Mikroglia som en surrogat Biosensor att bestämma nanopartiklar Neuro

Introduction

Miljöföroreningar, särskilt de av nanopartikeln (NP) intervall (1-20 nm i diameter), har varit kopplade till fetma och andra neurodegenerativa sjukdomar på grund av förmågan att passera blod-hjärnbarriären ^1-3. Förhöjda exponering för föroreningar kan framkalla inflammation i det centrala nervsystemet, inklusive hypotalamus ^en. En möjlig mekanism i vilken detta sker kan ske genom nanopartiklar inducerad aktivering av mikroglia (hjärnimmunceller) ^4. Tidigare studier har använt in vivo modeller för att studera effekterna av NPS om hjärnans hälsa som är tidskrävande, dyrt, och inte direkt svara på frågan om hur NP påverka mikroglia. Mikroglia spelar en mångfasetterad roll i det centrala nervsystemet, inklusive underhåll av hjärnan mikro och kommunicerar med omgivande nervceller via frisättning av utsöndrade faktorer och cytokiner. Beroende på stimuli, kan mikroglia aktiveras till en M1 pro-inflammatoriska eller en M2 anti-inflammatoriskt tillstånd. Till exempel, M1 aktiverade mikroglia frisätta proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), medan M2 aktiverade mikroglia frisättning antiinflammatoriska cytokiner inkluderande interleukin-4 (IL-4). För att validera vår surrogat in vitro biosensor för bestämning av neuro av luftföroreningar, mätte vi microglial svar på 20 nm silvernanopartiklar (AgNPs). Målet med denna artikel är att beskriva hur ett in vitro microglial cellinje kan användas som en surrogatmarkör biosensor för att testa mus microglial svar på NP och hur microglial aktivering påverkar hypotalamus celler. Den långsiktiga avsedd tillämpning av denna validerad modell är att testa effekterna av verkliga föroreningar på hjärnans hälsa och neurodegenerativa sjukdomar. Vi tillhandahåller en detaljerad beskrivning av en analys in vitro 96-brunnsformat för mätning microglial aktivering och hypotalamus cellöverlevnad efter exponeringen av mic roglial konditionerade mediet.

Microglial aktivering bestämdes efter AgNP exponering med användning av en TNF-α enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA). För att bestämma effekten av aktiverat mikroglia på hypotalamiska celler, de AgNPs avlägsnas från microglial supernatanten (konditionerat medium) med användning av en filtreringsanordning. Filtreringsanordningen behåller cytokiner samtidigt utesluta AgNPs baserat på storlek. I korthet sattes supernatanten från mikroglia som behandlats med eller utan AgNPs uppsamlades, sattes till filtren, och centrifugerades vid 14000 x g i 15 min. Vi kunde sedan bestämma påverkan av mikroglia utsöndrade cytokiner på hypotalamus cellviabilitet. Celltoxicitet efter exponering för konditionerat medium (innehållande cytokiner) bestämdes via en resazurin baserad analys som tidigare beskrivits ^5,6. Metaboliskt aktiva celler reducerar resazurin och producera en fluorescerande signal som är proportionell mot antalet viabla celler ^7.

nt "> Det finns flera fördelar med att använda denna teknik framför andra (t.ex. co-kultur, trans-och uppställningar, eller in vivo). Vår modell ger möjlighet att direkt aktivera mikroglia och avgöra om utsöndrade faktorer är giftiga för nervceller ⁸ . Den nuvarande protokollet använder odödlig BV2 mikroglia stimuleras med nanopartiklar 20 nm i diameter, och odödlig murina hypotalamus celler (betecknade mHypo-A1 / 2) ⁹ för bestämning av efterföljande svar. Även om detta protokoll har optimerats för dessa särskilda villkor, metoderna kan vara ändrats för att användas i andra modeller av microglial celldöd, eller med andra celltyper, inklusive primär mikroglia och nervceller.

