Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Introduction

Umweltbelastungen, insbesondere diejenigen der Nanopartikel (NP) Bereich (1 - 20 nm Durchmesser), haben aufgrund der Fähigkeit zur Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden ^1-3 die Blut - Hirn - Schranke zu überwinden. Erhöhte Exposition gegenüber Verschmutzung kann eine Entzündung im zentralen Nervensystem, den Hypothalamus ¹ induzieren. Ein potentieller Mechanismus , bei dem dies geschieht , durch Nanopartikel induzierte Aktivierung von Mikroglia (brain Immunzellen) ⁴ sein könnte. Frühere Studien haben in - vivo - Modellen verwendet , um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf die Gesundheit des Gehirns zu untersuchen , die zeitaufwendig, teuer, und antworten Sie nicht direkt auf die Frage, wie NPs Mikroglia beeinflussen. Mikroglia spielen eine facettenreiche Rolle im zentralen Nervensystem, einschließlich der Wartung des Gehirns Mikroumgebung und die Kommunikation mit Neuronen über die Freisetzung von sekretierten Faktoren und Zytokine umgibt. In Abhängigkeit von den Stimuli können Mikroglia zu einem M1 pr aktivierbaro-entzündliche oder M2 anti-inflammatorische Zustand. Beispielsweise Aktiv M1 lösen Mikroglia proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), während M2 Mikroglia Freisetzung anti-inflammatorische Zytokine einschließlich Interleukin-4 (IL-4) aktiviert. Um unsere Leihmutter in - vitro - Biosensor zur Bestimmung von Neurotoxizität von Luftschadstoffen zu validieren, wir gemessen Mikroglia Reaktion auf 20 nm Silber - Nanopartikel (AGNPS). Das Ziel dieses Artikels ist es zu beschreiben , wie ein in - vitro - Mikroglia - Zelllinie kann zum Testen murine Mikroglia Reaktion auf NPs und wie Mikrogliaaktivierung wirkt Hypothalamus Zellen als Ersatz Biosensor Marker verwendet werden. Die langfristige beabsichtigte Anwendung dieser validierten Modelleffekte aus der realen Welt Schadstoffen auf die Gesundheit des Gehirns und neurodegenerative Krankheit zu prüfen ist. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-Well - Format - Assay für die im Anschluss an die Belichtung von mic Mikroglia - Aktivierung und hypothalamischen Zellüberlebensmess roglial konditionierten Medien.

Mikrogliaaktivierung wurde nach AgNP Exposition bestimmt einen TNF-α Enzym Linked Immuno Assay (ELISA). Um die Wirkung von aktivierter Mikroglia auf Hypothalamus-Zellen zu bestimmen, wurden die AGNPS von Mikroglia-Überstand (konditioniertes Medium) unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung entfernt. Die Filtervorrichtung behält während Zytokine die AGNPS ohne basierend auf Größe. Kurz gesagt, Überstand aus mit oder ohne AGNPS behandelt Mikroglia wurde zu den Filtern gesammelt, zugegeben und bei 14000 × g für 15 min zentrifugiert. Wir waren dann in der Lage, den Einfluss von Mikroglia-Zytokine auf Hypothalamus die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Zelltoxizität zu konditionierten Medien (enthaltend Zytokine) nach der Belichtung wurde mittels eines Resazurin-basierten Assay bestimmt , wie zuvor beschrieben , ^5,6. Metabolisch aktive Zellen reduzieren Resazurin und ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen ⁷ herzustellen.

nt "> Es gibt mehrere Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen (zB Co-Kultur, trans-well - Setups oder in vivo - Experimente). Unser Modell die Fähigkeit Mikroglia direkt aktivieren liefert und festzustellen , ob sekretierten Faktoren Neuronen ⁸ toxisch sind . der aktuelle Protokoll verwendet immortalisierten BV2 Mikroglia mit 20 nm Durchmesser Nanopartikel stimuliert und immortalisierten murinen Hypothalamuszellen (mHypo-A1 / 2 bezeichnet) ⁹ zur Bestimmung der anschließenden Reaktion. Während dieses Protokoll für diese besonderen Bedingungen optimiert worden ist, können die Verfahren sein , verändert in anderen Modellen der Mikroglia-induzierten Zelltod verwendet werden, oder mit anderen Zelltypen, einschließlich primärer Mikroglia und Neuronen.

