Introduction
Fagocytose is een belangrijke celfunctie die begint bij de herkenning en binding van het materiaal aan receptoren oppervlakte, die vervolgens leidt tot de internalisatie en degradatie van het opgenomen materiaal. Terwijl eencellige eukaryoten, zoals de mal Dictyostelium discoideum en amoeben gebruiken fagocytose voor het voeden op bacteriën, hebben hogere organismen geëvolueerd met professionele cellen. Macrofagen of dendritische cellen zijn de eerste verdedigingslinie tegen pathogenen in verschillende weefsels en organen, en zijn van cruciaal belang voor het adaptieve immuunsysteem activeren via antigeen presentatie en cytokine productie 1-4. Onder bepaalde omstandigheden fagocytose kan worden uitgevoerd door niet-professionele fagocyten, bijvoorbeeld, endotheel- en epitheelcellen. Dit is van belang om homeostase te handhaven tijdens ontwikkeling en in de volwassenheid voor normaal weefsel omzet en hermodellering. Tenslotte gespecialiseerde fagocyten zoals Sertoli cellen in de testis of retinalepigment epitheelcellen zijn uiterst potente fagocyten 5.
De vorming van een phagosome waarbij afbraak van micro-organismen of celresten optreedt begint met de clustering van fagocytische receptoren op het oppervlak van de fagocytische cellen. Downstream signalering gebeurtenissen na clustering van opsonische receptoren zoals Fc-receptoren (FcR) of complement receptoren (CRS) zijn goed gekarakteriseerd. Er zijn echter ook vele niet-opsonische receptoren waaronder Toll-achtige receptoren (TLRs), lectinen, receptoren en mannose scavenger receptor. Deze receptoren herkennen determinanten deeltjesoppervlak zoals mannose en fucose residuen, fosfatidylserine en lipopolysacchariden 1,6-9.
Pathogeen of celresten erkenning omvat binding van en clustering van verschillende soorten fagocyterende receptor, die vervolgens leiden tot intens en voorbijgaande actine remodeling. Parallel, focale exocytose van intracellulaire compartments bijdraagt aan de afgifte van membraan spanning en is belangrijk voor een efficiënte fagocytose van grote deeltjes. De signalering gebeurtenissen die tot actine polymerisatie en membraan deformatie werden ontleed in experimentele modellen die één fagocyterende receptor geactiveerd. Tijdens FcR-gemedieerde fagocytose, is er intense actine polymerisatie die wordt gereguleerd door kleine GTPases (Rac, Cdc42). Onder hun effectoren, de Wiskott-Aldrich syndroom eiwit (WASP) leidt tot activatie van de Actin-gerelateerd eiwit 2/3 complex (Arp2 / 3) dat actine filamenten 1,2,4,10 nucleates. Lokale productie van fosfatidylinositol-4, 5-bifosfaat (PI (4,5) P2) is essentieel voor initiële actine polymerisatie die pseudopod vorming aandrijft. De omzetting PI (3,4,5) P3 vereist voor pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting 11. Verscheidene signaalwegen tot het verdwijnen van PI (4,5) P2. Ten eerste detachement van fosfatidylinositol fosfaat kinases (PIPKIs) van de phagosome arrestaties PI (4,5) P2 synthese. Ten tweede kan worden gefosforyleerd en geconsumeerd door klasse I PI3K kinases (PI3K) en omgezet in PI (3,4,5) P3 12. Een rol voor fosfatasen en fosfolipasen is ook geïmpliceerd in PI (4,5) P2 hydrolyse en F-actine verwijdering gedurende fagocytose in zoogdiercellen en in Dictyostelium 13,14. De fosfolipase C (PLC) δ hydrolyseert PI (4,5) P2 in diacylglycerol en inositol-1,4,5- tris fosfaat. De PI (4,5) P2 en PI (3,4,5) P3 fosfatase OCRL (oculocerebrorenal syndroom van Lowe) is ook betrokken bij phagosome formatie. Nauwkeurige lokale vorming van F-actine en de depolymerisatie wordt strak gereguleerd in ruimte en tijd en we hebben aangetoond dat rekrutering van intracellulaire compartimenten belangrijk lokaal leveren de OCRL fosfatase, hetgeen bijdraagt aan lokale actine depolymerisatie aan de voet van de fagocytische cup De spelers mechanisme en moleculaire vereist phagosome sluiting en membraan splitsing blijven slecht gedefinieerd vanwege de moeilijkheden bij het visualiseren en controleren van de plaats van phagosome sluiting. Tot voor kort werd fagocytose waargenomen op vaste of levende cellen die deeltjes internaliseren