"吞噬体封闭试验"可视化吞噬体形成的三个维度利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）

吞噬作用是，随着识别和表面受体，其然后导致摄入材料的内化和降解材料的结合开始的主要细胞功能。而单细胞真核生物如模具粘菌和阿米巴使用吞噬的细菌喂食，高等生物进化与专业的细胞。巨噬细胞或树突状细胞是针对在各种组织和器官的病原体防御的第一线，并且通过抗原呈递和细胞因子的产生^1-4激活适应性免疫系统的关键。在某些情况下吞噬作用可以由非专业的吞噬细胞， 例如，内皮细胞和上皮细胞中进行。这个过程是非常重要的开发过程中，并在成年后正常组织转化和重塑保持动态平衡。最后，专门吞噬细胞如支持细胞中的睾丸或视网膜色素上皮细胞是非常有效的吞噬细胞^5。

一个吞噬体的形成，其中的微生物或细胞碎片的降解发生与吞噬受体的吞噬细胞的表面上的聚类开始。如Fc受体（FCR）或补体受体（CRS）以下调理受体集群下游信号事件已得到很好的特点。然而，也有许多非调理性受体，包括Toll样受体（TLRs），凝集素，甘露糖受体和清道夫受体。这些受体识别的粒子表面上的决定因素如甘露糖或岩藻糖残基，磷脂酰丝氨酸，和脂多糖^1,6-9。

病原体或细胞碎片的识别包括结合和多种类型的吞噬受体，然后引起强烈的和短暂的肌动蛋白重塑的群集。在细胞内compartmen并行，焦胞吐TS有助于膜张力的释放而为大颗粒的有效细胞吞噬重要。导致肌动蛋白聚合和膜变形的信号事件在实验模型触发一个吞噬受体进行了解剖。期间的FcR介导的吞噬作用，存在由小GTP酶（外消旋，Cdc42的）调节的强烈的肌动蛋白聚合。在他们的下游效应，所述Wiskott-Aldrich公司综合征蛋白（WASP）导致了成核肌动蛋白微丝^1,2,4,10的肌动蛋白相关蛋白2/3复合体（的Arp2 / 3）的激活。当地生产磷脂4,5二磷酸（PI（4,5）P _2）的为驱动伪足形成初始肌动蛋白聚合的关键。其转化为PI（3,4,5）P ₃需要伪足扩展和吞噬体封闭^11。几个途径有助于_{PI（4,5）P2}的消失。首先磷脂酰肌醇磷酸基那支队SES（PIPKIs）从吞噬逮捕_{PI（4,5）P2}的合成。其次，它可以被磷酸化并通过类消耗我PI3K激酶（PI3K）和PI（3,4,5）P ₃ ¹²转换。一种用于磷酸酶和磷脂酶作用也已在_{PI（4,5）P2}水解和F-肌动蛋白去除在哺乳动物细胞和在盘基网柄 ^13,14吞噬期间暗示。磷脂酶C（PLC）δ水解的PI（4,5）P ₂为二酰基甘油和肌醇1,4,5- 三磷酸盐。该_{PI（4,5）P2}和PI（3,4,5）P ₃磷酸OCRL（罗威oculocerebrorenal综合征）也被牵连的吞噬小体的形成。 F-肌动蛋白和其解聚的精确局部形成在空间和时间被严格调控，我们已经表明细胞内隔室的招募到本地传递OCRL磷酸酶，从而在吞噬杯的底部有助于当地肌动蛋白解聚是重要

对吞噬体闭合和膜断裂所需的机制和分子玩家仍定义不清，因为在可视化和监测吞噬体封闭的部位的困难。直到最近，观察到在该上其背面或在其两侧内在粒子固定或活细胞的吞噬能力，​​使得吞噬体闭合困难的部位的及时可视化。此外，固定方法可能会导致膜和偏见的伪足延伸和闭合的结果回缩。相比之下，我们已经建立并在这里描述的实验使我们能够可视化伪足延伸，并在活细胞^13，吞噬关闭一步基于全内反射显微镜^{（TIRFM）16。}该光学技术使用渐逝波在一个透明的界面，以激发在薄区域的荧光团，以便盖（盖玻片）和液体（细胞培养基）。激发深度的厚度为约100纳米的从固体表面，从而允许接近质膜分子事件的可视化。 TIRFM允许高的信号 - 背景比率，并且限制所收集的失焦荧光和细胞毒性由于细胞的照明。

