Introduction
Phagocytosis היא פונקצית תאים עיקרית שמתחילה עם ההכרה ומחייבת של חומר על פני שטח קולטנים, אשר לאחר מכן מוביל ההפנמה השפל של חומר הבליעה. בעוד אאוקריוטים חד תאיים כגון discoideum Dictyostelium עובש אמבות להשתמש phagocytosis האכלה על חיידקים, יצורים עילאיים התפתחו עם תאים מקצועיים. המקרופאגים או תאים דנדריטים הם קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים שונים רקמות ואיברים, והם חיוניים להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית דרך הייצור מצגת אנטיגן ציטוקינים 1-4. בנסיבות מסוימות phagocytosis יכולה להתבצע על ידי תאי phagocytic הלא מקצועיים, למשל, אנדותל ותאי אפיתל. תהליך זה חשוב לשמור על הומאוסטזיס במהלך פיתוח בבגרות עבור מחזור שיפוץ רקמות בריאות. לבסוף, פגוציטים מיוחדים כגון תאי Sertoli ב testis או ברשתיתתאי אפיתל הפיגמנט הם פגוציטים חזקים מאוד 5.
היווצרות של phagosome שבו השפלה של מיקרואורגניזמים או פסולת הסלולר מתרחשת מתחיל עם אשכולות של קולטנים phagocytic על פני השטח של התא phagocytic. אירועים Downstream איתות הבאים אשכולות של קולטנים opsonic כגון קולטנים Fc (FCR) או קולטני משלימים (CRS) כבר מאופיין היטב. עם זאת, ישנם גם רבים קולטנים שאינם opsonic כולל קולטנים דמוי אגרה (TLRs), לקטינים, קולטנים מנוז ואת הקולטנים נבלות. קולטנים אלה מכירים הקובעים על פני החלקיקים כגון שאריות מנוז או פוקוז, phosphatidylserine, ו lipopolysaccharides 1,6-9.
פתוגן או תא פסול הכרה כרוכה קשירה באשכולות של כמה סוגים של קולטן phagocytic, אשר לאחר מכן להוביל שיפוץ יקטין אינטנסיבי וחולף. בשנת exocytosis במקביל, המוקד של תאיים תאייםts תורמת לשחרור מתח הממברנה חשוב phagocytosis יעיל של חלקיקים גדולים. אירועי האיתות המובילים דפורמציה פילמור הקרום תקטין נותחו במודלים ניסיוניים שהפעילו קולטן phagocytic יחיד. במהלך phagocytosis FCR בתיווך, יש פילמור אקטין אינטנסיבי כי מוסדרת GTPases קטן (RAC, Cdc42). בין effectors הזרם שלהם, חלבון התסמונת ויסקוט-אולדריץ '(WASP) מוביל ההפעלה של החלבון-קשור יקטין 2/3 מורכבים (Arp2 / 3) כי nucleates סיבי יקטין 1,2,4,10. הייצור המקומי של phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) הוא חיוני עבור פילמור אקטין הראשוני שמניע היווצרות מדומות. המרה PI (3,4,5) P 3 נדרשה להארכת מדומות ו phagosome סגר 11. מסלולים כמה לתרום היעלמות PI (4,5) P 2. ניתוק הראשי של קינת פוספט phosphatidylinositolSES (PIPKIs) מן PI מעצרים phagosome (4,5) P 2 סינתזה. שנית, זה יכול להיות פוספורילציה ויאכל על פי מעמד ואני PI3K קינאזות (PI3K) והמיר ב PI (3,4,5) P 3 12. תפקיד phosphatases ו phospholipases גם כבר גלום במסחר PI (4,5) הידרוליזה P 2 והסרת F- יקטין במהלך phagocytosis בתאי יונקים וב Dictyostelium 13,14. ה- C פוספוליפאז (PLC) δ hydrolyzes PI (4,5) P 2 לתוך diacylglycerol ופוספט טריס 1,4,5--אינוזיטול. לצרכן (4,5) P 2 ו PI (3,4,5) OCRL phosphatase P 3 (תסמונת oculocerebrorenal של Lowe) גם היה מעורב היווצרות phagosome. היווצרות מקומית מדויקת של F-תקטין