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利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

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DOI：

10.3791/54470

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2016年8月26日

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

本文内容

摘要

我们描述了一种实验装置，利用全内反射荧光显微镜，在活体巨噬细胞中以前所未有的高分辨率三维可视化吞噬体的形成与闭合过程。该方法可实时监测吞噬杯底部、延伸的伪足，以及吞噬体断裂的精确位点。

摘要

吞噬作用是特化细胞用于内化并清除微生物或细胞碎片的一种机制。该过程依赖于肌动蛋白细胞骨架的显著重排，而细胞骨架正是驱动质膜在颗粒周围延伸的主要力量。此外，对较大物质的有效吞噬还依赖于细胞内区室的局部胞吐作用。这一过程具有高度动态性，已有大量分子被发现参与吞噬杯的形成。然而，这些分子在时间和空间上的精确调控机制仍不明确。另外，由于采用RNA干扰或显性负性突变体进行抑制常常导致吞噬杯形成停滞，吞噬体闭合的最后一步极难被观察到。

我们建立了一种专用的实验方法，结合全内反射荧光显微镜（TIRFM）与落射荧光技术，逐步监测伪足及其尖端在盖玻片上松散附着颗粒周围形成吞噬体过程中的延伸情况。该方法使我们能够在活细胞中同时以高分辨率观察两种不同荧光标记蛋白所在伪足的最尖端及其在吞噬体闭合过程中的融合现象。

引言

吞噬作用是一种重要的细胞功能，始于物质与细胞表面受体的识别和结合，随后导致摄入物质的内化和降解。单细胞真核生物（如黏菌Dictyostelium discoideum和变形虫）利用吞噬作用摄取细菌作为营养，而高等生物则进化出了专职的吞噬细胞。巨噬细胞或树突状细胞是多种组织和器官中抵御病原体的第一道防线，并通过抗原呈递和细胞因子产生，在激活适应性免疫系统中起关键作用1-4。在某些情况下，非专职吞噬细胞（e.g., 内皮细胞和上皮细胞）也能执行吞噬作用。该过程对于发育过程中以及成体正常组织更新与重塑期间维持稳态具有重要意义。最后，某些特化的吞噬细胞，如睾丸中的支持细胞（Sertoli cells）或视网膜色素上皮细胞，具有极强的吞噬能力5。

吞噬体的形成始于吞噬细胞表面吞噬受体的聚集，吞噬体是降解微生物或细胞碎片的场所。针对调理受体（如Fc受体（FcR）或补体受体（CRs））聚集后所引发的下游信号事件已有充分研究。然而，还存在多种非调理受体，包括Toll样受体（TLRs）、凝集素、甘露糖受体和清道夫受体。这些受体可识别颗粒表面的特定分子结构，如甘露糖或岩藻糖残基、磷脂酰丝氨酸以及脂多糖1,6-9。

病原体或细胞碎片的识别涉及多种吞噬受体的结合与聚集，进而引发强烈而短暂的肌动蛋白重塑。与此同时，细胞内区室的局灶性胞吐作用有助于缓解膜张力，对高效吞噬大颗粒至关重要。在仅激活单一吞噬受体的实验模型中，已解析出导致肌动蛋白聚合和膜变形的信号事件。在Fc受体介导的吞噬作用中，存在强烈的肌动蛋白聚合，该过程由小GTP酶（Rac、Cdc42）调控。在其下游效应分子中，Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASP）可激活肌动蛋白相关蛋白2/3复合物（Arp2/3），从而启动肌动蛋白丝的成核。 1,2,4,10. 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂）的局部生成2）对于驱动伪足形成的初始肌动蛋白聚合至关重要。其转化为PI(3,4,5)P₃3 对于伪足延伸和吞噬体闭合是必需的 11. 多条信号通路参与了PI(4,5)P的消失过程2首先，磷脂酰肌醇磷酸激酶（PIPKIs）从吞噬体上的解离会阻断PI(4,5)P₂的生成。2 合成。其次，它可被I类PI3K激酶（PI3K）磷酸化并消耗，转化为PI(3,4,5)P3 12磷酸酶和磷脂酶在PI(4,5)P中的作用也已被暗示2 哺乳动物细胞吞噬过程中的水解作用及F-肌动蛋白清除 盘基网柄菌13,14. 磷脂酶C（PLC）δ水解PI(4,5)P₂2 生成二酰甘油和肌醇-1,4,5-三磷酸tris磷酸。PI(4,5)P2 和 PI(3,4,5)P3 磷酸酶OCRL（Lowe眼脑肾综合征蛋白）也被证实参与吞噬体的形成。F-actin的精确局部形成及其解聚在时空上受到严格调控，我们已证明细胞内区室的招募对于将OCRL磷酸酶递送至局部区域至关重要，从而促进吞噬杯底部的局部肌动蛋白解聚。 13,15为此，我们采用了此处所述的实验装置。