hun dorsale zijde of de zijden, waardoor de tijdige visualisatie van de plaats van sluiting phagosome moeilijk. Bovendien kan bevestigingssystemen terugtrekken van membranen en afwijking de resultaten op pseudopodia uitbreiding en sluiting veroorzaken. Daarentegen is de test die wij hebben opgezet en beschrijf hier kunnen we pseudopod uitbreiding en de afsluiting stap van fagocytose in levende cellen 13, op basis van totale interne reflectie microscopie (TIRFM) 16 visualiseren. Deze optische techniek gebruikt een uitdovende golf fluoroforen in een dunne gebied exciteren op het raakvlak tussen een transparant, zodatdeksel (dekglaasje) en een vloeistof (celkweekmedium). De dikte van de excitatie diepte ongeveer 100 nm van het vaste oppervlak, waardoor visualisatie van moleculaire gebeurtenissen dichtbij de plasmamembraan. TIRFM maakt een hoge signaal-tot-achtergrond verhouding en beperkt de out-of-focus fluorescentie verzameld en de cytotoxiciteit door verlichting van cellen. Maken van TIRFM ontwikkelden we de "phagosome afsluiting assay" waarin dekglaasjes worden geactiveerd met polylysine en vervolgens met IgG-opsonized rode bloedcellen (IgG-SRBC). Macrofagen transiënt tot expressie fluorescent gelabelde eiwitten plaats mogen dan overspoelen de IgG-SRBC. Terwijl de cellen los doeldeeltjes die niet-covalent gebonden aan het glasoppervlak, kunnen de uiteinden van de pseudopods worden afgelezen en geregistreerd in de TIRF modus. TIRF aankopen worden gecombineerd met acquisities in de epifluorescentie wijze, na het verschuiven van de fase 3 urn boven, waardoor de visualization van de basis van de fagocytische cup. Toevoeging van farmacologische middelen zoals actine remmen of dynamin tijdens het proces mogelijk om het proces verder te ontleden op moleculair niveau. De in detail hier beschreven protocol voor RAW264.7 murine macrofaag cellijn en geopsoniseerde deeltjes, maar praktisch kan worden aangepast aan andere fagocytische cellen en andere doelen, zoals parels. Deze methode zal een betere karakterisering van de verordening mogelijk te maken in tijd en ruimte van de moleculaire spelers die betrokken zijn bij pseudopod uitbreiding en phagosome sluiting tijdens diverse fagocytische processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het plasmide gebruikt Lifeact-mCherry is een soort geschenk van Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parijs, geproduceerd na 17.
1. Cellen en Transfectie
Opmerking: RAW264.7 macrofagen worden gekweekt tot sub- confluentie in compleet medium (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 10% FCS ( foetaal kalfsserum)) in een 100 mm plaat. Ze zijn getransfecteerd met plasmiden die coderen fluorescent gelabelde eiwitten door elektroporatie. Routinematig ongeveer 5-6 x 10 6 cellen respectievelijk getransfecteerd met 20 ug of 10 ug plasmide voor elke transfectie of co-transfectie. Merk op dat andere transfectie basis van elektroporatie of lipofectie kan worden gebruikt als alternatieve benaderingen.
- Schraap de cellen met een cel lifter en resuspendeer ze in 10 ml kweekmedium door en neer te pipetteren meerdere malen.
- centrifuge decelsuspensie 300 xg, 5 minuten bij kamertemperatuur in swingende hoek rotor.
- Voorverwarming 10 ml compleet medium gesupplementeerd met 10 ug / ml gentamicine bij 37 ° C.
- Na centrifugatie, gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml "wasbuffer A" van de elektroporatie kit.
- Centrifugeer de celsuspensie 300 xg, 5 min bij kamertemperatuur in zwenkhoek rotor.
- Ondertussen bereidt de DNA mengsel bij kamertemperatuur: 120 ul 2x buffer B, 20 ug plasmide DNA dat codeert voor het eiwit van belang, QSP 240 ui H2O
- Na centrifugeren, gooi het hele supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in het DNA mengsel en breng in 4 mm elektroporatie cuvetten.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min.
- Elektroporatie bij 250 V, 900 uF.
- Onmiddellijk resuspendeer de cellen in de voorverwarmde (37 ° C) compleet medium aangevuld met gentamicine en de plaatm in een 100 mm schaal.
- Incubeer de getransfecteerde cellen een nacht bij 37 ° C, 5% CO2.
