreerde gist cryogeen flesje bewaard bij -20 ° C. Incubeer de geïnoculeerde medium bij 28 ° C gedurende ongeveer 24 uur op een rondschudapparaat.
- Op dag 2, maakt twee flessen groeimedium (~ 50 ml) en giet in afzonderlijke steriele conische kolven. Voeg 1 ml van 24-uur gekweekte gist in elke kolf groeimedium. Incubeer de geïnoculeerde medium bij 28 ° C gedurende ongeveer 24 uur op een rondschudapparaat.
- Op dag 3, pour elke 24-uur oude kweek in een steriele 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer de 50 ml buizen bij 4 ° C gedurende 10 min bij 2000 x g. Giet het supernatant en resuspendeer elke pellet in 5 ml minimaal medium met 15% glycerol. Voeg 0,5 ml aliquots van de 10x geconcentreerde gistcultuur in 1,2 ml steriele cryoflesjes en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal 4 maanden.
- Preparantsoen en opslag van chemische voorraden voor standaard curves
- Spoel alle glaswerk en spatels tweemaal met absolute ethanol en laten drogen voor gebruik om alle sporen van verontreinigingen te verwijderen.
- Weeg E2 rechtstreeks in een glazen flacon in een poeder met een gewicht van kabinet en stel de concentratie in volume in absolute ethanol. Verdunnen tot een concentratie van 2x10 -7 M (54,48 g / l). Seal deksel en bewaar bij 4 ° C (in een vonk-vrij koelkast).
- assay producent
- Op dag 0, bereid groeimedium. Het flesje 45 ml minimaal medium voeg 5 ml glucoseoplossing, 1,25 ml L-asparaginezuur oplossing, 0,5 ml vitamine-oplossing, 0,4 ml L-threonine-oplossing en 125 pl koper (II) sulfaatoplossing. Giet groeimedium in een steriele erlenmeyer.
- Voeg 125 ul van 10x geconcentreerde voorraadoplossing (ontdooien van -20 ° C opslag) aan de kolf en incubeer de geënte medium bij 28 ° C gedurende ongeveer 24 uur op een rondschudapparaat.
- Op dag 1, etiketteren een steriele 96-well 'verdunning plaat' en maak seriële verdunningen (100 pl volumes in ethanol) van E2 standaard curve en test chemische stof (fen) / effluent extract (s) (bijv EE2).
- Label steriele 96-well optisch platte bodem microtiter 'testplaat (s)'. Op elke plaat omvatten blanco (plus / minus oplosmiddel) en E2 een standaardcurve, naast rijen teststof (s) / effluent extract (s).
- Pipetteer 10 ul van elke concentratie (E2, chemische of extract) in de juiste putje van de testplaat. Pipet 10 ul van ethanol in elkaar 'oplosmiddelblanco' putje van de testplaat. Laat assay plaat met het deksel af te verdampen tot droog.
- Voeg een fles groeimedium (~ 50 ml) en voeg 0,5 ml chloorfenol rood-β-D-galactopyranoside (CPRG) oplossing per fles. Bepaal de dichtheid van de gistcellen in de 24-uurs cultuur door het meten van troebelheid van de cultuur bij 620 nm in een plaat reader. Inoculeer de assay medium met 4x10 7 gistcellen uit het 24 uur cultuur.
- Pour geïnoculeerde testmedium in een steriele trog. Een multi-kanaal pipet voeg 200 pl geënt assay medium aan elk putje van de 96-well assay plaat.
- Doe het deksel op de 96-well assay plaat en sluit de randen met tape. Schud de testplaat (s) krachtig gedurende 2 minuten op een shaker titer plaat en incubeer bij 32 ° C in een natuurlijk geventileerde stoof.
- Op dag 2, schud de testplaat (s) krachtig op een titer plaat shaker gedurende 2 minuten. Terug naar 32 ° C incubator.
- Op dag 4, schud de testplaat (s) krachtig gedurende 2 minuten op een titer plaat shaker. Laat de plaat (platen) gedurende ongeveer 1 uur staan dan lezen van de testplaat (s) bij een absorptie van 540 nm (optimaal voor absorptie CPRG ~ 575 nm) en 620 nm (troebelheid) met een plaatlezer. Laat plaat (s) bij kamertemperatuur en later te lezen indien nodig.
- Op dag 0, bereid groeimedium. Het flesje 45 ml minimaal medium voeg 5 ml glucoseoplossing, 1,25 ml L-asparaginezuur oplossing, 0,5 ml vitamine-oplossing, 0,4 ml L-threonine-oplossing en 125 pl koper (II) sulfaatoplossing. Giet groeimedium in een steriele erlenmeyer.
- Oestrogene activiteit berekeningen <ol>
- Juiste test metingen van troebelheid met de volgende vergelijking: Gecorrigeerde = monster of standaard (E2) absorptie bij 540 nm - [monster of standaard (E2) absorptie bij 620 nm - blanco absorptie bij 620 nm]. Plot E2 standaard curve met geschikte blanco's (om te controleren op besmetting) 8.
- Gebruik de gecorrigeerde monster (extract of chemische) op 'Estradiol equivalenten' te berekenen. Gebruik de uitgezet E2 standaard curve waarden en regressievergelijking (3-parameter polynoom of lineair afhankelijk fit) om het monster te interpoleren / extract absorptiewaarden aan E2 equivalente waarden. Gebruik concentratiefactor (dwz water geëxtraheerd en het volume van het extract ethanol wordt geresuspendeerd in) oestrogene activiteit berekenen pre-geëxtraheerde monster.
4. Laboratorium gebaseerde beoordeling van oestrogene activiteit Met behulp van In Vivo vitellogenine Induction in Male Fathead Minnows
- Gebruik mannelijke fathead witvissen (Pimephalespromelas)> 4 maanden oud, die secundaire geslachtskenmerken (weer te geven dat wil zeggen, de ontwikkeling van de huwelijkse knobbels en een dorsale fatpad) een indicatie van de mannelijke seksuele vastberadenheid.
- Om te paaien activiteit te voorkomen, aparte volwassen mannetjes drie weken (± 3 dagen) voor het begin van de test. Plaatst ten minste twee 45 L glas aquaria met een maximale belasting van 3 g / l. Om voldoende aantallen gezonde vis te garanderen voor de test, gebruik maken van een minimum van 100 mannen.