由于难以观察和监测吞噬体闭合位点，吞噬体闭合及膜断裂所需的机制和分子参与者至今仍不明确。过去，吞噬作用通常在固定细胞或活细胞上进行观察，这些细胞从背侧或侧面内吞颗粒，使得吞噬体闭合位点的适时可视化变得困难。此外，固定方法可能导致膜回缩，从而对伪足延伸和闭合的实验结果造成偏差。相比之下，我们建立并在此描述的实验方法能够基于全内反射荧光显微镜（TIRFM）1316，在活细胞中实时观察伪足延伸及吞噬作用的闭合过程。该光学技术利用渐逝波激发透明固体（盖玻片）与液体（细胞培养基）界面处一个薄层区域内的荧光分子。激发深度约在固体表面100 nm范围内，因而可实现对质膜附近分子事件的可视化。TIRFM具有高信噪比，能够减少非焦平面荧光信号的采集，并降低因光照引起的细胞毒性。

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），我们开发了"吞噬体闭合检测方法"。该方法首先用多聚赖氨酸活化盖玻片，然后将其涂覆以IgG调理的红细胞（IgG-SRBCs）。接着让表达瞬时荧光标记目标蛋白的巨噬细胞吞噬这些IgG-SRBCs。当细胞将非共价结合于玻璃表面的靶颗粒脱落后，可在TIRF模式下观察并记录伪足尖端的动态过程。通过将载物台升高3 µm切换至落射荧光模式进行成像，可与TIRF成像结果结合，从而实现对吞噬杯底部的可视化观察。此外，在实验过程中加入如抑制肌动蛋白或动力蛋白的药理学试剂，有助于在分子水平上进一步解析该过程。

本文详细描述的实验方案适用于RAW264.7小鼠巨噬细胞系及调理颗粒，但原则上可适用于其他任何吞噬性细胞以及诸如微珠等其他靶标。该方法将有助于更深入地表征在不同吞噬过程中，参与伪足延伸和吞噬体闭合的分子因子在时间和空间上的调控机制。

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方案

注意：所使用的 Lifeact-mCherry 质粒由巴黎居里研究所 Guillaume Montagnac 博士惠赠，该质粒的构建参考了文献17。

1. 细胞与转染

注意：RAW264.7 巨噬细胞在 100 mm 培养皿中，使用完全培养基（RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和 10% FCS（胎牛血清））培养至亚汇合状态。通过电穿孔法将编码荧光标记蛋白的质粒转染至细胞中。通常每次转染或共转染分别使用 20 µg 或 10 µg 质粒，转染约 5 - 6 × 106 个细胞。请注意，基于电穿孔或脂质体转染的其他转染方法也可作为替代方案使用。