Protocol

1. mikrogliaceller Cell Culture Underhåll

1. Varmt cellodlingsmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium; DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin / neomycin (PSN) till 37 ° C.
2. Skaffa frysta lager av BV2 mikrogliaceller vid passage 18-25 från lagring vid -80 ° C. Snabbt tina celler i 37 ° C vattenbad.
3. Överföra försiktigt celler till en 75 cm ² ventilerade kolv innehållande 10 ml cellodlingsmedia.
4. Inkubera kolven i 5% _CO2 vid 37 ° C. Aspirera media efter 24 timmar och ersätta med färska medier. Odla celler tills cirka 70 - 80% konfluens.

2. Räkning och plätering celler

1. I ett 37 ° C vattenbad, varmt DMEM och 1x-trypsin-EDTA-lösning.
2. Aspirera media från celler och tillsätt 500 pl trypsin. Inkubera vid 37 ° C under 2-5 min.
3. Med användning av en skrapa, avlägsna celler från kolven och suspendera i 5 mlDMEM. Passera celler genom en 70 | j, m sil i ett 50 ml rör tre gånger.
4. Räkna celler med användning av en hemocytometer och utsäde 8000 celler / brunn i en svart walled tydlig bottenplatta i en slutlig volym av 200 ^ il DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% PSN. Inkubera plattan i 5% _CO2 vid 37 ° C under 24 h.
5. Ta bort gamla DMEM och ersätt med 200 pl värmde DMEM kompletterat med 1% PSN till serum svälta mikroglia. Inkubera plattan i 5% _CO2 vid 37 ° C under 24 h.

3. Aktivera Mikroglia

1. I separata rör, utspädd AgNPs (0,01, 0,05 eller 0,1 | j, g / ml) och vehikel / neutral kontroll (natriumcitrat, 0,04 mM) i serumfritt DMEM kompletterat med 1% PSN till slutliga arbetskoncentrationer.
2. Ta bort 100 pl av media från varje brunn och ersätta med 100 pl av lämplig behandling förening.
3. Inkubera plattan i 5% _CO2 vid 37 ° C under 24 h.

4. Filtering Conditioned Media

1. Samla in 200 | il media supernatanten från varje brunn och överför till ett filter (molekylviktsgräns av 10 kDa) med uppsamlingsröret (1,5-2 ml kapacitet).
2. Centrifugera vid 14.000 xg vid rumstemperatur i 15 min.
3. Kassera genomströmning (supernatant med partiklar) och placera filter upp och ned in i ett nytt provrör.
4. Centrifugera vid 1000 x g vid rumstemperatur under 2 min.
   OBS: Den resulterande filtrerade medier (innehållande utsöndrade cytokiner) koncentreras med sex gånger.
5. Bringa volymen av koncentratet till 400 | j, l med färsk DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% PSN och förvara på is.
   OBS: För att säkerställa rest AgNPs avlägsnas från filtrerade medier, generera en AgNP koncentration baserad på den karakteristiska topp vid ca 390-420 nm ^10. Kortfattat, förbereda alikvoter av ofiltrerade AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 och 0,2 | j, g / ml såsom beskrivs i steg 3,1) och filtreradesvehikelkontroll (natriumcitrat, 0,04 mM) i serumfritt DMEM. Alikvotera 50 il filtrerade prover och standarder i en svart väggar tydlig bottenplatta. Med hjälp av en spektrofotometer, mäta absorbansen vid 390-410 nm och jämföra avläsningarna till koncentrationskurvan AgNP. Om filtrerade prover har samma absorbansvärde som prov vehikelkontroll, kan det antas rest AgNPs avlägsnas.
6. Använd hälften av de filtrerade medier för att bestämma TNF-α sekre följande instruktioner från ett kommersiellt tillgängligt kit.