depolymerization החברה מוסדרת היטב במרחב ובזמן ואנחנו הראינו גיוס של תאים תאיים חשוב לספק מקומי phosphatase OCRL, ובכך לתרום depolymerization יקטין המקומי בבסיס כוס phagocytic שחקני המנגנון ומולקולריים הנדרשים לסגירת phagosome ו scission הקרום להישאר מוגדרים היטב בגלל קשיי הדמית ניטור באתר של סגירת phagosome. עד לאחרונה, phagocytosis נצפתה על תאים קבוע או לחיות להפנים חלקיקים על פני הגב שלהם או על צדם, מה שהופך את ויזואליזציה בזמן של האתר של סגירת phagosome קשה. בנוסף, שיטות קיבוע יכולות לגרום הכחשה של ממברנות להטות את התוצאות על רחבת pseudopodia וסגירה. לעומת זאת, assay כי הקמנו ולתאר כאן מאפשר לנו לדמיין רחבה מדומות וצעד סגירת phagocytosis בתאים חיים 13, המבוסס על מיקרוסקופיה החזרה הגמורה (TIRFM) 16. טכניקה אופטית זו משתמשת גל חולף לרגש fluorophores באזור דק על הממשק בין שקוף כךהמכסה (coverslip) ו- (תרבית תאים בינוניים) נוזלי. העובי של עומק העירור הוא סביב 100 ננומטר מן המשטח המוצק, המאפשר הדמיה של אירועים מולקולריים קרובים קרום הפלזמה. TIRFM מאפשר יחס אות רקע גבוה, ומגביל את הקרינה מחוץ פוקוס שנאספו ואת cytotoxicity בשל התאורה של תאים. ניצול של TIRFM, פיתחנו את "assay סגירת phagosome" שבה coverslips מופעלים עם ליזין פולי ומצופה אז עם כדוריות דם אדומות-opsonized IgG (IgG-SRBCs). המקרופאגים להביע חלבונים מתויגים fluorescently הזמני של עניין מותרים אז לבלוע את IgG-SRBCs. בעוד תאים לנתק את חלקיקי היעד המאוגדים הלא קוולנטית אל משטח זכוכית, קצות pseudopods ניתן להבחין והקליט במצב TIRF. רכישות TIRF משולבים עם רכישות במצב epifluorescence, לאחר העברת מיקרומטר בשלב 3 לעיל, המאפשר מולualization של בסיס ספל phagocytic. תוספת של תרופות תרופתיות כגון אלה עיכוב תקטין או dynamin במהלך התהליך אפשרית גם לנתח עוד את התהליך ברמה המולקולרית. הפרוטוקול המתואר בפירוט כאן הוא עבור קו תא מקרופאג murine RAW264.7 וחלקיקי opsonized, אבל כמעט, זה יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic אחר ועם מטרות אחרות כגון חרוזים. שיטה זו תאפשר אפיון טוב יותר של הרגולציה בזמן ובמרחב של השחקנים המולקולריים המעורבים רחבים מדומות וסגירת phagosome במהלך תהליכי phagocytic שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פלסמיד המשמש Lifeact-mCherry הוא מתנה סוג של ד"ר גיום Montagnac, Institut קירי, פריז, שנוצר לאחר 17.
1. תאים Transfection
הערה: מקרופאגים RAW264.7 גדלים כדי confluency משנה בינוני שלם (RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640, 10 HEPES מ"מ, פירובט סודיום 1 מ"מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין ו -10% FCS ( סרום עגל עוברי)) בצלחת 100 מ"מימ. הם טרנספקציה עם פלסמידים קידוד החלבונים המתויגים fluorescently ידי electroporation. באופן שגרתי כ 5 - 6 x 10 6 תאים הם transfected עם 20 מיקרוגרם או 10 מיקרוגרם של פלסמיד לכל transfection או-transfection שיתוף בהתאמה. שימו לב אמצעים אחרים של transfection מבוססים על electroporation או lipofection יכולים לשמש גישות חלופיות.