- Houd de mannelijke vissen onder identieke milieuomstandigheden zoals zal worden ervaren in de test (dwz, water temperatuur van 25 ± 1 ° C en een 16: 8 uur licht: donker fotoperiode). Handhaving van de verdunning water debiet aan elke tank een 95% vervanging van ten minste om de 6 tot 8 uur, dat wil zeggen te verzekeren, 330 ml / min voor een 45 liter tank.
- Testapparatuur en experimenteel design
- Met grote glastanks een belasting van maximaal 3 g van deze vis per liter watER. Voor 8 volwassen mannen (nominaal 4,5 g per stuk), gebruik dan een 10-20 L tank.
- Gebruik twee replicaatbakken voor elke behandeling en schild elke tank van onnodige visuele stoornissen (dat wil zeggen, gebruik geplastificeerde kaart schermen tussen de tanks). Identificeer elke tank met een onderzoek in, een concentratie belichting en een identificatie van het vaartuig nummer.
- Afvalwater effluent studies
- Aankomst effluent direct over in een opslagtank bij 10 ± 1 ° C. Begin dosering effluent binnen twee uur na ontvangst van het effluent.
- Voer de afvoerstroom via peristaltische pomp, uit de 10 ° C opslagtank een acclimatisatie vat. Verwarm het effluent in de acclimatisering vat tot 18 ± 2 ° C. Pomp de opgewarmde effluent uit de acclimatisering vat de dosering / mengvaten en vervolgens naar test aquaria (die de vis bevat). Verwarm de aquaria tot een temperatuur van 25 ± 1 ° C.
- Voor chemicaliëndosering studies
- Weeg-test chemische stoffen in een poeder met een gewicht van kabinet. Bereid geconcentreerde chemische voorraden in DDH 2 O bij voorkeur zonder het gebruik van oplosmiddelen.
Opmerking: Als oplosmiddelen moeten testverbindingen oplosbaar Gebruik oplosmiddelcontroles naast het verdunningswater controle. - Zwaartekracht of pomp verwatering water uit een temperatuurgestuurde header tank via flow control-apparaat (s) voor de dosering / mengvat. Pump geconcentreerde chemische voorraad (s) met behulp van een peristaltische pompsysteem aan de dosering / mengvaten. Controle van de pomp snelheid (van de voorraad chemische) en het waterdebiet (verdunning water) om de gewenste concentratie belichting.
Opmerking: Gebruik silicone slang aan water / test chemische voeren aan elk testvat van de dosering / mengvat. Gebruik een stroomsnelheid die voldoende is om een vaartuig vervanging 75% op ten minste 24 uur, dat wil zeggen, 20 ml / min bij 20 L tank. Handhaaf de stroomsnelheid van ± 10% van de aangegeven nominale waarde.
- Weeg-test chemische stoffen in een poeder met een gewicht van kabinet. Bereid geconcentreerde chemische voorraden in DDH 2 O bij voorkeur zonder het gebruik van oplosmiddelen.
- Voeden de vis twee keer per dag met vers ontdooide bevroren volwassen artemia (Artemia) bij 2,5 (± 0,1) g per tank per feed. Ook de vissen voeren een keer per dag met een kleine hoeveelheid (twee vingerknelbeveiliging) van een tropische vissen vlok voedsel. Laat een minimum van 3 uur tussen elke feed.
- Houd een dagelijkse voeding record naar de voedingsreactie / gedrag (goed, matig en slecht, in vergelijking met de controles) volgen. Sifon de tanks minstens twee keer per week (bij voorkeur dagelijks) om eventuele niet opgegeten voedsel en uitwerpselen te verwijderen. Maak de zijkanten en bodems van de test schepen ten minste één keer per week.
- Neem wekelijks watermonsters van elke tank tot oestrogene activiteit (via Gist scherm) en chemische samenstelling (via analytische chemie) bevestigen. Zie paragrafen 1-3 voor meer informatie over water bemonstering, extractie en analyse.
Opmerking: Voor elk experiment gebruikt verdunningswater controle (negatieve controle), positieve controle (E2 of EE2) plus ten minste drie verdunningen van effluent (100, 50 en 25%) of teststof te dosisrespons controleren. Als nieuwe technologieën worden getest, gebruik verbinding / effluent met of zonder behandeling (bv EE2 zonder behandeling, EE2 met TAML / waterstofperoxide (H 2 O 2) behandeling 12 Figuur 1).
- Met grote glastanks een belasting van maximaal 3 g van deze vis per liter watER. Voor 8 volwassen mannen (nominaal 4,5 g per stuk), gebruik dan een 10-20 L tank.
Figuur 1. Diagram vertegenwoordigen experimenteel ontwerp van een in vivo dikkopjes vitellogenin biologische test om de verwijdering van de ecotoxiciteit van 17α-ethinylestradiol behulp TAML / peroxide water behandeling te bepalen. De experimental set up bestaat uit acht 11 L glas aquaria elk gevoed met een continue stroom van water. Individuele chemische voorraad oplossingen en water (gefilterd de-gechloreerde) worden geleverd aan de mengkamers. Nominale concentraties (zonder reactie) in het mengvat zijn 2 ng / L EE2, 80 nM TAML en 0,16 ug / LH 2 O 2. Chemische voorraadoplossingen (EE2, H 2 O 2 en TAML) bereid en afzonderlijk gedoseerd zodat de reacties begonnen in de mengvaten. Fish (8 mannelijke fathead witvissen per tank) worden blootgesteld aan het mengsel (s) na een reactietijd contacttijd van ongeveer 45 minuten. watermonsters genomen van blootstelling tanks week. Plasmamonsters genomen van fathead minnows de oestrogene biomarker vitellogenine (VTG) vanaf een basislijn groep meten bij aanvang van de studie, en alle andere vis na 21 dagen blootstelling. De specifieke behandelingen zijn: 'C'; negatieve controle (verdunning alleen water), '+'; positieve controle van EE2,'H +'; EE2 plus H 2 O 2, '+ T'; EE2 plus H 2 O 2 plus TAML. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Mills et al. 2015 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Test procedure
- acclimatiseringsperiode
- Meet natte gewicht (g) van elke geslachtsrijpe mannelijke vissen, en wijzen op willekeurig elke tank (8 mannen per tank).
- Houd niet-toegewezen vis uit dezelfde partij en te onderhouden onder dezelfde testomstandigheden. Gebruik deze vissen om eventuele personen die tekenen van fysieke schade of een gebrek aan conditie tijdens de 7-daagse acclimatiseringsperiode tonen vervangen. Waarborgen aan het einde van de acclimatiseringsperiode elke behandeling tank 8 mannetjes die volledig zijn gewend aan de testomstandigheden.