  1. 用细胞刮刀刮下细胞，并通过反复吹打数次，将细胞重悬于10 ml培养基中。
  2. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，使用水平转子。
  3. 将 10 ml 添加了 10 µg/ml 庆大霉素的完全培养基在 37 °C 预热。
  4. 离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 3 ml 的 "洗涤缓冲液A" 来自电穿孔试剂盒。
  5. 将细胞悬液在室温下以300 × g离心5分钟，使用水平转子。
  6. 同时在室温下配制DNA混合液：120 µl 2x Buffer B，20 µg 编码目标蛋白的质粒DNA， q.s.p. 240 µl H2O.
  7. 离心后，弃去全部上清液。
  8. 将细胞沉淀重悬于DNA混合物中，并转移至4 mm电穿孔比色皿中。
  9. 室温孵育 3 分钟。
  10. 电穿孔条件：250 V，900 µF。
  11. 立即用预热（37 °C）的含庆大霉素的完全培养基重悬细胞，并接种至100 mm培养皿中。
  12. 将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜2.
  13. 次日早晨，将完全培养基更换为10 ml无血清显微镜观察用培养基（不含酚红的RPMI 1640，含10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺）。

2. 红细胞的调理作用

注意：绵羊红细胞（SRBCs）被用作巨噬细胞的颗粒靶标模型。通常，每个35 mm玻璃底培养皿中使用约7 x 106个SRBCs。

  1. 用100 µl 1x PBS（磷酸盐缓冲液）/0.1% BSA（牛血清白蛋白）洗涤SRBCs，并离心（600 × g，4分钟）。
  2. 离心后，弃去上清液，将SRBCs重悬于100 µl 1x PBS/0.1% BSA中，再次离心（600 × g，4分钟）。
  3. 离心后，弃去上清液，将SRBCs重悬于含亚凝集浓度兔IgG抗SRBCs的1x PBS/0.1% BSA溶液中。每5 µl SRBCs使用含抗体的溶液500 µl。
    ​注意：抗体的亚凝集浓度是指未引起凝集（即未形成网状结构）的最低浓度。通常，亚凝集浓度为8.2 µg/ml。
    1. 通过血凝试验确定用于包被SRBCs的IgG抗SRBCs所需浓度。将IgG抗SRBCs（储存浓度为13.1 mg/ml）在微孔板中进行系列稀释，稀释倍数范围为1/50至1/25,600。每孔加入2 × 106 个SRBCs。将微孔板避光、室温孵育数小时。
  4. 室温下缓慢旋转孵育30分钟。
  5. 按照上述方法用1x PBS/0.1% BSA洗涤两次后，将IgG包被的SRBCs（IgG-SRBCs）重悬于预热的无血清显微镜成像培养基中（2 ml/皿）。

3. 盖玻片的多聚赖氨酸包被

  1. 同时，在室温下用 2 ml 的 0.01% 多聚-L-赖氨酸处理 35 mm 玻璃底培养皿 30 分钟。
  2. 用 2 ml 的 1× PBS 将培养皿洗涤两次。

4. 玻璃底培养皿上SRBCs的非共价固定

  1. 每35 mm玻璃底培养皿中加入2 ml SRBCs悬液。
  2. 将35 mm玻璃底培养皿置于摆动转子离心机中，以500 × g离心2分钟。
  3. 吸除上清液，并用2 ml 1× PBS/10% BSA洗涤一次。
  4. 每皿加入2 ml 1× PBS/10% BSA，孵育颗粒30分钟。
  5. 用2 ml 1× PBS将培养皿洗涤三次。
  6. 弃去1× PBS，每皿加入2 ml预热至37 °C的无血清显微镜成像培养基。