趁着TIRFM，我们开发了"吞噬体闭合测定法"，其中盖玻片用聚赖氨酸活化，然后涂上的IgG调理的红血细胞（IgG的SRBCs）。然后表达的兴趣瞬时荧光标记蛋白的巨噬细胞被允许吞没的IgG-SRBCs。而细胞分离该非共价结合于玻璃表面上的目标粒子，所述伪足的尖端可观察并记录在TIRF模式。 TIRF收购相结合，与在落射荧光模式采集，移位上述阶段3微米，这允许相后吞噬杯的基部的ualization。的药理学药物，例如那些在此过程中抑制肌动蛋白或dynamin上加成，也可以在分子水平上，以进一步解剖过程。

在这里详细描述的协议为RAW264.7小鼠巨噬细胞系和调理粒子，但实际上，它可以适用于任何其他吞噬细胞，并与其他目标，如珠。这种方法将使监管更好的表征在时间和在各种吞噬过程中涉及伪足延伸和吞噬封闭分子球员空间。

注意:使用Lifeact-mCherry质粒是纪尧姆蒙塔尼亚克博士，居里研究所，巴黎^，17后产生的一种恩赐。

1.细胞和转染

注意:RAW264.7巨噬细胞生长至在完全培养基分汇合（RPMI（罗斯韦尔园区纪念研究所）1640培养基中，10毫米的HEPES，1mM的丙酮酸钠，50μMβ巯基乙醇，2mM的L-谷氨酰胺和10％FCS（在100毫米的钢板胎牛血清））。他们被转染通过电编码荧光标记蛋白的质粒。例行约5 - 6×10 ^6个细胞用20微克或10微克质粒为每个转染或共转染的分别转染。注意，基于电穿孔或脂转染转染的其它装置可以用作替代方法。

1. 刮细胞与细胞挺杆和通过上下吹打数次重悬在10ml培养基中。
2. 离心机细胞悬浮液300 XG，在RT在摆动角度转子5分钟。
3. 预热10的完全培养基中的溶液在37℃下在补充有10微克/毫升庆大霉素。
4. 离心后，弃去上清液和悬浮颗粒从电套件3毫升"洗涤液A"的。
5. 离心细胞悬浮液300 XG，在摆动角转子室温下5分钟。
6. 在此期间，在室温下制备的DNA混合物:120微升2×缓冲液B，20微克质粒DNA编码感兴趣的蛋白质，QSP 240微升H ₂ O的
7. 离心后，弃去全部上清。
8. 悬浮在该DNA混合物中的细胞沉淀和转制成4mm电试管。
9. 孵育在室温3分钟。
10. 在电穿孔250 V，900μF。
11. 立即重悬补充有庆大霉素在预热（37℃）的细胞完全培养基和板的米100毫米的菜。
12. 孵育转染的细胞在37℃，5％CO ₂过夜。
13. 第二天早上，用10毫升无血清显微镜培养基（RPMI 1640无酚红，10毫米的HEPES，1mM丙酮酸钠，50μMβ巯基乙醇，2mM的L-谷氨酰胺）取代的完全培养基。

2.调理作用红细胞

注意:作为对巨噬细胞粒子目标的模型，绵羊红细胞（SRBCs）被使用。通常，使用？35毫米的玻璃底培养皿约7×10 ⁶ SRBCs。

1. 用100μl1×PBS（磷酸盐缓冲盐水）/0.1% BSA（牛血清白蛋白）和离心机（600 XG，4分钟）的洗SRBCs。
2. 离心后，弃去上清液并在/100μl的1×PBS中的0.1％BSA和离心机（600 XG，4分钟）重悬SRBCs。
3. 离心后，弃去上清液和/ 0.1％BSA中与兔IgG抗SRBCs悬浮SRBCs在1×PBS中在子凝集的浓度。用500微升含有抗体/ 5微升SRBCs的解决方案。
   注:抗体的子凝集的浓度对应于没有诱导检测为形成网络的凝集的最低浓度。在一般情况下，该子凝集的浓度为8.2微克/毫升。
   1. 确定由一血凝试验，以opsonize的SRBCs所需IgG抗SRBCs的浓度。连续稀释IgG抗SRBCs（股票以13.1毫克/毫升）1/50之间 - 在微孔板1 / 25,600。加2×10 ⁶ SRBCs在每个孔中。孵育在室温黑暗中板为几个小时。
4. 孵育在室温下缓慢旋转30分钟。
5. 在1×PBS /洗涤两次如上所述0.1％BSA后，重悬在预热的无血清显微镜培养基中的IgG调理的SRBCs（IgG的SRBCs）（2毫升/皿）。