- Neem 'basislijn' plasma monsters van een extra 8 mannen uit dezelfde batch van mannelijke vissen. Volg de bloedafname methode in paragraaf 4.4 en de vitellogenine analyse (VTG) methode 4.5.
- Na de acclimatisatie periode, leveren effluent of chemische dosering voorraden om de belichting tanks gedurende 21 dagen, zoals beschreven in 4.2.2 of 4.2.3. Monitor mortaliteit, gedrag en uiterlijk van de vissen in elke tank repliceren dag vóór de eerste toevoer van de dag. Neem een abnormale gedrag of incidenten.
Opmerking: Zorg ervoor dat milieu-omstandigheden en het voeden van de tarieven te handhaven van de gezondheid van de vissen (paragrafen 4.2.4 en 4.2.5).
- acclimatiseringsperiode
- Fish Sampling na 21 dagen blootstelling periode
- 12 uur vóór de bemonstering, stoppen met het voeden van de vis.
- Label micro-centrifuge buizen voor de inzameling van bloedmonsters, voeg ~ 5 ul van aprotinine (een proteaseremmer) en leg ze op ijs.
- Wordt 500 mg / l oplossing van MS222 (verdoving) door het oplossen van 500 mg MS222 per 1 L van de gechloreerde water (voorheen gewendtot 25 ± 1 ° C). MS222 neutraliseren tot pH 7,4 ± 0,4 onder toepassing van 1 M NaOH.
- Beweeg elke vis uit de tank in de gebufferde MS222. Houd in de oplossing tot de stopzetting van alle kieuwdeksel beweging (meestal 5 ± 1 min).
- Meet en de lengte vork (mm) onder de terminal verdoving op te nemen. Gebruik een wegwerpbistouri de staart geamputeerd en gebruik een hemocrit gehepariniseerde buis om het bloed te verzamelen van de caudale arterie (figuur 2). afzien voorzichtig het bloed in de pre-gemerkte microcentrifugebuis en blijf op ijs.
- Dood de vis onmiddellijk na het tekenen van het bloed. Bevestig de dood door de definitieve beëindiging van het verkeer en / of de vernietiging van de hersenen. Meet en noteer de totale vis gewicht (tot 0,01 g), en ontleden weefsels zoals vereist.
- Centrifugeer de bloed (7000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C) binnen 2 uur verzameld. Breng het plasma supernatant met een pipet in nieuwe label 0,4 ml microcentrifuge tubes en op te slaan op het ijs. Bevries de buisjes met plasma op droog ijs binnen 30 min centrifugatie en opslag bij -80 ° C voorafgaand aan de analyse van plasma concentraties VTG.
Figuur 2. Foto's beeltenis van mannelijke dikkopjes (Pimephales promelas), plasma en de locatie van de testis. Aan het einde van de blootstelling van 21 dagen alle vis worden gedood om bloedmonsters te verzamelen. Eenmaal in het kader van deze terminal verdoving vis lengte (vorklengte, mm) moet worden gemeten, al snel gevolgd door bloedafname uit de caudale slagader Photo-A:. Rode stippellijn geeft de locatie voor de staart amputatie (een wegwerpbistouri moet worden gebruikt om de staart te amputeren ). Foto-B toont een gehepariniseerde hemocrit buis gebruikt om het bloed te verzamelen. Elke vis dient vervolgens onmiddellijk gedood nadat het bloedmonster is genomen, in dit geval de hele kopis gescheiden van het lichaam (foto-C). Zodra de vis gedood de lichaamsholte kan worden geopend om de inwendige organen te onthullen. Foto-C toont de locatie van de testis (gonaden) met betrekking tot de zwemblaas (SB) in karperachtigen, bijvoorbeeld, dikkopjes, voorn, karper, enz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Meet VTG plasma concentraties van homologe VTG enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit specifiek voor fathead minnows.
- Bereid VTG standaarden en buffers zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Verdun plasmamonster 1:50, 1: 5000 en 1: 500.000 en testen ze in tweevoud waarden binnen de VTG standaardcurve bereik volgens instructies van de fabrikant verkregen. Volg de richtlijnen van de fabrikant om vitellogenine concentraties te berekenen.
5. Het gebied Evaluaties van de Advanced / Novel Afvalwaterbehandeling Technologies te verzachten oestrogene activiteit Met behulp van In Vivo vitellogenin en Intersex inductie in Roach (Rutilus rutilus)
- Vangst van wilde voorn leeft beneden stroom van afvalwaterzuiveringsinstallatie lozingen
Opmerking: Gebruik voorn (Rutilus rutilus) of andere overvloedige zoetwater of brak vissoorten, die gonochoristic en bekende gevoelig zijn voor oestrogene hormoonontregeling te zijn.- Vangst vissen met behulp van Elektrovisserij, netten, het opsluiten of andere erkende vismethoden afhankelijk van de situatie 13. Vervoeren de vis in beluchte tanks terug naar het laboratorium voor de bemonstering.
- Bereid microcentrifugebuizen zoals beschreven in 4.4.2. Bereid gebufferd MS222 zoals beschreven in 4.4.3. Verdoven vis zoals beschreven in 4.4.4.
- Meet vis lengte en het gewicht onder terminal verdoving.
- Verzamel bloed uit de caudale slagader met behulp van disposable gehepariniseerde spuit. Dood elke vis onmiddellijk na het bloedmonster collectie. afzien voorzichtig het bloed in pre-gelabelde microcentrifugebuizen en blijf op ijs. Bereid plasma zoals beschreven in stap 4.4.7 en meet VTG door ELISA (4.5).
- Met behulp van een tang verwijderen 2-3 vis schubben van elke vis en leg in individueel gelabelde kleine papieren enveloppen. Bewaar enveloppen bij kamertemperatuur in droge omstandigheden voor later vis leeftijd vast te stellen en de groei analyse.
- Open lichaamsholte met een scalpel om de interne organen te onthullen. Neem uit de darm naar de zwemblaas met een gonade zich aan beide zijden (figuur 2) te onthullen. Verwijder voorzichtig de gepaarde geslachtsklieren met fijne neus pincet en plaats in een glazen flacon. Bedek de geslachtsklieren met Bouin's fixatief in een verhouding van 1:10 weefsel: fixeermiddel.