5. Hypotalamisk Cell Culture Underhåll

1. Varm DMEM cellodlingsmedium kompletterat med 10% FBS och 1% PSN till 37 ° C.
2. Skaffa frysta lager av hypotalamus (mHypo-A1 / 2) celler vid passage 18-25 lagrade vid 80 ° C. Snabbt tina celler i 37 ° C vattenbad.
3. Överföra försiktigt celler till en 75 cm ² ventilerade kolv innehållande 10 ml cellodlingsmedia.
4. Inkubera kolven i 5% _CO2

6. Fastställande hypotalamus celltoxicitet

1. Varm DMEM och 1x-trypsin-EDTA-lösning i en 37 ° C vattenbad.
2. Aspirera media från hypothalamus celler och tillsätt 500 pl trypsin. Inkubera vid 37 ° C under 2-5 min. Ta bort celler från kolv med hjälp av en skrapa som beskrivits ovan i steg två.
3. Räkna celler med användning av en hemocytometer och plattan hypotalamiska celler vid 5000 celler / brunn i en svart walled tydlig bottenplatta i en slutlig volym av 200 ^ il DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% PSN och inkubera över natten i 5% _CO2 vid 37 ° C .
4. Ta bort 100 pl gamla medier med hjälp av en flerkanalig pipett och tillsätt 100 pl filtrerade koncentrerade konditionerade mediet, till en slutlig koncentration av 1x.
5. Inkubera plattan i 5% _CO2 vid 37 ° C under 24 h.
6. lägg 221; l av resazurin reagens och inkubera plattan under 20 min i 5% _CO2 vid 37 ° C.
7. Med hjälp av en multi spektrofotometer, spela in fluorescens (560 nm EX / 590 nm EM) för att mäta cellviabiliteten. Rapportera resultat som relativa fluorescensenheter (RFU).

Representative Results

Vi visar att mikroglia fungera som en surrogat biosensor för hjärnans reaktion på nanopartiklar med hjälp av protokollet ovan. Våra resultat inkluderar mätning av de toxiska effekterna av microglial aktivering på nedströms neuronal celldöd. Figur 1 visar ett arbetsflöde av protokollet för att aktivera mikroglia och avgöra om utsöndrade cytokiner minskar livskraft hypotalamus neuroner. TNF-α sekre ökade signifikant efter AgNP exponering (Figur 2). När hypotalamiska neuroner exponeras för konditionerade media från AgNP-aktiverade mikroglia, är cellviabiliteten signifikant reducerad (figur 3). Figur 4 beskrivs den potentiella mekanismen där AgNPs aktiverar mikroglia och bidra till hypotalamus celldöd.

Figur1. Arbetsflöde för AgNP filtreringsmetod. Supernatant från aktiverade mikroglia tillsätts filtreringsanordningar och centrifugeras för att avlägsna AgNPs från media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. TNF-α Utsöndring ökas Efter AgNP Exponering. Mikrogliaceller BV2 celler behandlades med vehikelkontroll eller AgNPs för 2 h. TNF-α sekre ökade signifikant efter exponering för AgNPs. Data presenteras som medelvärde ± SEM. ** p <0,001 jämfört med kontroll som bedömts av Students oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Hypotalamisk cellviabiliteten reduceras efter mikrogliaceller konditionerade medieexponering. Hypotalamus celler visar ökad celldöd efter exponering för konditionerade media från mikroglia stimulerade med AgNP. Data presenteras som medelvärde ± SEM. * P <0,05 jämfört med kontroll som bedömts av Students oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Potentiell Banan av AgNP inducerad mikroglia aktivering och Inflytande på hypotalamus Neuro. Efter exponering för silvernanopartiklar, mikrogramlia aktiveras för att en M1 pro-inflammatoriskt tillstånd, som kännetecknas av ökad sekretion och expression av pro-inflammatoriska cytokiner och bryggare. Frigörandet av proinflammatoriska cytokiner och beslutsfattare bidrar till omgivande neuronal celldöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2)	Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy)	ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal bovine serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Silver nanoparticles (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4391
Sodium Citrate	Sigma-Aldrich	S4641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices	M5
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Corning, Inc	14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm	Corning, Inc	08-771-2
Tabletop centrifuge 5430	Eppendorf	22620560