盖玻片的3聚赖氨酸涂层

1. 同时，治疗35毫米玻璃底培养皿用2ml 0.01％聚-L-赖氨酸，在室温下30分钟。
2. 用2毫升1X PBS的洗碗两次。

4.玻璃底菜SRBCs的非共价固定

1. 倒入2毫升？35毫米的玻璃底菜SRBCs暂停。
2. 在2分钟到35 mm的玻璃底菜与500 XG摆动转子离心机。
3. 除去上清液并用2ml 1×PBS中/ 10％的BSA洗涤一次。
4. 孵育该颗粒30分钟，用2ml每皿1×PBS / 10％的BSA。
5. 用2毫升1X PBS的洗碗三次。
6. 替换1×PBS中与2ml预温（37℃）的无血清显微镜培养基。

5.通过吞噬TIRFM可视化

1. 显微镜
   注意:使用配备有油浸物镜（N 100X，NA1.49），一个加热室用CO ₂在显微镜下进行TIRFM，以及两个唱勒光子检测摄像机EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）加上1.5X透镜。
   1. 的TIRF显微镜会话的前一天，在37ºC打开加热室，以允许显微镜阶段的均匀加热。
2. 临界角测定
   注:ImageJ的颜色校准软件，用于处理TIRF图像流。
   1. 将含在显微镜下无血清培养基显微镜调理SRBC 35毫米的玻璃底菜。
   2. 刮细胞，并加入他们之前重悬在中 - 在盘中（100 500微升）。
   3. 使用"实时采集"软件控制的显微镜，并用491纳米和/或一个561纳米的激光来鉴定表达荧光标记蛋白的细胞进行激励。
   4. 鉴定表达所述荧光标记蛋白的细胞。
   5. 将其放置在场地中央，并获得500 IM年龄在一个激励波长，以不同的角度从0度开始到5度，与0.01º（ 图2A）的一个增量。的角度由显微镜系统自动改变。
   6. 确定的临界角使得入射光在玻璃/介质界面全反射而产生损耗波。使用ImageJ色彩管理软件，通过点击"文件"打开图像序列中，"打开"，然后选择文件。
   7. 具有均匀的荧光（ 图2B黄1）选择感兴趣区域（ROI）的区域，与矩形工具，在细胞。
   8. 画出"Z轴轮廓"在下拉菜单和"情节Z轴配置文件"点击"图像"选项卡，"堆栈"上（ 图2B意味着与x轴的角度函数的ROI测量荧光强度红色2）。
      注:临界角是导致马角在荧光急剧下降之前ximum荧光。
   9. 在显微镜会话期间使用在x轴优于临界角的角度的任何值，以获得一个TIRF信号如实施例2.00（ 图2C）。
3. 收购
   1. 使用实时采集软件，设置采集与模块"协议编辑器"（ 图3A）的参数。
      1. 一个"循环"包括"多频道"采集获得从在TIRF区域感兴趣的蛋白质的荧光信号创建的协议。输入的TIRF角度（例如2.00），则曝光时间（例如50毫秒）和激光强度（例如50％）（图3B 1）。
      2. 引进目标3微米TIRF区上方的"Z移动"来获得信号采集萤光中的"多渠道"的工具。输入低于T角他临界角（如实施例1.00），博览会的时间（50毫秒）和激光强度（50％）（ 图3B中，2和3）。
      3. 接下来，添加以下目标3微米的"Z移动"，在TIRF区域（ 图 3B 4）返回。添加单元格的"快照"在明亮的光线的LED（发光二极管）（ 图3B 5）。
   2. 发现感兴趣的细胞与荧光标记蛋白表达的中等水平，通过在颗粒周围延伸质膜发起SRBC的吞噬作用。
   3. 将其放置在场地中央。
   4. 启动流媒体采集500 - 1000帧。在"循环计数"选项卡，输入"750帧"（ 图 3B 1）。
      注:ImageJ的颜色校准软件，用于处理TIRF图像流。
   5. 通过点击打开的Image J软件序列图像"文件"，"打开"，然后选择该文件。
   6. 通过点击选项卡"图像"分开的通道，"Hyperstacks"下拉菜单，在"堆栈到hyperstack"功能。完成出现的窗口:订单:xyctz;通道（C）:信道数（例如:"2"，如果你有两个荧光染料）;切片（Z）:在Z轴的切片的数目（例如:"1"，如果在z轴没有运动）;帧（T）:每通道数除以图像的数量;显示模式:灰度。
      注意:两个单独的图像序列被生成，对应于两个不同的通道。