- Laat het weefsel in Bouin's 6-24 uur, afhankelijk van de grootte van het weefsel (fixeermiddel penetreert bij 1 mm per uur). Eenmaal vast, giet de Bouin's fixeermiddel eend te vervangen door 70% industriële spiritus (IMS). Bewaar de vaste weefsel bij kamertemperatuur tot weefsels worden verwerkt voor histopathologisch onderzoek (paragraaf 5.3).
- Gebied gebaseerde beoordeling van oestrogene activiteit met in vivo vitellogenine en intersex inductie in voorn
- Experimenteel ontwerp en het opzetten van
Opmerking: Stel de tanks en proeffabriek ruim van tevoren van de in vivo werkzaamheden starten. Start de tanks stroomt 3-4 weken voorafgaand aan de toevoeging van vis aan het systeem. Monitor water debieten, de kwaliteit en de omstandigheden (pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, etc.) regelmatig om ervoor te zorgen parameters maken water kan worden gehandhaafd.- Construct grote tanks (bijvoorbeeld 300-1000 L) op het terrein van de pilot plant, die 'control' kan ontvangen de-gechloreerd water uit de kraan, standaard behandeld effluent (s) en geavanceerde behandelde afvalwater (s) in parallel. Hechten luchtpomp / beluchters om de tanks. Set water debieten tot ten minste 6 tank v bereikenolume uitwisselingen per dag.
Opmerking: Zorg ervoor dat tanks zijn goed geïsoleerd en schaduwrijke te hoge dagtemperatuur schommelingen te voorkomen. Ontwerp tanks aan de waarneming van de vis, voor gedragsveranderingen (gebrek aan voeding, enz.), Tekenen van de ziekte en sterfte toe te staan.
- Construct grote tanks (bijvoorbeeld 300-1000 L) op het terrein van de pilot plant, die 'control' kan ontvangen de-gechloreerd water uit de kraan, standaard behandeld effluent (s) en geavanceerde behandelde afvalwater (s) in parallel. Hechten luchtpomp / beluchters om de tanks. Set water debieten tot ten minste 6 tank v bereikenolume uitwisselingen per dag.
- Start de belichting door de drijvende zakken voorn (van de viskwekerij) in de respectieve tanks 1 uur. Voeg tank water om de zakken geleidelijk tot temperatuur van het water en de voorwaarden zijn ambient. Laat de vis in hun tanks.
- Voeden volwassen voorn dagelijks op gepelleteerd visvoer (grootte 0,5-0,8). Feed juveniele voorn dagelijks op kleine gepelleteerd (pellet maten 100-300) niet-oestrogene voeding 14 ad libitum, aangepast op basis van niet opgegeten feed. Houd een dagelijkse voeding opnemen documenteren voeding response / gedrag (goed, matig of slecht, in vergelijking met de controles).
- Neem wekelijks watermonsters uit elke tank naar oestrogene activiteit en chemische samenstelling te bevestigen. See secties 1-3 voor meer informatie over water monsterneming en analyse methoden.
- Experimenteel ontwerp en het opzetten van
- Histopathologie van vis geslachtsklieren 15
- Verwijder voorzichtig de ontleed en vaste geslachtsklieren uit de container met een pincet en leg ze op een snijplank (in stappen 5.1.6 en 5.1.7 beschreven).
- Gebruik een microtoom mes aan elk gonaden gesneden in 3 delen (anterior, mid en posterior) en vanaf elk deel snijd een 3-5 mm doorsnede. Plaats voorzichtig alle zes stukjes in een gemerkt plastic biopsie cassette, en plaats in weefselprocessor gebruikmaking van de in Tabel 4 opgesomde tijdstippen.
- Wax insluiten weefsels en sectie over rotatiemicrotoom (3-5 pm). Transfer secties gemerkte bioadhesieve beklede objectglaasjes en plaats glijdt op een verwarmde plaat (ingesteld op 45 ° C) drogen 24 uur.
- Vlekken op de dia, handmatig of via een geautomatiseerd stainer, met de timings in Tabel 5. Breng een druppel montagemiddel van het behandelde weefsel en lay een glazen dekglaasje over de montage agent om het weefsel te beschermen.
- Eerst, onderzoekt elk glaasje bij lage vergroting (20X, dwz 2X objectief met 10x vergroting ooglijnen) geslacht te bepalen en het aantal punten van gehechtheid aan de lichaamsholte 15. Let op eventuele afwijkingen voor elke vis.
- Bij een hogere vergroting (100X of 400X), onderzoekt het weefsel gametogenese fasen afwijkingen en de aanwezigheid van eicellen in testiculaire weefsel te beoordelen. Noteer de ernst van intersex met het volgende beoordelingssysteem variërend van 0 (normaal mannelijk weefsel) tot 7 (100% eierstokweefsel) 6 (zie Tabel 6).
stap Number Behandeling Doel Time (hr) 1 70% IMS uitdroging 3 2 90% IMS uitdroging 2.5 3 95% IMS uitdroging 1.5 4 100% IMS uitdroging 1.5 5 100% IMS uitdroging 1.5 6 100% IMS uitdroging 1.5 7 100% IMS uitdroging 1.5 8 Histologie clearing-agent opheldering 1.5 9 Histologie clearing-agent opheldering 1.5 10 Histologie clearing-agent opheldering 1.5 11 WAS wax infiltratie 1.25 12 WAS wax infiltratie 1.25 20 uur TOTAL Tabel 4. regime Processing voor wax impregneren van weefsels voor histopathologie. Weefsels moeten worden verwerkt in een automatische weefsel processor. Weefsels moeten worden ondergedompeld in de oplossingen uitgewerkt voor de periode van de tijd die is opgegeven.
