Summary
Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.
Introduction
Все больше доказательств поддерживает существование барьера сетчатки крови (BRB) 1-5 и его сходство с гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) 6,7. Компромисс ГЭБ была тесно связана причинной или в качестве диагностического маркера хронических нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера (AD) 8,9 и острых состояний , таких как делирий 10. Механистические способность проникновения в суть этих патологий и открытий для потенциальных мишеней для лекарственных средств, как правило, затруднено из-за ограниченной доступности и сети запутанности мозга. Такие альтернативы, как визуализации в естественных условиях 11 мозга органотипического культуры 12 первичных культур клеток 13,14 и систем совместного культивирования 15 были сформированы. Тем не менее, большинство из этих моделей требуют специальных инструментов, длинные экспериментальные периоды или несколько маркеров для идентификации клеток. Функциональные и структурные сходства между ГЭБ и BRB, а также корреляция между Dysfunctions из двух уже утверждалось , 16-19. Кроме того, более легкий доступ, хорошо определенные типы клеток и слоистая структура позволили хорошо охарактеризованный сетчатку как окно в мозг. Структурные и функциональные тождества ВВВ и BRB остаются для сравнения в деталях. Тем не менее, патологиями сетчатки глаза, особенно нарушение BRB, также были тесно связаны с прогрессированием различных заболеваний, включая диабет и 21,22 18-19 AD. Таким образом, представляет интерес для создания системы дисфункции BRB не только очертить механизм, но и на экран потенциальных лекарств. В этом докладе, протокол позволяет BRB дисфункции, используя простой острый сетчатке культуры разработан и представлен.
Повышение проницаемости ГЭБ и AD-как патологические изменения были установлены в мозг органотипического культуры инкубировали с гистамином, провоспалительного медиатора 12. Таким образом, в представленной системы, гистамин Applс использованием СВУ культуры сетчатки экс естественных условиях , чтобы побудить BRB дисфункции. Сетчатка из нескольких видов, таких как Mus Musculus и Bos Taurus, были протестированы. Из-за их коммерческой доступности и сходством с человеческой ткани, свежие свиньи глазные яблоки использовались для предоставления данных, представленных здесь. После инкубации с гистамином и / или другими наркотиками, сетчатка были обработаны для оценки иммунным окрашиванием в течение нескольких белков 12, таких как иммуноглобулин G (IgG), один из основных компонентов крови; глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), хорошо известный маркер для глиальных активации; и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), нейрон-специфический белок цитоскелета необходимы для сборки микротрубочек. Кроме того, слоистая структура сетчатки позволяет проводить детальный анализ процессов клеток Мюллера и ганглиозных клеток, такие как изменения в их ширине и непрерывности. Таким образом, несколько дополнительных параметров можно оценить последствия решенияBRB нарушение на ранней стадии и оценить разворотные эффекты потенциальных методов лечения, а также.
В этом протоколе, потенциальные эффекты реверсирование экранированных препаратов оцениваются с трех точек зрения: утечки кровеносных сосудов (БВС), активации клеток глии и живучесть реакции нервных клеток. Существует несколько методов количественного определения используются, например, уровень экспрессии показал интенсивности иммунным, измерения ширины процесса и непрерывность нейрональных процессов, показанных с помощью фильтр улучшения. Для того, чтобы лучше проиллюстрировать метод и помочь интерпретировать результаты, lipoxin А4 (LXA4), соединение эндогенно синтезированный в ответ на воспалительные повреждения и смягчающие эндотелиальной дисфункции 23, был выбран для демонстрационных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы были проведены в соответствии с политикой Institutional Animal Care и использование комитета, где это применимо.
1. Подготовка
- Приготовьте стабилизации среды с 75% Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 25% Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS). Хорошо перемешайте, аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
- Приготовьте фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР) и стерилизуют автоклавированием. Хранить раствор при комнатной температуре. Нагреть PBS до 37 ° С до эксперимента (5 мл на лунку).
- Готовят 10%, 20% и 30% сахарозы в PBS. Фильтр все решения индивидуально более отдельных фильтров 0,22 мкм для стерилизации. Сохраните решения при 4 ° С.
- Подготовьте гистамин маточного раствора в PBS до концентрации 90 мМ. Стерилизовать раствор путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Аликвоты и сохранить раствор при температуре -80 ° С. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания и-.
