急性视网膜模型评估血视网膜屏障违约和潜在的药物治疗

一个低成本，易于使用和强大的制度的建立，以评估可能改善组胺引起血视网膜屏障破坏的潜在治疗。血管渗漏，穆勒细胞活化和神经过程的连续性被用来评估损伤反应及其逆转与潜在的药物，脂氧素A4。

这种离体视网膜模型系统的总体目标是筛选药物，以改善血液神经屏障突破。这种方法可以回答神经退行性疾病领域的几个关键问题，例如早期事件是什么，以及我们如何筛选可以帮助治疗这些患者的药物。这种技术的主要优点是成本低、易于使用、快速且适应性强。

通常，刚接触这种方法的人会很困难，因为获得可靠且可重复的数据取决于生成良好样品的技术技能。这里使用从商业来源获得的第一种猪视网膜。从源头采购后，眼球必须保持在 4 度或冰上，并尽快加工。

在组织培养罩中开始解剖，切开晶状体以打开眼帽。然后用刷子轻轻去除玻璃体，不要拉扯视网膜。使用刷子轻轻地将视网膜从切割边缘分离，以露出视盘。

用剃刀切断视神经并释放视网膜。将视网膜转移到培养皿中，并使用冷 HBSS 小心冲洗视网膜一次。将样品置于冰上的 HBSS 中。

接下来，用剃刀将视网膜对称地切成两半。当需要治疗时，治疗视网膜的一半，而必须处理同一视网膜的另一半以设定基线并校正动物变异。将样品轻轻转移到每孔含有 3 mL 稳定培养基的 6 孔板中。

37 摄氏度的培养箱中平衡视网膜 30 分钟，气氛中含有 5% 二氧化碳。孵育后，小心吸出稳定培养基，并向每个孔中加入 3 毫升含有组胺和 LXA4 的培养基。将样品再孵育一小时。

用温热的无菌 PBS 冲洗后，向每个孔中加入 3 毫升 4% PFA，并在室温下孵育 15 分钟。孵育时间过后，快速吸出 PFA 并用 PBS 冲洗样品一次。向孔中加入 10% 蔗糖，并在 4 摄氏度下孵育 2 至 4 小时。

接下来，用 30% 蔗糖代替 10% 蔗糖，并在 4 摄氏度下孵育过夜。然后将一份商业冷冻培养基与两份 20% 蔗糖混合，制成工作冷冻培养基。在 4 摄氏度下放置过夜或更长时间，直到气泡消失。

第二天，用工作冻存培养基替换 30% 蔗糖，并在室温下平衡 5 分钟。平衡后，将每个视网膜修剪成 3 毫米 x 5 毫米的矩形，然后通过将视网膜切片放入包含在铝箔圆柱体中的冷冻介质中来冷冻视网膜切片。确保视网膜切片是垂直的，以便在切片时提供视网膜的横截面，并将它们在液氮中冷冻。

将低温恒温器上的每个块切成 14 微米的薄片，然后将切片安装在载玻片上。将载玻片储存在零下 80 摄氏度直至使用。通过用 5% 蔗糖磷酸盐缓冲液或 SPB 洗涤切片开始免疫染色。

然后通过在室温下孵育切片和封闭缓冲液 1 小时来封闭非特异性结合位点。接下来，将切片与适当的一抗孵育 1 小时。一小时过后，吸出溶液并在 5% SPB 中洗涤切片 3 次。

然后将切片与相应的二抗一起避光孵育 1 小时。用 5% SPB 洗涤切片 3 次后，将样品安装在含有 DAPI 的培养基中，并用盖玻片覆盖，准备用于显微镜检查的样品。最后，使用共聚焦显微镜捕获图像。

要测量过程的宽度，请使用放大镜工具选择过程正在进行的部分区域，例如外核层。然后选择此类过程可见且连续的光场。单击主菜单中的分析工具，然后单击子菜单上的 set scale （设置比例），以根据微观设置设置比例尺。

在主菜单中选择 line 函数，并在流程中绘制一条线。单击主菜单中的 analyze，然后单击子菜单中的 measure，以执行测量。要分析过程的连续性，请返回主菜单并使用多边形功能选择内部丛状层作为感兴趣区域。

通过单击分析，然后单击测量来测量面积。单击 process， filter 然后 variants，通过用其邻域变体替换每个像素来增强图像中的边缘。然后通过单击自动调整对比度和亮度，单击图像、调整、亮度和对比度，然后单击子菜单中的自动。

然后数行数。在这些图像中，IGG 免疫反应性显示为红色。在对照组中，IGG 限制在血管内。

在组胺组中，从血管中检测到 IGG，在那里它形成由虚线圆圈表示的泄漏云。在 LXA4 处理组中，IGG 再次限制在血管内。进一步添加 LXA4 可挽救组胺诱导的血管功能。

该直方图显示了测试组中渗漏血管的百分比。在这些图像中，显示了对 Muller 细胞进行染色的 GFAP 的免疫染色。在 Muller 细胞、视网膜和血管周围的过程中获得阳性染色。

显示了所有组的 Muller 单元过程的宽度。用组胺或单独使用 LXA4 处理，减少了过程宽度。但是，当两种试剂一起应用时，工艺宽度被挽救了。

在这些图像中，显示了 MAP2 的免疫染色。观察到神经节细胞的过程和细胞体的阳性染色。显示了来自所有组的连续 MAP2 阳性神经节细胞过程的密度。

用组胺治疗会降低树突状过程的连续性，而 LXA4 没有显着影响。一旦掌握，如果作得当，这个实验可以在 3 到 5 天内完成，每个视网膜 5 分钟用于解剖，6 分钟用于治疗，然后是切片、免疫染色和分析。在尝试此程序时，使用新鲜组织和适当的对照很重要。

在此程序之后，可以添加其他方法，例如实时成像，以跟踪钙水平和线粒体特性的实时变化。看完这个视频，你应该对如何使用这种离体急性视网膜培养模型、产生 BRB 功能障碍、评估损伤和筛选潜在药物有一个很好的了解。非常感谢您的观看，祝您的实验一切顺利。