Vlek niet. Vlek Doel Tijd (min) 1 Histologie Clearing-agent lost wax 15 2 hydratatie 2 3 90% IMS hydratatie 2 4 70% IMS hydratatie 2 5 TAP WATER (RUNNING) Spoelen 2 6 HAEMOTOXYLIN Vlekken celkernen blauw 10 7 TAP WATER (RUNNING) Verwijder overtollig 10 8 aangezuurd IMS dechlorering 20 sec 9 TAP WATER (RUNNING) Spoelen 20 sec 10 Lico 3 Zout 20 sec 11 TAP WATER (RUNNING) Spoelen 20 sec 12 1% Eosine (WATERIGE) Vlekken cytoplasma roze 20 sec 13 TAP WATER (RUNNING) Verwijder overtollig 5 14 70% IMS uitdroging 2 15 90% IMS uitdroging 2 16 100% IMS uitdroging 5 17 Histologie Clearing-agent Verwijder IMS, bindmiddel 5 Tabel 5. Solutions en onderdompeling tijden voor Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring van vis gonadale weefsels. Slides moet in elk bad voor de Alloc worden geplaatstated tijd in de juiste volgorde. H & E kleuring van weefsel is nodig om ontwikkelings- of organisatorische gevolgen van oestrogene afvalwater afvalwater op vissen geslachtsklieren te bepalen.
partituur sectie Beschrijving 0 Normale mannelijke testis 1 Multifocale ovotestis met 1-5 eicellen (meestal afzonderlijk) verspreid onder de testikelweefsel 2 Multifocale ovotestis, 6-20 eicellen vaak in kleine clusters verspreid over de testikelweefsel 3 Multifocale ovotestis, 21-50 eicellen in clusters 4 > 50 en <100 eicellen. Sectie gewoonlijk multifocale heeft het uiterlijk van een mozaïek testicular en eierstokweefsel. 5 > 100 eicellen, meestal multifocale maar kan ook centraal met duidelijk herkenbare zones van ovariële en testiculaire weefsel gescheiden van de testis weefsel. 6 > 50 procent van de gonadale weefsel aan de sectie eierstokken en wordt duidelijk gescheiden van de testiculaire weefsel door epitheliale cellen en fagocytische weefsels. 7 100 procent van gonadale weefsel aan de sectie eierstokken. Tabel 6. Scoring systeem om de ernst van de intersex aandoening bij voorn beoordelen. Histologisch bereid dia's van gonadale weefsel moet onder lichte microscoop worden onderzocht op 20X, 100X en 400X vergroting, om eventuele afwijkingen en de aanwezigheid van eicellen in zaadbalweefsel beoordelen. Deze tabel is gewijzigd ten opzichte van Jobling <em> et al. 2006 6.
Representative Results
Pogingen om het effect van verbetering van afvalwaterzuiveringsprocessen begrijpen of de meest geschikte technologie apparatuur tertiaire zuivering achteraf in bestaande RWZI met betrekking tot de effectiviteit van de verwijdering van hormoonontregeling geloosde afvalwater bepalen niet alleen de meting van de belangrijkste chemische componenten die de werken in te voeren, maar vereist de analyse van de afbraakproducten die ook kan hebben hormoonontregeling. In huishoudelijk afvalwater afvalwater, de meest oestrogene stoffen aanwezig zijn de steroïde hormonen, oestron (E1), 17β-estradiol (E2) en 17α-ethinylestradiol (EE2) 5,8. Steroïde oestrogenen voornamelijk uitgescheiden uit het lichaam als een mengsel van inactieve conjugaten 16,17. Deze geconjugeerde oestrogenen in hoofdzaak gedeconjugeerd in de riolering door bacteriële activiteit en verdere degradatie optreedt in de RWZI. De gedeconjugeerd steroïden are uit de afvalwaterstroom verwijderd door adsorptie aan slib of biologisch afgebroken tijdens secundaire behandeling resulteert in de vorming enerzijds transformatie bijproducten en uiteindelijk volledige mineralisatie optreden van de eerste werkzame component. De chemische analyse van afzonderlijke verbindingen in de effluentstroom moeilijk, tijdrovend en kostbaar en toets geen onbekende werkzame bestanddelen in een monster. Bovendien zal een som van de oestrogène bijdrage van elke component alleen een indicatie van de cumulatieve oestrogene potentie van een monster van de verbindingen onderzocht. Dit is een risico vormt omzettingsprocessen genereren onbekend oestrogene stoffen of wanneer het influent is van industriële oorsprong. Combineren chemische analyse van in vivo en in vitro bioassays ecotoxicologische een oplossing biedt voor de aanwezigheid van onbekende oestrogène componenten in mengsels zoals behandeld afvalwater. In vitro testen zoals de gist Oestrogeen ScrEen (JA) zijn uitgebreid gebruikt voor de oestrogène activiteit van rioolwater bepalen en helpen de actieve componenten in behandelde monsters 8,18,19. Echter, vergelijkingen tussen in vivo en in vitro testen significant 11 zijn en een uitgebreide beoordeling van nieuwe processen met betrekking tot de behandeling van endocrien verstorende kracht vereist een reeks van chemische en ecotoxicologische proeven.
Een bepaling of individuele zuiveringsinstallaties of processen te verwijderen actieve verbindingen uit de afvalwaterstroom kan worden bereikt met behulp van chemische analyse welk monster extractie, concentratie en sanering van het extract vóór de analyse volgt, meestal uitgevoerd met behulp van LCMS (/ MS) of GCMS (/ MS) methoden. De resultaten van chemische analyse gegevens kunnen worden gebruikt om de naleving te bepalen met individuele voorspelde concentraties zonder effect (PNEC) 20 of kwaliteitsnorm milieus (MKN) 21 van specifieke individuele verbindingen en daarom zulke methoden zijn van vitaal belang voor de naleving van de regelgeving gegevens. Bovendien gerichte of niet-gerichte chemische analysemethoden kunnen worden vastgesteld en kwantificering van afzonderlijke verbindingen of isomeren opzichte van biologische methoden, die een totale respons. Chemische analyse methoden kan daarom de beoordeling van afzonderlijke verbindingen worden gemaakt om te voldoen en deze afvalwaterzuivering uitdagingen op individuele basis zuiveringsinstallatie pakken. Studies hebben aangetoond dat conventionele afvalwaterbehandeling (bijvoorbeeld actief slib planten) zeer effectief in het verwijderen van steroïde hormonen hoewel verwijdering van het synthetische hormoon EE2 neiging minder doeltreffend te zijn. Field studies met geavanceerde behandeling gebruikmaking technieken zoals ozon, gegranuleerde actieve kool (GAC) en membranen hebben aangetoond, zij het tegen hoge kosten, dat zij als een end-of-pipe oplossing kan worden gebruikt om EE2 verwijderen onder Predicted effect niveaus en tot onder de detectielimieten. Figuur 3 toont de verwijdering van EE2 gebruik van GAC in een pilot-schaal gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallatie. Studies uitgevoerd op pilot-schaal gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallaties met behulp van end of pipe GAC behandeling tonen ook aan de vermindering van de oestrogene potentie volgende GAC gemeten met behulp van de Gist Oestrogeen Screen (YES) zoals te zien in figuur 4.