5. 通过全内反射荧光显微镜观察吞噬作用

  1. 显微镜
    注意：TIRFM 使用配备油浸物镜（N 100X，NA 1.49）、含 CO₂ 的加热培养箱的显微镜进行2，以及两台配备1.5倍镜头的单光子探测相机EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）。
    1. 在进行TIRF显微镜实验的前一天，开启加热培养箱并设置温度为37 ºC​ 以实现显微镜载物台的均匀加热。
  2. 临界角测定
    注意：使用 ImageJ Color Profiler 软件处理 TIRF 图像序列。
    1. 将含有经血清调理的SRBC和无血清显微镜成像培养基的35 mm玻璃底培养皿置于显微镜下。
    2. 刮下细胞并重悬于培养基中，然后将细胞悬液（100 - 500 µl）加入培养皿中。
    3. 使用 "活体采集" 用于控制显微镜的软件，并通过491 nm和/或561 nm激光激发，以鉴定表达荧光标记蛋白的细胞。
    4. 鉴定表达荧光标记蛋白的细胞。
    5. 将其置于视场中央，在一个激发波长下采集500张图像，角度从0º开始，以0.01º为增量逐步增加至5º图2A）。显微镜系统会自动调整角度。
    6. 确定使入射光在玻璃/介质界面发生全反射并产生倏逝波的临界角。使用 ImageJ Color Profiler 软件，通过点击打开图像序列 "文件", "打开" 并选择文件。
    7. 使用矩形工具在荧光均匀的细胞中选择一个感兴趣区域（ROI）图2B 黄色 1).
    8. 绘制 "Z轴剖面图" 通过点击以 x 轴上的角度为函数的 ROI，测量其平均荧光强度 "图像" 标签, "堆叠" 在下拉菜单中 "绘制 Z 轴剖面图" (图2B 红色 2).
      注：临界角是指荧光强度在急剧下降前达到最大值时对应的角度。
    9. 在显微成像过程中，使用x轴上大于临界角的任意角度值，以获得TIRF信号，例如2.00（图 2C).
  3. 采集
    1. 使用 Live Acquisition 软件，通过“Protocol Editor”模块设置采集参数（图3A).
      1. 创建一个包含“多通道”采集的“循环”方案，用于获取TIRF区域中目标蛋白的荧光信号。输入TIRF角度（例如2.00）、曝光时间（例如50毫秒）和激光强度（例如50%）。 （图3B 1).
      2. 在物镜上引入一个高于TIRF区域3 µm的“Z轴移动”，以使用“多通道”工具在落射荧光模式下获取信号。输入低于临界角的角度（例如1.00）、曝光时间（50 msec）以及激光强度（50%）图3B、2和3).
      3. 接下来加入一个 "Z轴移动" 物镜下方3 µm处，以返回至TIRF区域（图 3B 4）。加入 "快照" 细胞在明亮LED（发光二极管）光下的图3B 5).
    2. 找到一个表达中等水平荧光标记蛋白且正在吞噬SRBC的细胞，该细胞通过延伸细胞膜包裹颗粒来启动吞噬作用。
    3. 将其放置在视野中央。
    4. 开始连续采集 500 - 1,000 帧图像。在“循环次数”选项卡中，输入“750 帧”（图 3B 1).
      注意：使用 ImageJ Color Profiler 软件处理 TIRF 图像序列。
    5. 在 Image J 软件中，点击“File”、“Open”，选择文件以打开序列图像。
    6. 通过点击“Image”选项卡、“Hyperstacks”下拉菜单中的“Stack to hyperstack”功能来分离通道。在弹出的窗口中完成以下设置：顺序（Order）：xyctz；通道（c）：通道数量（例如，若使用两种荧光染料，则输入“2”）；切片（z）：z轴方向的切片数（例如，若z轴无移动，则输入“1”）；帧数（t）：图像总数除以通道数；显示模式（Display mode）：灰度（Grayscale）。
      注意：生成两个独立的图像序列，分别对应于两个不同的通道。

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结果

本研究中描述的实验系统如图1所示。将转染后表达与荧光标记蛋白融合的目的蛋白的RAW264.7巨噬细胞与IgG调理的绵羊红细胞（SRBCs）接触，这些SRBCs通过非共价方式固定在盖玻片表面。巨噬细胞可将SRBC从盖玻片上剥离并吞噬。所用的全内反射荧光（TIRF）显微镜可同时采集TIRF区域的信号（对应伪足尖端）以及在Z轴方向上移3 µm后通过落射荧光模式采集的信号。