- De volgende ochtend, vervangt het compleet medium met 10 ml serumvrij microscopie medium (RPMI 1640 zonder fenolrood, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 50 uM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine).
2. opsonisatie van rode bloedcellen
Opmerking: Als model van deeltjes doelwit voor macrofagen, worden rode bloedcellen van schapen (SRBC's) gebruikt. Meestal is ongeveer 7 x 10 6 SRBC's per 35 mm glazen bodem schaal wordt gebruikt.
- Was de SRBC met 100 pl 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) /0.1% BSA (runderserumalbumine) en gecentrifugeerd (600 xg, 4 min).
- Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de SRBC's in 100 ul 1x PBS / 0,1% BSA en centrifuge (600 xg, 4 min).
- Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de SRBC's in 1x PBS / 0,1% BSA met konijn IgG anti-SRBC'sop sub-agglutinerende concentratie. Gebruik 500 pl oplossing die antilichaam / 5 gl SRBC.
Opmerking: De sub-agglutinerende antilichamen concentratie overeenkomt met de laagste concentratie die geen agglutinatie ontdekt de vorming van een netwerk induceerde. In het algemeen, de verder agglutinerende concentratie 8,2 ug / ml.- Bepaal de concentratie van IgG anti-SRBC verplicht de SRBC opsoniseren door een hemagglutinatie-test. Serieel verdunnen de IgG anti-SRBC (voorraad bij 13,1 mg / ml) tussen 1/50 - 1 / 25.600 in een microplaat. Voeg 2 x 10 6 SRBC's in elk putje. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende verscheidene uren.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder langzaam draaien.
- Na twee wassingen in 1x PBS / 0,1% BSA zoals hierboven beschreven, resuspendeer de IgG-opsonized SRBC (IgG-SRBC's) in voorverwarmd serumvrij medium microscopie (2 ml / schaal).
3. Poly-lysine Coating van Coverslips
- In de tussentijdBehandelen 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml 0,01% poly-L-lysine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- De afwas tweemaal met 2 ml 1x PBS.
4. Niet-covalente Fixatie van SRBC's on Glass Bottom Dishes
- Giet 2 ml SRBC's schorsing per 35 mm glazen bodem schaal.
- Centrifugeren met een swingende rotor bij 500 xg gedurende 2 min op 35 mm glazen bodem gerechten.
- Verwijder de supernatant en was eenmaal met 2 ml 1 x PBS / 10% BSA.
- Incubeer de deeltjes gedurende 30 minuten met 2 ml van 1 x PBS / 10% BSA per schaal.
- De afwas drie keer met 2 ml 1x PBS.
- Vervang 1x PBS met 2 ml voorverwarmde (37 ° C) serumvrij medium microscopie.
5. Fagocytose gevisualiseerd door TIRFM
- Microscoop
Opmerking: TIRFM werd uitgevoerd met een microscoop met een olie-immersie objectief (N 100X, NA1.49), een verhittingskamer met CO 2, en twee zingle fotondetectie camera EMCCD (Electron vermenigvuldigen Charge Coupled Device) in combinatie met een 1.5X lens.- De dag voor de TIRF microscoop sessie, zet de verwarming kamer bij 37 ° C om een homogene opwarming van de microscoop podium staan.
- Kritische hoek Bepaling
Opmerking: ImageJ Color Profiler software wordt gebruikt om TIRF beeld streams te verwerken.- Plaats een 35 mm glazen bodem schaaltje met geopsoniseerd SRBC met serumvrij medium microscopie onder de microscoop.
- Schraap de cellen en resuspendeer ze in het medium voordat ze toe te voegen (100 - 500 pl) in de schaal.
- Met "Live Acquisition" software om de microscoop controleren en uitvoeren van excitatie met een 491 nm en / of 561 nm laser om cellen die fluorescent gelabelde eiwitten te identificeren.
- Identificeren van een cel die de fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengt.
- Plaats het in het midden van het veld en het verwerven van 500 imleeftijden een excitatiegolflengte, met verschillende hoeken vanaf 0 ° tot 5 °, met een toename van 0.01º (figuur 2A). De hoeken worden automatisch gewijzigd door het microscoopsysteem.
- Bepaal de kritische hoek waardoor het invallende licht volledig tot uiting komen in de glazen / medium-interface en het genereren van de uitdovende golf. Met behulp van ImageJ Color Profiler software, opent u de reeks afbeeldingen door te klikken op "File", "Open" en selecteer het bestand.