Figuur 3. Voorbeeld veldgegevens die de verwijdering van ethinylestradiol volgende geavanceerde tertiaire behandeling. (A) worden monsters verzameld uit de RWZI volgens conventionele (actiefslibinstallatie) behandeling volgens de methode beschreven voor het monster behoud procedures. (B) De monsters worden geëxtraheerd met behulp van vaste fase extractie, schoongemaakt-up om storende stoffen te verwijderen met behulp van normale fase SPE engelpermeatiechromatografie. (C) De schone geconcentreerde extract wordt geconcentreerd tot een klein volume en geanalyseerd met negatieve ion elektrospray LCMS / MS in de MRM modus. De resultaten worden berekend op basis van interne standaard met behulp van een isotoop gemerkte interne standaarden. In het getoonde voorbeeld EE2 is in de uiteindelijke ASP effluent een concentratie boven de voorspelde zonder effect (PNEC) van 0,1 ng / L en wordt verwijderd met GAC en ozon (O 3) naar milieuvriendelijke concentratie. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Foto van een gist oestrogeen Screen (YES) testplaat (A) toont kleurverandering van geel naar rood, betreffende oestrogene activiteit van de monsters. Plots gemaakt op basis van de YES assay plaat showing gecorrigeerde absorptie (540nm) van oestradiol standaard (B), actiefslibproces effluent (ASP) en actieve kool (GAC) behandeld afvalwater effluent samples (C). Elk monster werd in duplo getest. ASP en GAC afvalwater werden geëxtraheerd en geconcentreerd met behulp van de SPE methoden vermeld in rubriek 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ozonation is ook efficiënt in het verwijderen van steroïde oestrogenen en oestrogene activiteit van conventioneel behandelde rioolwaterzuiveringsinstallaties. Ozon is in staat om een breed scala van organische verontreinigingen en opgeloste organische stof te oxideren in het afvalwater monsters en biedt desinfectie eigenschappen. De effectiviteit van ozonisatie afhankelijk water kenmerken zoals pH, hoeveelheid organisch materiaal en de toegepaste dosis ozon. Oestrogenen die slecht worden verwijderd door conventionele behandeling kan wordenverwijderd uit afvalwater met doses tussen 0,8 en 2 mg O 3 / mg DOC. Ozon is een selectief oxidatiemiddel, dat reageert met elektronenrijke sites (onverzadigde koolstof-koolstof bindingen, aromatische verbindingen zoals aromatische alcoholen), die ozon toepassing voor de afbraak van een aantal EDC maakt. Echter, de verwijdering van afzonderlijke verbindingen niet noodzakelijk tot het volledige mineralisatie van de oorspronkelijke verbinding. Organische stoffen na ozonisatie worden omgezet genereren tussenproducten of transformatie oxidatie bijproducten die een aantal laag molecuulgewicht omvatten polaire groepen verbindingen zoals aldehyden, ketonen, carbonzuren, ketozuren en gebromeerde verbindingen. Voorbeelden omvatten, bromaat, formaldehyde, acetaldehyde en carbonzuren. Gebruik in vivo en in vitro bioassays is aangetoond dat hoewel ozon slechts gedeeltelijk sommige chemische stoffen oxideert, de resulterende belangrijke omzettingsproducten een lagere estrogENIC vermogen en dus de toepassing van ozon op een geschikte dosis resulteert in een hoog verwijderingsrendement van de oestrogene activiteit.
Een van de grote voordelen van aanvullende behandeling van afvalwater is de vermindering van de feminisering van mannelijke vissen in ontvangende wateren; een nadelig effect dat kan leiden tot verminderde vruchtbaarheid 3. In vivo studies met vis (bijvoorbeeld voorn of dikkopjes) blootgesteld aan afvalwater toon vrouwelijke kiemcellen of eicellen in de testis van mannelijke vissen (bijvoorbeeld zoals in Figuur 5). Intersex of mannelijke VTG is afwezig of aanzienlijk verminderd in vis volgende geavanceerde behandeling, zoals GAC 7 of ozon 22. Deze studies tonen aan dat omzettingsproducten die tijdens ozonisatie geen oestrogene, maar dit niet de toxiciteit van het effluent geproduceerd pakken. Deze kwestie is behandeld in andere onderzoeken, bijvoorbeeld een studie van Magdeburg et al. 12,24 - 26. TAML activatoren met H 2 O 2 effectief degraderen EE2 en andere steroïde oestrogenen in zuiver water laboratorium evenals in afvalwater van gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallaties en in spiked urinemonsters 12. Laboratoriumonderzoek, toont TAML / H 2 O 2 behandeling zorgt voor een hoge steroïde oestrogeen verwijdering waaronder EE2 verwijdering en vermindert aanzienlijk oestrogene activiteit gemeten in vitro met behulp van de JA bioassay en substantially vermindert vis feminisatie in vivo gemeten met de VTG bioassay (Figuur 1 en Figuur 6). 
Figuur 5. Microfoto van een normale mannelijke (A) en interseks (B, C) gonaden van volwassen voorn (Rutilus rutilus) blootgesteld aan afvalwater in een veld gebaseerde beoordeling. Microfoto-A, toont een histologische sectie van normale mannelijke testis. Photomicrograph-B en -C, toont histologische secties van een intersex mannelijke vissen, die is blootgesteld aan actief slib proces afvalwater effluent voor zes maanden. Pijlen geven eicellen in de testis tissue. Schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer op elke microfoto. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 6. Gemiddelde EE2 concentratie en oestrogene werkzaamheid in behandelde en onbehandelde water tank (A) en plasma vitellogenine basislijn en blootgesteld mannetjesvissen (B). A) EE2 concentratie (ng / L, donkerblauw staven) werd gemeten door LCMS / MS , oestrogene activiteit (EE2 gelijkwaardige ng / L, donker groene balken) werd gemeten via een in vitro Gist Oestrogeen Screen (YES). B) Plasma vitellogenin (ng / ml, licht blauwe balken) -concentratie in mannelijke fathead witvissen werden gemeten door middel van een kwantitatieve enzym -gebonden immunosorbent assay (ELISA). EE2 chemische analyse resultaten gerapporteerd als <0,03 ng / L EE2 (dat wil zeggen, lager dan de detectiegrens (LOD)) werden behandeld als zijnde de helft LOD (dat wil zeggen, 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2, en EE2-only. Error bars in grafiek-A vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde, foutbalken in grafiek-B vertegenwoordigen standaarddeviatie. Letters boven bars in grafiek-B vertegenwoordigen statistische overeenkomst. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Mills et al. 12 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Rioolwaterzuiveringsinstallaties zijn de belangrijkste route van het oppervlaktewater verontreiniging met EDC. Een evaluatie van de doeltreffendheid van de verwijdering van hormonale activiteit van conventionele, geavanceerde of nieuwe behandeling vereist het gebruik van een verscheidenheid van chemische en biologische bepalingen. Chemische analyse met behulp van niet-gerichte en gerichte analyse geeft kwalitatieve of kwantitatieve gegevens over de werkzaamheid van de verwijdering van de afzonderlijke componenten en maakt het dus mogelijk een evaluatie worden gemaakt tegen de kwaliteitsnormen voor het milieu of de voorspelde concentraties zonder effect voor de verbindingen of mengsels van verbindingen geanalyseerd.