必须确定全内反射荧光的临界角，如图2所示。这可确保从质膜下方100 nm区域获得清晰的TIRF信号。图3展示了通过Live Acquisition软件中包含的名为“Protocol Editor”的模块开发采集参数的过程。该模块允许用户在将流程发送至显微镜执行前创建和管理工作流程。采集结束后，用户将获得一个TIFF图像流。

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讨论

本文所述实验方案提出了一种前所未有的方法，可在活细胞中以高分辨率实时观察吞噬体的形成过程，特别是其闭合阶段。有几个技术方面需要讨论。首先，该实验对温度极为敏感。必须确保加热腔室温度维持在 37 °C，并且所有培养基、器械或细胞均在腔室内操作，以避免温度波动影响吞噬作用的效率。我们发现，即使微小的温度变化也足以阻止吞噬体的形成。其次，本文描述的方案可精确确定全内反射荧光（TIRF）显微镜在整个实验中所使用的激光入射角度。我们认为，这在进行TIRF实验时具有显著优势，有助于我们对靠近质膜的事件得出可靠结论。第三，在使用瞬时转染细胞时，应选择目标蛋白表达水平适中的细胞。随着基因组编辑技术的革新，未来将能够使用在天然表达水平下表达蛋白的细胞。因此，定量荧光显微镜技术将有望用于探索活细胞中重要功能的动态过程。

通过该检测方法，现在可以精确地在时间和空间上分析参与伪足延伸和融合的各种因素。与使用共聚焦显微镜及不同实验设置进行吞噬体形成成像相比，强制靶标定向吞噬有利于更好地监测延伸中的伪足及闭合部位。唯一的不足之处是通量较低。并非所有基于荧光筛选出的细胞都会在采集时间内发生吞噬作用。一种可能的改...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

我们感谢法国巴黎内克尔研究所（Institut Imagine Necker）的 Alexandre Benmerah 博士在实验方法设计初期提供的讨论，以及 Jamil Jubrail 博士对文稿的审阅。感谢 Nadège Kambou 和 Susanna Borreill 在本实验室中应用该方法开展实验工作。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）ATIP 计划、巴黎市政府、法国国家科研署（ANR，项目编号：2011 BSV3 025 02）、法国医学研究基金会（FRM，项目编号：INE20041102865、DEQ20130326518，其中包含对 FMA 的博士生奖学金）以及法国艾滋病与病毒性肝炎研究署（ANRS）的资助，其中包括对 JM 的博士生奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗绵羊红细胞 IgGMP Biomedicals55806
牛血清白蛋白热激组分，pH 7，≥98% SigmaA7906
细胞刮Corning3008
4 mm 比色皿Cell projectEP104
不含钙、镁的 DPBSThermo Fischer Scientific14190-094室温保存
电穿孔缓冲液试剂盒Cell projectEB110
100 mm 细胞培养处理培养皿Corning353003
Gene X-cell 电穿孔仪Biorad165-2661
庆大霉素溶液SigmaG1397
35 mm 未包被玻璃底培养皿 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C Case
iMICTILL Photonics配备油浸物镜（N 100X，NA1.49）、含 CO2 的加热培养室、单光子检测 EMCCD（电子倍增电荷耦合器件）相机和 1.5X 镜头
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液SigmaP8920-100ml使用时以水稀释至 0.01% 
RPMI 1640 培养基 GLUTAMAX  添加剂Life technologies61870-010
RPMI 1640 培养基，无酚红（10 × 500 ml）Life technologies11835-105使用前于 37 °C 水浴中预热
绵羊红细胞（SRBCs）EurobioDSGMTN00-0Q使用前在 Alsever 缓冲液中 4 °C 保存

参考文献

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