Protocol

1. Mikroglia Zellkultur Wartung

1. Warm Zellkulturmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin (PSN) bis 37 ° C.
2. Erhalten Sie gefrorene Lager von BV2 Mikroglia-Zellen bei Passage 18 - 25 von Lagerung bei -80 ° C. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C warmen Wasserbad.
3. Sanft Zellen auf eine 75 cm ² innen belüfteten Kolben übertragen Kulturmedien , die 10 ml - Zelle.
4. Inkubieren Kolben in 5% CO ₂ bei 37 ° C. Absaugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen Sie sie durch frische Medien. Wachsen Zellen bis etwa 70 bis 80% Konfluenz.

2. Zählen und Plating Cells

1. In einem 37 ° C Wasserbad, warm DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung.
2. Absaugen Medien von Zellen und 500 ul Trypsin hinzuzufügen. 5 min - für 2 bei 37 ° C inkubieren.
3. Verwendung eines Schabers, entfernen Zellen aus dem Kolben und suspendieren in 5 mlDMEM. Passieren Zellen durch ein 70 um-Sieb in ein 50 ml-Röhrchen dreimal.
4. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 8000 Zellen / Vertiefung in einem schwarzen walled klare Bodenplatte in einem Gesamtvolumen von 200 & mgr; l DMEM, das mit 10% FBS und 1% PSN. Inkubieren Platte in 5% CO ₂ bei 37 ° C für 24 Std.
5. Entfernen Sie alte DMEM und ersetzen mit 200 ul erwärmt DMEM mit 1% PSN ergänzt Serum Mikroglia verhungern. Inkubieren Platte in 5% CO ₂ bei 37 ° C für 24 Std.

3. Aktivieren Mikroglia

1. In getrennten Röhrchen, verdünnter AGNPS (0,01, 0,05 oder 0,1 & mgr; g / ml) und Fahrzeug / Neutralsteuerung (Natriumcitrat, 0,04 mM) in serumfreien DMEM, ergänzt mit 1% PSN der endgültigen Arbeitskonzentrationen.
2. Entfernen 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen mit 100 ul geeigneten Behandlungsverbindung.
3. Inkubieren Platte in 5% CO ₂ bei 37 ° C für 24 Std.

4. Filter Anlage Medien

1. Sammle 200 ul Medien Überstand aus jeder Vertiefung und Überführung in einen Filter (Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa) mit Sammelröhrchen (1,5 bis 2 ml Kapazität).
2. Zentrifuge bei 14.000 xg bei Raumtemperatur für 15 min.
3. Verwerfen Sie den Durchfluss durch (Überstand mit Partikeln) und legen Sie den Filter Kopf nach unten in eine neue Sammelröhrchen.
4. Zentrifuge bei 1000 xg bei Raumtemperatur für 2 min.
   HINWEIS: Die sich ergebende gefilterte Medium (enthaltend sekretierten Zytokine) durch sechsfach konzentriert.
5. Bringen Sie das Volumen des Konzentrats zu 400 & mgr; l mit frischem DMEM, das mit 10% FBS und 1% PSN und auf Eis lagern.
   ANMERKUNG: Um sicherzustellen Rest AGNPS aus gefilterten Medien entfernt werden, erzeugen eine AgNP Konzentration basierend auf der charakteristischen Peak bei etwa 390 bis 420 nm ^10. Kurz gesagt, bereiten Aliquots von ungefilterten AGNPS und filtriert (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 & mgr; g / ml in Schritt 3.1 beschrieben)Fahrzeugsteuerung (Natriumcitrat, 0,04 mM) in serumfreiem DMEM. Aliquot 50 ul gefilterten Proben und Standards in einem schwarzen walled klare Bodenplatte. Mit einem Spektralphotometer messen Absorption bei 390-410 nm und vergleichen Messwerte zum AgNP Konzentrationskurve. Wenn gefilterten Abtastproben den gleichen Absorptionswert als Fahrzeugkontrollprobe haben, kann es Rest AGNPS entfernt angenommen werden.
6. Verwenden Hälfte der gefilterten Medien TNF-α Sekretion folgenden Anweisungen von einem im Handel erhältlichen Kits zu bestimmen.