Het genereren van omzettingsproducten ontstaan door onvolledige mineralisatie van stoffen na behandeling en de aanwezigheid van ongekende biologisch actieve componenten in afvalwater beperkt de bruikbaarheid van alleen chemische testen. Een combinatie van in vivo en in vitro bioassays in combinatie met analytische chemicusry screening een bruikbare toolbox om de doeltreffendheid van EDC verwijdering bepalen opkomende afvalwaterzuiveringsprocessen. Deze tests, wanneer uitgevoerd naast de traditionele parameters voor de waterkwaliteit en andere toxicologische en microbiologische end-points maken een kritische evaluatie van bestaande en opkomende technologieën voor afvalwaterzuivering.
Het is belangrijk op te merken dat gist gebaseerde oestrogeen schermen (bijv YES) niet alleen in vitro assays oestrogene potentie van chemicaliën en afvalwater bepalen. Een aantal stabiel getransfecteerde zoogdiercellen gebaseerde testen zijn ook ontwikkeld, respectievelijk bijvoorbeeld de ER-CALUX 27 en hERa-HeLa-9903 28 met humane borstkankercellen of cervicale tumorcellen. De JA is vergeleken met soortgelijke zoogdierlijke cellen gebaseerde assays en werd gevonden een vergelijkbaar hoog reproduceerbaar, terecht positieve en negatieve oestrogene ware identificatie rates 29, hoewelugh wordt soms als iets minder gevoelig 27 zijn. Een voordeel van gist gebaseerde reporter assays die in laboratoria zonder aanzienlijke ervaring met zoogdiercelkweek YES gemakkelijker kunnen worden vastgesteld, omdat het minder strenge biologische controlemaatregelen en steriele technieken vereist (YES kan worden uitgevoerd op het tafelblad indien nodig) . De menselijke cellen gebaseerde assays vereisen ook CO 2 incubatoren en luminometers vergeleken met de standaard incubator microplaat lezer gebruikt bij Yes. Twee op basis van gist oestrogeen reporter assays (YES, Saccharomyces cerevisiae en A-YES, Arxula adeninivorans) worden momenteel inter-laboratorium paden voor de validatie van ISO 19040 "Water - Bepaling van de oestrogene potentie van water en afvalwater" aandacht voor de industrie belangstelling voor deze technieken.
Er zijn een aantal beperkingen van de beschreven werkwijzen waarin potentiële vervuiling omvattenvan de monsters tijdens de bemonstering, opslag van monsters en analyse met oestrogene stoffen afkomstig uit het veld of het laboratorium omgeving of door menselijke besmetting (bv weekmakers, oppervlakteactieve stoffen, producten voor persoonlijke verzorging). Dit type verontreiniging in de YES assay (of andere cellen gebaseerde reporter assays) de achtergrond verheffen en beïnvloeden het gebruik van de test. monsters of oplosmiddelen water opgeslagen in plastic flessen kan gemakkelijk leiden tot valse positieven. Valse negatieve punten zijn ook van belang aangezien beide LCMS / MS en de YES assay SPE te verlangen dat oestrogenen concentreren op detecteerbare niveaus. De matrix, de keuze van de SPE sorptiemiddel en elutievloeistof kan de extractie-efficiëntie en de soorten verbindingen uitgewassen beïnvloeden. Met behulp van C18 SPE-cartridges voor de extractie met behulp van de in dit protocol beschreven omstandigheden kan een negatieve bias te genereren, zoals zeer polaire en basische verbindingen slecht zouden worden bewaard door het sorptiemiddel. Bovendien is dit protocol vereist reconstructie van de geëlueerde YES eluent van methaanol tot ethanol door indampen aan funder stikstof resulteert in het verlies van vluchtige stoffen droog. Daardoor kan het protocol bieden onderschat oestrogene werkzaamheid van de geteste monsters. Deze beperkingen zijn vooral van belang bij het overwegen van de YES-assay als onbekende of onverwachte verbindingen zouden kunnen worden gemist, omdat ze niet zijn gehaald of ze zijn verloren als gevolg van verdamping. Bovendien LCMS / MS techniek maakt gebruik van gelabelde interne standaarden om te corrigeren voor herstel; Deze benadering kan niet worden gebruikt met de YES assay.
Significante beperkingen van in vivo testen van afvalwater zijn de hoge kosten en de tijd die nodig is voor de beoordeling opzichte van in vitro werkwijzen. Momenteel is het gebruik van visembryo proeven oestrogene te detecteren beperkt. Toch is er enig succes met het produceren van oestrogeen reagerende transgene gloeiende vis embryo's 30, die toekomstige toepassingen zou kunnen zijn geweest. Fathead minnows (die in deze protocol) zijn een gemeenschappelijke laboratoriumdieren en VTG inductie bij mannetjesvissen is een goed gedocumenteerde biomerker van oestrogene blootstelling en een kwantificeerbare maat voor afvalwater effluent oestrogeniciteit 22 of andere oestrogene verbindingen of mengsels 31. OESO-richtlijnen voor hormoonontregelaars zijn gevalideerd met behulp van volwassen dikkopjes, Japans medaka en zebravis 32,33, met VTG zijnde een gevoelige biomarker van blootstelling aan oestrogenen in alle drie soorten. Echter VTG inductie niet direct correleren voortplantingsschade en derhalve de ecologische gevolgen van blootstelling afvalwater, zoals gezien bij ernstig interseks voorn 3. Aan de andere kant, voorn zijn geen klassieke 'laboratorium soorten' voor ecotoxicologie onderzoek vanwege hun grote omvang, lange generatie tijd (2-3 jaar tot seksuele rijpheid te bereiken), reproductieve stijl; groep spawning (fok) vindt eenmaal per jaar, en de moeilijkheid om mannetjes van vrouwtjes (anders dan tijdens identificerenhet paaiseizoen). Echter, dit normaliter gonochoristic soort is zeer goed bestudeerd in het Verenigd Koninkrijk, vanwege de ontdekking dat stroomafwaarts van oestrogene afvalwatereffluent, mannetjesvissen vertoonden verstoringen hun endocrinologie (bijv aanwezigheid van vrouwelijke-specifieke vitellogenine in het bloed) en histopathologie (ovotestes - ontwikkeling van eieren in de testis en / of vrouwelijke reproductieve kanalen) 5,6. Daarom, als een toekomstige toepassing van deze protocollen, voorn (of vergelijkbare soorten) kan een nuttig wilde sentinel soorten om te laten zien als echte verbeteringen afvalwater kwaliteit (en minder oestrogeniciteit) worden gezien in rivieren ontvangen van geavanceerde behandeld afvalwater. Ze kunnen ook worden toegepast bij het einde van leidingsystemen technologisch verbeterde afvalwater van proefschaal planten 7 volgen. Bij het overwegen van welke soorten om te gebruiken in in vivo afvalwater evaluaties is er een afruil tussen de relatief snelle en gecontroleerde testen met behulp van laboratorium soorten ten opzichte van delanger veld gebaseerd, maar meer voor het milieu relevante, het testen van het gebruik van inheemse soorten. Echter, zoals in vivo evaluaties zijn hoge kosten en mag alleen worden beschouwd als de laatste set van tests die na evaluaties met behulp van chemische analyse en in vitro testen.