- Сделать свежий 4% параформальдегида (PFA) в PBS до начала эксперимента. Поместите его на льду.
Внимание: Хранить PFA в вытяжном шкафу и носить соответствующее защитное оборудование. - Разморозить стабилизации среды (20 мл на сетчатке). Добавить пенициллин-стрептомицина до конечной концентрации 100 ед / мл. Теплое часть среды (15 мл на сетчатке) до 37 ° С в инкубаторе до эксперимента. Оставьте остальные среды на льду.
- Поместите HBSS (10 мл на сетчатке) на льду.
2. сетчатке Органотипической Культура
- Передача образцов в капюшоне культуры ткани. Откройте окуляр разрезанием вокруг объектива. Используя щетку, аккуратно удалите стекловидное тело, не вытаскивая на сетчатке. Аккуратно отделить сетчатку от обрезной кромки с помощью кисти, чтобы выставить диск зрительного нерва. Тяжелое зрительного нерва с бритвой и отпустить сетчатку.
- Передача сетчатки глаза в чашку Петри и тщательно промыть сетчатку один раз с использованием холодного HBSS. Поместите образец в HBSS на Iсе. Проанализируйте, как много сетчатку по мере необходимости, повторите шаг 2.1 и этот шаг.
- Обрежьте сетчатку пополам симметрично с бритвой. Аккуратно перенести образцы в 6-луночный планшет с 3 мл стабилизационного сред на лунку. Уравновешивание Разрешить течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
- Подготовьте следующие реагенты при инкубации на шаге 2.3: Развести гистамин маточного раствора до желаемой концентрации (450 мкМ) в теплой среде. Растворите LXA4 (хранится под аргоном) в среде до конечной концентрации 250 нг / мл.
Примечание: При измерении эффекта LXA4, одна половина из одной сетчатки используется для одного только гистамина, в то время как другая половина используется для гистамина с LXA4. - Аспирируйте стабилизации среды тщательно и добавить Готовую среду в каждую лунку (3 мл на лунку). Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
- промойтеОбразцы один раз в теплой, стерильной PBS.
3. Подготовка образцов для Иммуноокрашивание
- Отберите PBS с планшетов. Добавить 4% PFA (3 мл на лунку) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Быстро аспирация PFA. Промыть образцы один раз с помощью PBS. Передача образцов до 10% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение от 2 до 4 ч при 4 ° С.
- Передача образцов до 30% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С. Смешайте одну часть коммерческой среды замораживания с двумя частями 20% сахарозы, чтобы сделать рабочую среду замораживания. Оставьте его при температуре 4 ° С в течение ночи или дольше, пока пузырьки воздуха исчезают.
- Передача образцов в рабочей среде замораживания и достижения равновесия в течение 5 мин при комнатной температуре. Обрежьте каждый сетчатку на прямоугольники (примерно 3 мм и 5 мм).
- Аккуратно перенести образцы в рабочую морозильную сред, содержащихся в цилиндрическом контейнере (около 1 см радиус х 2 см высоты) DevИСЭД из алюминиевой фольги. Убедитесь, что ломтики ретинальные вертикальны (ориентированы, чтобы обеспечить поперечное сечение сетчатки при секционирования) и замораживают их в жидком азоте. Сохранить блоки при -80 ° С до использования.
- Раздел каждый блок на криостата на 14 мкм ломтики толщиной и смонтировать разделы на стеклах. Хранить слайды при температуре -80 ° С до использования.
4. Иммунологическое
- Промыть участки с 5% фосфатного буфера сахарозы (SPB, 5% сахарозы в PBS, рН 7,4) один раз. Блок неспецифические сайты связывания путем инкубации срезов в блокирующем буфере (5% SPB с 10% нормальной козьей сыворотки и 0,5% Тритон Х-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте секций (на слайдах) с соответствующим первичным антителом (GFAP или MAP2, разбавленного в соотношении 1: 500 в блокирующем буфере) в течение 1 ч. Аспирируйте решение. Промыть три раза в 5% SPB. Для окрашивания эндогенного IgG, пропустите этот шаг.
- Инкубируйте разделы с соответствующим SECONритом антитела (Cyanine3 / FITC, конъюгированного с осла против мышиного / анти-IgG кролика, разбавленной в отношении 1: 800 в блокирующем буфере) в течение 1 часа.
- Вымойте участки тщательно с 5% SPB три раза. Подготовка образцов для микроскопии путем установки их в монтажной среде, содержащей DAPI и покрытие покровные.