- גרדו את התאים עם מרים תא resuspend אותם 10 מ"ל של מדיום התרבות ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- צנטריפוגהתא ההשעיה XG 300, 5 דקות ב RT ב הרוטור זווית מתנדנד.
- מחממים 10 מ"ל של מדיום מלאה בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס.
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של "חיץ כביסה" מתוך הערכה electroporation.
- צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300, 5 דקות בטמפרטורת החדר ב הרוטור זווית מתנדנד.
- בינתיים מכינים את תערובת DNA בטמפרטורת החדר: 120 μl 2x הצפת B, 20 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד דנ"א לחלבון של עניין, qsp 240 μl H 2 O.
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant כולו.
- Resuspend התא גלולה בתמהיל DNA ולהעביר לתוך cuvettes electroporation 4 מ"מ.
- לדגור על RT במשך 3 דקות.
- Electroporate ב 250 V, 900 μF.
- מיד resuspend התאים מחומם מראש (37 ° C) בינוני מלא בתוספת גנטמיצין ו צלחתמ בצלחת 100 מ"מ.
- דגירת תאי transfected הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- למחרת בבוקר, להחליף את מדיום להשלים עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוסקופית סרום ללא (RPMI 1640 ללא פנול אדום, 10 HEPES מ"מ, 1 פירובט נתרן מ"מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין).
2. Opsonization של תאי דם אדומים
הערה: כמודל של יעד חלקיקים עבור מקרופאגים, תאי דם אדום כבשים (SRBCs) משמשים. בדרך כלל, בסביבות 7 x 10 6 SRBCs לכל 35 מ"מ צלחת זכוכית תחתונה משמש.
- שטפו את SRBCs עם 100 μl של PBS 1x (בופר פוספט) /0.1% BSA (אלבומין בסרום שור) צנטריפוגות (600 XG, 4 דק ').
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 100 μl של 1x PBS / 0.1% BSA ו צנטריפוגות (600 XG, 4 דק ').
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 1x PBS / 0.1% BSA עם ארנב IgG אנטי SRBCsב תת-agglutinating ריכוז. השתמש 500 μl של תמיסה המכילה נוגדן / 5 μl של SRBCs.
הערה: הריכוז תת-agglutinating של נוגדנים תואם את הריכוז הנמוך ביותר שלא לגרום התלכדות זוהתה כמו היווצרות של רשת סלולרית. באופן כללי, ריכוז agglutinating-משנה הוא 8.2 מיקרוגרם / מ"ל.- קבע את הריכוז של IgG אנטי SRBCs נדרש opsonize SRBCs ידי מבחן hemagglutination. סדרתי לדלל את (המניה ב 13.1 מ"ג / מ"ל) אנטי-SRBCs IgG בין 1/50 - 1 / 25,600 בתוך microplate. להוסיף 2 x 10 6 SRBCs בכל טוב. דגירת הצלחת בחושך ב RT במשך כמה שעות.
- לדגור על RT במשך 30 דקות עם סיבוב איטי.
- לאחר שתי שטיפות ב 1x PBS / 0.1% BSA כמתואר לעיל, resuspend SRBCs IgG-opsonized (IgG-SRBCs) במדיום מיקרוסקופיה מחומם מראש סרום ללא (2 מ"ל / צלחת).
ציפוי של Coverslips 3. פולי-ליזין
- בינתיים, לטפל 35 מנות מ"מ זכוכית התחתונה עם 2 מ"ל של פולי- L- ליזין 0.01% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הכלים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
4. קיבוע ללא קוולנטי של SRBCs על מנות תחתיות זכוכית
- יוצקים 2 מ"ל של השעיה SRBCs לכל 35 מ"מ זכוכית צלחת תחתית.
- צנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד ב XG 500 במהלך 2 דקות על 35 מנות תחתיות זכוכית מ"מ.
- הסר את supernatant ולשטוף פעם עם 2 מ"ל של BSA 1x PBS / 10%.
- דגירה חלקיקים למשך 30 דקות עם 2 מ"ל של BSA 1x PBS / 10% לכל צלחת.
- לשטוף את הכלים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
- החלף 1x PBS עם 2 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני מיקרוסקופית סרום ללא.
5. Phagocytosis דמיינו ידי TIRFM
- מִיקרוֹסקוֹפּ
הערה: TIRFM בוצע באמצעות מיקרוסקופ מצויד טבילה אובייקטיבית-שמן (N 100X, NA1.49), תא חימום עם 2 CO, ושני שריםle פוטון איתור מצלמות EMCCD (אלקטרונים והכפילה התקן צמוד) בשילוב עם עדשה 1.5x.- יום לפני הפגישה מיקרוסקופ TIRF, להדליק את תא חימום על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חימום הומוגנית של הבמה מיקרוסקופ.
- קביעת זווית ביקורתית
הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF.- מניחים צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ המכיל opsonized SRBC עם המדיום מיקרוסקופיה סרום ללא מתחת למיקרוסקופ.
- גרדו את התאים resuspend אותם במדיום לפני הוספתם (100 - 500 μl) בצלחת.
- השתמש בתוכנת "Live רכישת" לשלוט מיקרוסקופ ולבצע עירור עם 491 ננומטר ו / או לייזר 561 ננומטר לזהות תאים המבטאים החלבונים המתויגים fluorescently.
- לזהות תא המבטא את החלבונים המתויגים fluorescently.
- מניחים אותו באמצע השדה ולרכוש 500 imהגילאים באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל 0º עד 5º, עם תוספת של 0.01º (איור 2 א). הזוויות משתנות באופן אוטומטי על ידי מערכת מיקרוסקופ.
- קבע את הזווית הקריטית המאפשרת את אור האירוע להשתקף לחלוטין בממשק הזכוכית / בינוני ליצור את הגל החולף. באמצעות תוכנת ImageJ הצבע Profiler, לפתוח את רצף תמונה על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח" ולבחור את הקובץ.
- בחר אזור של (ROI) העניין, עם הכלי המלבני, בתא עם קרינה אחידה (תרשים 2B צהוב 1).
- שרטט את "פרופיל ציר Z" אומר עוצמת הקרינה הנמדדת ההחזר על ההשקעה עם פונקציה של זוויות על ציר x על ידי לחיצה על הלשונית "תמונה", "סטאקס" בתוך התפריט הנפתח "מגרש Z- ציר פרופיל" (תרשים 2B אדום 2).
ההערה: הזווית הקריטית היא הזווית המובילה אל maקרינת ximum לפני ירידה חדה קרינה. - השתמש בכל ערך של זווית על ציר x המעולה לזווית הקריטית במהלך הפגישה במיקרוסקופ כדי לקבל אות TIRF כמו למשל 2.00 (איור 2 ג).
- רכישות
- באמצעות תוכנת רכישה חייה, להגדיר את הפרמטרים של רכישה עם מודול "עורך פרוטוקול" (איור 3 א).
- צור פרוטוקול עם "לולאה" המהווים "ערוצים רבים" רכישה לרכישת אות ניאון מחלבונים של עניין באזור TIRF. הזן את זווית TIRF (למשל 2.00), את זמן החשיפה (עבור msec למשל 50) ואת עוצמת הלייזר (למשל 50%) (איור 3 ב 1).
- הצג "מהלך Z" של מיקרומטר האובייקטיבי 3 מעל אזור TIRF להשיג רכישת אות ב epifluorescence עם כלי "ערוצים רבים". הזן בזווית מתחת tהוא זווית קריטית (כמו למשל 1.00), הזמן של אקספוזיציה (50 msec) ואת עוצמת הלייזר (50%) (איור 3B, 2 ו -3).