Kritische stappen in de beschreven protocollen omvatten de voorbereiding en behandeling van monsters en glaswerk (dat wil zeggen, flessen en monstername-apparatuur moet worden voorbehandeld met geschikte oppervlakte-actieve reinigingsmiddel) om besmetting van de monsters van milieuverontreinigende stoffen, ook contact opnemen monsters te beperken met kunststof en vermijd andere materialen die valse positieven produceren. Dit is even belangrijk bij het ontwerpen en bouwen van aquaria en vis blootstelling systemen. Idealiter aquaria (huisvesting voorraden en tijdens blootstelling) moet worden opgebouwd uit materialen met een lage adsorptie 32 met minimale risico besmetting. Roestvast staal kan worden gebruikt voor het effluent of water opslagtanks.Overwegende dat de tanks van een glazen constructie hebben de voorkeur voor aquaria (omdat dit biedt ook gemakkelijke observatie van de vis). Het gebruik van lage graad kunststof pijpen of buizen moeten worden vermeden 32, 34 PVC en ABS kan gebruikt worden als 'goed gekruid, dwz, links voor uitlogen verontreinigingen in stromend verdunningswater ten minste 12 uur vóór gebruik. Medische kwaliteit siliconen slang is met succes toegepast in onze faciliteit voor peristaltische pomp levering van chemicaliën en afvalwater / verdunning water tanks. Evenals overweegt oestrogene verontreiniging in de bouw en het uitvoeren van de waterdieren systeem, is het ook belangrijk om na te denken over de voeding van de vis; veel fatsoen vis voedingsmiddelen zijn gevonden oestrogene om vis te zijn. Het is daarom belangrijk om alle voedingsmiddelen te testen op activiteit (bijvoorbeeld in de gist Oestrogeen scherm bekijken Beresford et al. 14) voorafgaand aan het gebruik ervan in dit soort onderzoeken.
Probleemoplossenvan de chemische analyse of YES assay protocollen beschreven wordt vereenvoudigd als kwaliteitsgarantie monsters waaronder meerdere reizen, laboratorium en oplosmiddel blanks worden geanalyseerd, naast positieve controles en echte steekproeven om vals positieve en vals negatieve resultaten te elimineren. Positieve (bijvoorbeeld EE2) en negatieve (verdunningswater) met controle moet ook altijd worden gebruikt in de in vivo assays voor gevoeligheid verwachte biologische biomarker of eindpunt (dwz VTG of histopathologie) te bevestigen, en laat onverwachte verontreinigingen te detecteren ( bijvoorbeeld van experimentele set-up, dieet, of verdunning wateren). Eventuele wijzigingen in het protocol moet voorafgaand aan het verrichten van alle studies worden gevalideerd.
Met een striktere regulering van oestrogene stoffen in het milieu terecht via RWZI afvalwater is voorzien dat effectiever afvalwaterbehandeling technologieën zullen moeten worden ontwikkeld. De batterij van de in dit manuscript beschreven tests compliment van deecotoxicologische en chemische evaluatie testen gewoonlijk worden toegepast op afvalwaterzuiveringsinstallatie lozingen. Daarom toekomstige toepassing van dit soort holistische batterij van de test in staat moet stellen het afvalwater technologie-ontwikkelaars en exploitanten, om de meest ecologisch verantwoord ontwerpen rekening houdend met de beste methoden om zowel de specifieke gereguleerde oestrogene stoffen en de totale biologische activiteit te verwijderen uit te voeren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | 37 °C incubation required for carp assay |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Icemaker | Scotsman | AF80 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
| Microfuge tubes, 0.5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Microfuge tubes, 1.5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
| Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
| Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
| Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
| Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Cover slips, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
| Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Yeast screen | |||
| Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
| Incubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
| 96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
| HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Iron(III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorophenolred-β-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Acetone | Rathburn | ||
| Acetonitrile | Rathburn | ||
| Ammonia solution | Rathburn | ||
| Ethylacetate | Rathburn | ||
| Copper(II) nitrate | Sigma-Aldrich | ||
| Acetone | Rathburn | ||
| Dichloromethane | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-ethynyl oestradiol | CDN Isotopes | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estrone | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-ethynyl oestradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Hexane | Rathburn | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
| Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Fish study | |||
| orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| pumsil silicon tubing 0.8 bore 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| 200 series multi-channel persitaltic pump | Watson Marlow | 205CA | |
| Silicone tubing x 15 m (dosing tanks) | VWR | SFM1-3250 | |
| silicone tubing x 15 m (large for inflow/outflow) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2.5 L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetic stir bar 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17α-Ethynylestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| disposable liners for manifold | Sigma Aldrich | 57059 | |
| filtration tubes without frits 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| reservior adaptors pk 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| stainless steel weight for manifold pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| male Luer plug for manifold pk 12 | Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57265 | |
| stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Waters | WAT020515 | |
| Methanol HPLC grade 2.5 L | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 7 ml glass vials with lids (58 x 17 mm) pk 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| vacuum pump, e.g., VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |
References
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T.
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511 (2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32 (2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