- Selecteer een van belang (ROI), met de rechthoekige gereedschap, in de cel met een uniforme fluorescentie (Figuur 2B geel 1).
- Zet de "Z-profiel-as" betekent fluorescentie-intensiteit gemeten in de ROI met de functie van de hoeken op de x-as door te klikken op de tab "Beeld", "Stacks" in het drop down menu en "Plot Z-as Profile" (Figuur 2B rood 2).
Opmerking: De kritische hoek is de hoek die naar de maximum fluorescentie voor een scherpe daling van de fluorescentie. - Gebruik een waarde van de hoek op de x-as boven de kritische hoek in de microscopie sessie naar een TIRF signaal bijvoorbeeld 2,00 (figuur 2C) te verkrijgen.
- acquisities
- Met Live Acquisitie software, het opzetten van de parameters van de overname met de module "Protocol Editor" (figuur 3A).
- Maak een protocol met een "loop" omvattende "Multi Channels" overname fluorescerende signaal van eiwitten van belang in de regio TIRF te verwerven. Voer de TIRF hoek (bijvoorbeeld 2,00), de blootstellingstijd (bijvoorbeeld 50 msec) en de laserintensiteit (bijvoorbeeld 50%) (figuur 3B 1).
- Introduceer een "Z move" van de doelstelling van 3 micrometer boven het gebied TIRF om het signaal acquisitie verkrijgen epifluorescentie met de "Multi Channels" tool. Voer een hoek hieronder tHij grenshoek (zoals bijvoorbeeld 1,00), de tijd van blootstelling (50 msec) en de laserintensiteit (50%) (Figuur 3B, 2 en 3).
- Voeg vervolgens een 'z move "van de doelstelling 3 urn hieronder, om terug te keren in de TIRF regio (Figuur 3B 4). Voeg een 'snapshot' van de cel in fel licht LED (Light-Emitting Diode) (Figuur 3B 5).
- Vind een cel van belang met een beperkte mate van fluorescent gemerkt eiwit expressie die fagocytose van SRBC initieert door de uitbreiding van plasmamembraan rond het deeltje.
- Plaats het in het midden van het veld.
- Begin streaming overname van 500 - 1000 frames. In het tabblad "loop count", voert u "750 frames" (Figuur 3B 1).
Opmerking: ImageJ Color Profiler software wordt gebruikt om TIRF beeld streams te verwerken. - Open de reeks beelden in Image J-software door te klikken op"File", "Open" en het kiezen van het bestand.
- Scheid de kanalen door te klikken op de tab "Beeld", "Hyperstacks" drop-down menu en op "Stack HyperStack" -functie. Vul het verschenen venster: Order: xyctz; Channel (c): aantal kanalen (ex: "2" als u twee fluorochromen); Plakken (z): aantal segmenten in z-as (ex: "1" als er geen beweging in de z-as); Frames (t): aantal beelden opgesplitst per aantal kanalen; Display mode: grijsschaal.
Opmerking: Twee afzonderlijke beeldsequenties worden gegenereerd, corresponderend met de twee kanalen.
- Met Live Acquisitie software, het opzetten van de parameters van de overname met de module "Protocol Editor" (figuur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het experimentele systeem in dit handschrift beschreven is schematisch weergegeven in figuur 1. Getransfecteerde RAW264.7 macrofagen tot expressie brengen van de eiwitten van belang gefuseerd aan een fluorescerend label in aanraking gebracht met IgG-opsonized rode bloedcellen van schapen (SRBC's) die niet-covalent vast waren op het dekglaasje. De macrofagen kan de SRBC los te maken van het dekglaasje om het te overspoelen. De TIRF microscoop gebruikt maakt gelijktijdig verwerven van signalen uit de TIRF oppervlakte die overeenkomt met de uiteinden van de pseudopods en signalen in de epifluorescentie modus na een verschuiving Z 3 urn kiezen.
Het is essentieel om de kritische hoek voor totale interne reflectie fluorescentie bepaald zoals beschreven in figuur 2. Hierdoor wordt een schone TIRF signaal van een 100 nm onder de plasmamembraan. Figuur 3 geeft de ontwikkeling van acquisitiop parameters door middel van een module genaamd "Protocol Editor" is opgenomen in de Live-acquisitie software. Deze module maakt het mogelijk gebruikers te creëren en beheren van workflows voordat zij aan de microscoop, wat het proces zal uitvoeren worden verzonden. Aan het einde van de overname, de gebruiker verzamelt TIFF stroom.