在这个手稿所述的实验系统在图1中示意性地表示。表达融合于荧光标签目的蛋白质转染RAW264.7巨噬细胞被置于接触的IgG调理的绵羊红细胞（SRBCs），该是非共价地固定上盖玻片。巨噬细胞可以从盖玻片分离SRBC吞噬它。所使用的TIRF显微镜允许伴随采集从TIRF区域对应于萤光模式的伪足和信号的尖端一个Z偏移大于3微米后的信号。

如在图2中这确保从质膜低于100nm的区域的清洁的TIRF信号描述有必要确定用于全内反射荧光的临界角。 图3表示acquisiti的发展通过一个被称为"协议编辑器"模块参数包含在现场采集软件。该模块允许用户创建，他们被送到显微镜，将执行过程之前管理工作流。在收购结束时，用户收集了TIFF流。

如图4所示，RAW264.7中的巨噬细胞"吞噬体封闭法"与质粒（ 如 Lifeact-mCherry，纪尧姆蒙塔尼亚克博士，居里研究所，巴黎的一种礼物，之后转产生的代表活细胞TIRFM电影17）按照肌动蛋白聚合。巨噬细胞瞬时表达质粒被允许吞没绑定到盖玻片IgG的SRBCs。作为伪足的前端分别结合在玻璃盖玻片围绕一个SRBC，在TIRF区域中检测到F-肌动蛋白环（顶面板），该逐步变窄，直到其关闭。并行地，模糊F-肌动蛋白移上述（底部面板）对应于解聚在吞噬杯的底部的阶段为3μm后通过荧光信号来检测。采集3分钟后，将SRBC被完全内化，如用透射光（面板上的右侧）确认。

因此，这种方法可以被用于正确区分发生在伪足的非常末端并在吞噬杯的底部发生的分子事件的分子事件。

图1."吞噬体封闭测定"通过TIRFM分析的示意图 。吞噬体闭合测定是使用巨噬细胞瞬时表达一种或两种荧光标记的蛋白进行的。巨噬细胞上沉积的IgG调理的SRBCs非共价地固定在多聚赖氨酸COA特德盖玻片。影像会记录在TIRF模式检测萤光模式吞噬体封闭和现场检测吞噬杯的底部。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:TIRFM的临界角的测定。 （A）使用"实时采集"，表达荧光标记的蛋白质的细胞被置于场（区1中红色）的中间。与TIRF堆栈选项，图像在一个激励波长被收购，以不同的角度从0°开始最多5°，0.01°（在红色区域2）的增量。（B）中的图像的序列是使用ImageJ打开色彩管理软件和AR平均荧光强度感兴趣egion（ROI）的曲线，显示使用"栈"和"PlotZ轴轮廓"（红色区域1）的x轴的角度的函数。（C）的荧光的峰值在图上的x位置对应于临界角:1.98°（黑色虚线）。可以用这个角度后的任何价值。作为一个例子，2.00°可以选择（红色线）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 使用实时采集模块的工作流过程:"协议编辑器"。 （一）在"议定书编辑器"窗口，创建工作流画布。（B）该协议包括的行动，该显微镜将决定重复的次数"循环"由用户。作为一个例子:750（1）。一个循环包括:"多渠道"收购与在TIRF模式的兴趣荧光蛋白的激光激发。作为例子:激光波长491强50％-TIRF角度2.00（2）;客观的"Z移动"3微米（3）; "多渠道"收购落射荧光模式（4）客观的"Z移动"回TIRF区域（5）和一个"快照"，在透射光（6）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4. F-肌动蛋白积累截至吞噬体封闭。封闭吞噬体实验的网站使用点 RAW264.7细胞瞬时表达质粒Lifeact-mCherry（纪尧姆莫博士惠赠进行ntagnac，居里研究所，巴黎，17后生成）。质粒信号在TIRF区域（顶部）和在表面荧光模式（底部）获得的。红色箭头表示在TIRF区域肌动蛋白的积累。在3分钟透射光图像呈现，表明内在SRBC。比例尺，10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

电影1:F-肌动蛋白的累积在伪足的提示和在吞噬体封闭的站点，而这是使用的RAW264.7巨噬细胞瞬时表达的质粒进行吞噬杯吞噬体闭合测定法的基本清除。使用TIRFM在TIRF区域（顶部）的质粒成像和在表面荧光模式（底部）进行替代立法院在37℃3分钟内每50毫秒。 请点击此处观看该视频。

作者没有什么可透露的。