- הבא להוסיף "מהלך z" של מיקרומטר האובייקטיבי 3 להלן, לחזור באזור TIRF (איור 3 ב 4). הוספת "תמונת מצב" של התא באור בהיר LED (דיודה פולטת אור) (איור 3 ב 5).
- מצא תא עניין עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מתויג fluorescently היוזם phagocytosis של SRBC על ידי הרחבת קרום הפלזמה סביב החלקיק.
- מניחים אותו באמצע השדה.
- התחל הזרמת רכישת 500 - 1,000 מסגרות. בלשונית "ספירת לולאה", זן "750 מסגרות" (איור 3 ב 1).
הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF. - פתח את התמונות ברצף בתוכנת J תמונה על ידי לחיצה"קובץ", "להרחיב" ובחירת הקובץ.
- הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על הלשונית "התמונה", "Hyperstacks" לתפריט נשלף ועל "חול כדי hyperstack" פונקציה. השלם את החלון הופיע: סדר: xyctz; ערוץ (ג): מספר הערוצים (לשעבר: "2" אם יש לך שני fluorochromes); פרוסות (z): מספר הפרוסות ציר z (לשעבר: "1" אם אין תנועה בציר z-); מסגרות (t): מספר התמונות המחולקות לכל מספר הערוצים; מצב תצוגה: גוונים אפורים.
הערה: שני רצפי תמונות נפרדים נוצרים, מתאים לשני הערוצים השונים.
- באמצעות תוכנת רכישה חייה, להגדיר את הפרמטרים של רכישה עם מודול "עורך פרוטוקול" (איור 3 א).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת הניסוי המתוארת בכתב היד הזה מיוצג סכמטי באיור 1. מקרופאגים טרנספקציה RAW264.7 להביע את החלבונים של עניין התמזג תג פלורסנט ממוקמים במגע עם תאי דם אדום כבשים-opsonized IgG (SRBCs) שהיו בלתי קוולנטית קבוע על coverslip. המקרופאגים יכול לנתק את SRBC מן coverslip לבלוע אותו. המיקרוסקופ TIRF בשימוש מאפשר רכישה קשורה של אותות מאזור TIRF מתאימים קצות pseudopods האותות במצב epifluorescence לאחר משמרת Z 3 מיקרומטר לעיל.
זה חיוני כדי לקבוע את הזווית הקריטית עבור קרינת השתקפות פנימית מוחלטת כמתואר באיור 2. זה מבטיח אות TIRF נקיה מאזור 100 ננומטר מתחת קרום הפלזמה. איור 3 מייצג את הפיתוח של acquisitiעל פרמטרים באמצעות מודול שנקרא "עורך פרוטוקול" כלולה בתוכנת רכישת Live. מודול זה מאפשר למשתמשים ליצור ולנהל תהליכי עבודה לפני שהם נשלחים המיקרוסקופ, אשר יבצעו את התהליך. בסוף הרכישה, המשתמש אוסף זרם TIFF.
איור 4 מראה, סרט נציג לחיות תאים TIRFM של "assay סגירת phagosome" מקרופאגים RAW264.7 טרנספקציה עם פלסמיד (למשל, Lifeact-mCherry, מתנה סוג של ד"ר גיום Montagnac, Institut קירי, פריז, שנוצר לאחר 17) כדי לעקוב אחר פילמור אקטין. המקרופאגים פלסמיד המבטא זמני הורשו לבלוע IgG-SRBCs חייב coverslip. כמו קצות pseudopods היו apposed coverslip הזכוכית סביב אחד SRBC, טבעת F- אקטין זוהה באזור TIRF (הפאנל העליון) כי הצטמצם בהדרגה עד שנסגרה. במקביל, F- אקטין מטושטשתאות זוהה על ידי epifluorescence לאחר הסטת הבמה 3 מיקרומטר מעל (פנל תחתון) תואם depolymerization בבסיס כוס phagocytic. לאחר 3 דקות של הרכישה SRBC הופנמה לחלוטין, כפי שאושרו עם אור מסור (פאנל מימין).
לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי להבחין בין האירועים המולקולריים כראוי המתרחשים בקצות מאוד של pseudopods ואת האירועים המולקולריים המתרחשים בבסיס הכוס phagocytic.
באיור 1. ייצוג סכמטי של "Assay סגירת Phagosome" ונותחו על ידי TIRFM. את assay סגירת phagosome מתבצע באמצעות מקרופאגים זמני להביע fluorescently אחד או שניים-חלבון מתויג. המקרופאגים מופקדים על IgG-opsonized SRBCs קבוע שאינו קוולנטית על בסיס אבן פולי-ליזיןטד coverslips. תמונות נרשמות במצב TIRF כדי לזהות את האתר של סגירת phagosome ונמצאים במצב epifluorescence לזהות את בסיס ספל phagocytic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: קביעת הזווית הקריטית עבור TIRFM. (א) שימוש "רכישה חייה", תא להביע חלבונים מתויגים fluorescently ממוקם באמצע השדה (אזור 1 באדום). עם אפשרות TIRF סטאק, תמונות נרכשו באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל מ 0 ° עד 5 מעלות, עם תוספת של 0.01 ° (אזור 2 באדום). (ב) רצף של תמונות נפתחת באמצעות ImageJ תוכנת Profiler צבע ואת עוצמת הקרינה הממוצעת של aregion של עניין (ROI) הוא זמם עם פונקציה של זוויות על ציר x באמצעות "סטאקס" ו "PlotZ ציר פרופיל" (אזור 1 באדום). (ג) עמדת x של השיא של הקרינה על המגרש מתאים הזווית הקריטית: 1.98 ° (קו מקווקו שחור). ניתן להשתמש בכל ערך לאחר זווית זו. כדוגמא, 2.00 ° יכול להיבחר (קו אדום). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תהליך איור 3. זרימת עבודה באמצעות מודול רכישה חי: "עורך פרוטוקול". (א) בחלון "עורך הפרוטוקול", בד עבודה נוצר. (ב) פרוטוקול זה מהווה "לולאה" של פעולות המיקרוסקופ יחזור על מספר הפעמים החליטעל ידי המשתמש. כדוגמא: 750 (1). לולאה אחת כללה: רכישה "ערוצים רבים" עם עירור ליזר של חלבוני ניאון עניין במצב TIRF. כדוגמה: עוצמת ננומטר 491 לייזר 50% -TIRF זווית 2.00 (2); "מהלך Z" של המטרה 3 מיקרומטר (3); "ערוצים רבים" רכישה במצב epifluorescence (4); "מהלך Z" של המטרה בחזרה לאזור TIRF (5) וכן "צילום" אור המועבר (6). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. יקטין F נצבר כנקודה באתר Phagosome סגירת המעגל. Phagosome assay הסגר בוצעה באמצעות מקרופאגים RAW264.7 זמניים להביע פלסמיד Lifeact-mCherry (מתנת סוג של ד"ר גיום מוntagnac, Institut קירי, פריז, שנוצר לאחר 17). האות פלסמיד נרכשה באזור TIRF (למעלה) במצב epifluorescence (למטה). ראש החץ האדום מצביע על הצטברות אקטין באזור TIRF. תמונת אור המועבר ב -3 דקות מוצגת, מה שמעיד על SRBC הפנים. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1: F- אקטין הוא שנצברו טיפים של Pseudopods ובאתר של סגירת Phagosome, בזמן שהוא מנוקה מבסיס בגביע Phagocytic assay סגירת Phagosome בוצעה באמצעות מקרופאגים RAW264.7 להביע פלסמיד זמני.. הדמיה פלסמיד בתחום TIRF (למעלה) במצב epifluorescence (למטה) באמצעות TIRFM בוצעה חלופיly כל 50 מילי-שניות במהלך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4 mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