Figuur 4 toont een representatief voor live-cell TIRFM filmpje van een "phagosome sluiting test" in RAW264.7 macrofagen getransfecteerd met het plasmide (bijvoorbeeld Lifeact-mCherry, een soort geschenk van Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parijs, gegenereerd na 17) tegen actine polymerisatie volgen. Macrofagen tijdelijk tot expressie plasmide mochten IgG-SRBC gebonden aan het dekglaasje overspoelen. Aangezien de uiteinden van de pseudopods werden apposed de glazen dekglaasje rond een SRBC, werd een F-actine ring gedetecteerd in het gebied TIRF (bovenpaneel) dat geleidelijk verkleind totdat het gesloten. Parallel, de wazige F-actinesignaal gedetecteerd door epifluorescentie na het verschuiven van de fase 3 urn boven (onderste paneel) overeen met depolymerisatie bij de basis van de fagocytische cup. Na 3 min van de overname werd de SRBC volledig geïnternaliseerd, zoals bevestigd met doorvallend licht (paneel aan de rechterkant).
Daarom kan deze methode worden gebruikt om de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden in de uiteinden van de pseudopods en moleculaire gebeurtenissen aan de voet van de fagocytische cup goed onderscheiden.
Figuur 1. Schematische weergave van de "phagosome Closure Assay" geanalyseerd door TIRFM. De phagosome sluiting assay wordt uitgevoerd gebruikmakend macrofagen tijdelijk één of twee fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie. Macrofagen worden afgezet op IgG-opsonized SRBC's niet-covalent bevestigd aan polylysine coated coverslips. De beelden worden opgenomen in de TIRF modus om de site van phagosome sluiting en in epifluorescentie wijze te detecteren aan de basis van de fagocytische cup te detecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bepaling van de kritische hoek voor TIRFM. (A) Een 'Levende acquisitie "is een cel die fluorescent gemerkte eiwitten in het midden van het veld (regio 1 rood). Met de optie TIRF Stack, werden beelden in één excitatiegolflengte verworven met verschillende hoeken vanaf 0 ° tot 5 °, in stappen van 0,01 ° (gebied 2 in rood). (B) De reeks beelden wordt geopend met ImageJ color Profiler software en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van arEgion van belang (ROI) wordt uitgezet met de functie van de hoeken op de x-as met behulp van "Stacks" en "Plotz as profile" (regio 1 in het rood). (C) De x-positie van de piek van de fluorescentie op het perceel komt overeen met de kritische hoek: 1.98 ° (zwarte stippellijn). Elke waarde onder deze hoek kan worden gebruikt. Als voorbeeld, kan 2,00 ° worden gekozen (rode lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Workflow Process met Live Acquisition Module: "Protocol Editor". (A) In het venster "Protocol Editor", wordt er een workflow canvas gemaakt. (B) Dit protocol bevat een "Loop" van acties die de microscoop het aantal keren dat besloten zal herhalendoor de gebruiker. Als voorbeeld: 750 (1). Één lus opgenomen: "Multi Channels" overname met laser excitatie van fluorescerende eiwitten van belang in TIRF modus. Als voorbeeld: Laser 491 nm intensiteit 50% -TIRF angle 2,00 (2); "Z move" van de doelstelling van 3 micrometer (3); "Multi Channels" acquisitie in epifluorescentie mode (4); "Z move" van het doel terug naar de TIRF regio (5) en een "snapshot" in het uitgezonden licht (6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. F-actine wordt verzameld als een punt op de plaats van phagosome sluiting. Phagosome afsluiting werd uitgevoerd middels RAW264.7 macrofagen transiënt tot expressie plasmide Lifeact-mCherry (een vriendelijke gift van Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Parijs, geproduceerd na 17). Het plasmide is in het signaal TIRF gebied (boven) en epifluorescentie wijze (onder) overgenomen. De rode pijl geeft de actine ophoping in de regio TIRF. Doorgelaten licht image 3 min wordt gepresenteerd, met vermelding van een geïnternaliseerde SRBC. Schaal bar, 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: F-actine wordt verzameld in de Tips van de pseudopods en op de site van phagosome Closure, terwijl het wordt verwijderd uit de basis van de Fagocytische Cup phagosome sluiting test werd uitgevoerd met behulp van RAW264.7 macrofagen tijdelijk tot expressie brengen van het plasmide.. Plasmide beeldvorming TIRF gebied (boven) en epifluorescentie wijze (onder) met de TIRFM uitgevoerd alternatievely elke 50 ms gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