- С помощью лазера конфокальной микроскопии, захват изображения через объектив 20Х при одинаковых параметрах , таких как интенсивность лазерного, значение усиления, время выдержки и т.д. во всех группах. Установка длины волн возбуждения / излучения для синего канала (для обнаружения DAPI) в качестве 408/447 нм, для красного канала (для обнаружения Cyanine3) в качестве 561/785 нм и для зеленого канала (для обнаружения FITC) в качестве 488/525 нм ,
Анализ 5. Изображение
- Количественно процент вытекающей кровеносных сосудов в соответствии со следующими критериями: 12: Включить только кровеносные сосуды с ядрами эндотелиальных клеток в плоскости сечения в подсчете; рассмотреть дырявое кровеносных сосудов, если он показывает AGRadient иммуноокрашивания окружающих сосуд.
- Для определения уровня экспрессии, выберите интерес областей и измерения среднего значения серого с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Для измерения ширины процесса, выбрать площадь участка, где процессы различны (наружный ядерный слой, ОНЛ, например). Затем выберите оптический поле, где такие процессы являются видимыми и непрерывными. Установите шкалу масштаба в соответствии с микроскопической обстановке, провести линию через процесс и выполнить измерение.
- Для того, чтобы проанализировать непрерывность процесса, выберите области интереса, применить фильтр, называемый дисперсией, которое усиливает края в изображении, заменяя каждый пиксель с его окрестности дисперсии, автоматически регулировать яркость и контрастность, подсчет строк и нормализовать количество самая площадь.
- Расчет статистических значений с помощью т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. псерия результат как среднее ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем недорогой, эффективный по времени и простой в использовании системы для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы защитить против нарушения BRB, вызванного гистамином. IgG , ограничен в сосудах , в контрольной сетчатки (рис 1А), но утечки из кровеносных сосудов при воздействии гистамина (Рисунок 1В), подтверждая , что модель успешно установлено.
LXA4 был выбран, чтобы продемонстрировать скрининг препаратов против BRB нарушения в представленной системе. BRB дисфункция ослабляется при обработке LXA4 (рис 1D), которая не оказывает существенного влияния на себя (рис 1C). Разворот Количественную как процент вытекшего кровеносных сосудов и в результате значительно (рис 1E). Два других типов клеток сетчатки глаза, Müller глиальные клетки (Рисунок 2) и ганглиозные клетки (
Рисунок 1:. Кровь сетчатке Барьерный скомпрометирован на гистамин Exposure и спасена LXA4 Лечение IgG иммунное (красный) представлена от сетчатки , которая была необработанной (A), повреждение индуцированных только гистамина (B), обрабатывают только LXA4 (C ), или подвергаться воздействию как histamине и LXA4 (D). В контроле (А) и LXA4 обрабатывают (С) групп, IgG , ограничен в кровеносных сосудах (БВС) в то время как в группе гистамина (В), IgG , детектируется из купюроприемниками , где она образует облака утечки пунктирными кругами. Дальнейшее добавление LXA4 спасает дисфункцию сосудов (D). Шкала бар, 20 мкм. (Е) Количественное измерение негерметичных купюроприемниками через тестируемых группах. Статистическая значимость определяется т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. Среднее значение ± SEM (n = 18) изображен на графике. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 2:
Рисунок 3: Непрерывность Ганглий клеточных процессов не зависит от LXA4. (А) Иммуноокрашивание против МАР2 представлена от сетчатки , которая была необработанной (А), повреждение индуцированной гистамином только (B) , получавших только LXA4 (С) или подвергают воздействию как гистамин и LXA4 (D). Положительное окрашивание получают в процессах и клеточных тел ганглиозных клеток. Образец изображения map2 окрашивания (Е) вместе с соответствующим фильтром улучшенного изображения (F) представлено. Непрерывные процессы обозначены стрелками. Шкала бар, 20 мкм. (G) Плотность непрерывных MAP2-позитивных процессов ганглиозных клеток из всех групп представлены. Статистическая значимость определяется т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0.05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. Среднее значение ± SEM (n = 18) изображен на графике. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
Histamine | Sigma | H7125-1G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
References
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C.
Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3 (2011). - Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
- Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
- Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
- Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).
- Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
- Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
- Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
- Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
- Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).
- Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188 (2014).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
- Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
- Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
- Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).
- Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
- Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055 (2010).
- Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
- Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
- Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).