5. Hypothalamus Cell Culture Wartung

1. Warmen DMEM Zellkulturmedium mit 10% FBS und 1% PSN auf 37 ° C ergänzt.
2. Erhalten Sie gefrorene Lager von Hypothalamus (mHypo-A1 / 2) Zellen bei Passage 18 - 25 bei 80 ° C gelagert. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C warmen Wasserbad.
3. Sanft Zellen auf eine 75 cm ² innen belüfteten Kolben übertragen Kulturmedien , die 10 ml - Zelle.
4. Inkubieren Kolben in 5% CO ₂

6. Bestimmung des Hypothalamus Zelltoxizität

1. Warm DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad.
2. Absaugen Medien von Hypothalamus-Zellen und 500 ul Trypsin hinzuzufügen. 5 min - für 2 bei 37 ° C inkubieren. Entfernen Zellen aus Kolben mit einem Schaber, wie oben in Schritt 2 beschrieben.
3. Zählen von Zellen eine Zählkammer und Hypothalamus Zellen bei 5.000 Zellen / Well in einem schwarzen walled klare Bodenplatte in einem Gesamtvolumen von 200 & mgr; l DMEM , das mit 10% FBS und 1% PSN und Inkubation über Nacht in 5% CO ₂ bei 37 ° C - Platte .
4. Entfernen 100 ul alten Medien einen mehrkanaligen Pipettierer mit und fügen 100 ul gefiltert konzentriert konditionierten Medien, bis zu einer endgültigen Konzentration von 1x.
5. Inkubieren Platte in 5% CO ₂ bei 37 ° C für 24 Std.
6. In 221; l Resazurin Reagenz und Platte für 20 min in 5% CO ₂ bei 37 ° C inkubieren.
7. Mit Hilfe eines Multimode-Spektrophotometer, Rekord-Fluoreszenz (560 nm EX / 590 nm EM) die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Bericht Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU).

Representative Results

Wir zeigen, dass Mikroglia Funktion als Surrogat Biosensor für Gehirn Reaktion auf Nanopartikel das Protokoll oben. Die Ergebnisse umfassen die Messung der toxischen Wirkungen von Mikroglia - Aktivierung auf nachgeschaltete neuronalem Zelltod. 1 ein Arbeitsablauf des Protokolls Mikroglia zu aktivieren und zu bestimmen , ob sekretierten Zytokine reduzieren Lebensfähigkeit von hypothalamischen Neuronen demonstriert. TNF-α - Sekretion wurde nach AgNP Exposition (Abbildung 2) signifikant erhöht. Wenn hypothalamischen Neuronen konditioniertes Medium aus AgNP-aktivierte Mikroglia ausgesetzt sind, wird die Lebensfähigkeit der Zellen wesentlich reduziert (Figur 3) dar. 4 das Potential Mechanismus beschreibt , in dem AGNPS Mikroglia und tragen zur Hypothalamus Zelltod aktivieren.

Zahl1. Workflow zur AgNP Filtrationsverfahren. Der Überstand von aktivierten Mikrogliazellen an Filtrationsvorrichtungen hinzugefügt und zentrifugiert AGNPS von Medien zu entfernen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. TNF-α - Sekretion erhöht Nach AgNP Belichtung. Microglial BV2 Zellen mit Fahrzeugsteuerung oder AGNPS für 2 Stunden behandelt wurden. TNF-α-Sekretion wurde nach Exposition gegenüber AGNPS signifikant erhöht. Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. ** p <0,001 vs. Kontrolle durch den Student-ungepaarten t - Test bewertet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Hypothalamus Zellviabilität Nach Microglial Anlage Medien Exposition reduziert. Hypothalamus Zellen zeigen erhöhte Zelltod konditionierten Medien nach der Exposition von Mikroglia mit AgNP stimuliert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. * P <0,05 vs. Kontrolle durch den Student-ungepaarten t - Test bewertet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Mögliche Pathway von AgNP Induced Mikrogliaaktivierung und Einfluss auf die Hypothalamus - Neurotoxizität. Nach der Belichtung zu Silber - Nanopartikeln, microglia werden einem M1 proinflammatorischen Zustand aktiviert, durch erhöhte Sekretion und Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen und Hersteller gekennzeichnet. Die Freigabe der pro-inflammatorischen Zytokinen und Entscheidungsträger trägt den neuronalen Zelltod zu umgeben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2)	Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy)	ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal bovine serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Silver nanoparticles (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4391
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	S4641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices	M5
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Corning, Inc	14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm	Corning, Inc	08-771-2
Tabletop centrifuge 5430	Eppendorf	22620560