Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

hyperpolariserad Published: December 30, 2016 doi: 10.3791/54751
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 1, 1,2, 1, 3,4, 1,5,6, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Nuclear Medicine, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Chemistry, Technische Universität München, 3GE Global Research, 4Zentralinstitut für Medizintechnik der Technischen Universität München (IMETUM), Technische Universität München, 5Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 6IDG Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München
* These authors contributed equally

Abstract

Under de senaste decennierna har nya metoder för tumörstadieindelning, restaging, behandlingssvar övervakning och återkommande detektering av en mängd olika cancerformer uppstått i samband med state-of-the-art positronemissionstomografi med 18 F-fluordeoxiglukos ([18 F ] -FDG PET). 13 C magnetisk resonans-spektroskopisk avbildning (13 CMRSI) är en minimalt invasiv avbildningsmetod som möjliggör övervakning av metabolism in vivo och i realtid. Som med någon annan metod baserad på 13 C-kärnmagnetisk resonans (NMR), står den inför utmaningen att låg termisk polarisering och en efterföljande låg signal-till-brusförhållande på grund av den relativt låga gyromagnetiska förhållande av 13 C och dess låga naturliga förekomst i biologiska prover. Genom att övervinna dessa begränsningar, har dynamisk kärn polarisering (DNP) med efterföljande provupplösning nyligen aktiverade vanligt förekommande NMR och magnetisk resonanstomografi (MRT) system för att mäta, Studera, och bild viktiga metaboliska vägar i olika biologiska system. Ett särskilt intressant och lovande molekyl som används i 13 CMRSI är [1- 13 C] pyruvat, som under de senaste tio åren, har använts i stor utsträckning för in vitro, preklinisk och, mer nyligen, kliniska studier för att undersöka den cellulära energiomsättningen i cancer och andra sjukdomar. I den här artikeln, vi beskriva tekniken upplösnings DNP att använda en 3,35 T preklinisk DNP hyperpolariserings och visa dess användning i in vitro-studier. Ett liknande protokoll för hyperpolarisering kan tillämpas för det mesta i in vivo-studier också. För att göra detta använde vi laktatdehydrogenas (LDH) och katalyserade den metaboliska reaktionen av [1- 13 C] pyruvat till [1- 13 C] laktat i en prostatakarcinom cellinje, PC3, in vitro med hjälp av 13 CMRSI.

Introduction

För närvarande är den mest använda kliniska metoden för tumörstadieindelning, restaging, behandlingssvar övervakning och återkommande detektering av en mängd olika cancerformer [18 F] -FDG PET. 1 Men nyligen, flera nya och alternativa metoder har dykt upp. En av dessa metoder är 13 CMRSI. Denna teknik innefattar införandet av den 13 C-molekylen i ett biologiskt prov, följt av minimalt invasiv MRI för att bedöma metabolism in vitro eller in vivo i realtid. Icke desto mindre, den största utmaningen i 13 CMRSI, jämfört med de andra förfaranden, såsom [18 F] -FDG PET eller datortomografi, är dess låga signal-till-brus-förhållande.

NMR-signalen är direkt proportionell mot graden av polarisering, ett förhållande mellan dragning ½ kärnor befolknings skillnad i två energitillstånd till den totala befolkningen (Figur 1A). Polariseringen är en produkt av the gyromagnetiska förhållandet (γ) av kärnorna och det pålagda magnetiska fältstyrkan över temperaturen. En typisk polarisering av 1 H kärnor är i storleksordningen av 0,001% till 0,005% vid 3 T, vilket ger en relativt dålig signal-till-brus-förhållande. Dagens state-of-the-art MRI har varit en framgångsrik avbildningsmetod bara på grund av den höga förekomsten av ett H i biologiska prover och den höga gyromagnetiska förhållandet 1 H (y 1H = 42,576 MHz / T). Men observera andra kärnor, såsom kol, är mer krävande. Den enda stabila, magnetiskt aktivt kol isotop, 13 C, utgör endast 1,1% av alla kolatomer. Dessutom är det gyromagnetiska förhållandet av 13 C (γ 13C = 10,705 MHz / T) fyra gånger lägre än den för en H, vilket leder till en lägre detekteringseffektiviteten. Sammanfattningsvis, låg 13C överflöd och låg γ 13C orsaka bränn mätningar 13 C för att uppnå 0,0176% av känsligheten hos en 1^ H-NMR-mätning in vivo.

Dynamisk Nuclear Polarization

En metod för att övervinna den relativt dålig känslighet av 13 C mätningar är DNP. Det beskrevs ursprungligen för metaller 1953 av Albert W. Overhauser. I sin artikel, konstaterade han: "Det är visat att om elektronspinnresonans av ledningselektroner är mättad, kommer kärnan polariseras i samma utsträckning som de skulle vara om deras gyromagnetiska förhållandet var det av elektronens spinn." 2 Senare det året, Carver och Slichter bekräftade experimentellt Overhauser hypotes 3. År 1958, Abragam och Proctor beskrev denna effekt för elektroner i vätskor och namngav den "fasta effekt." Vid temperaturer under 4 K når elektron spinpolarisationen nästan 100% och är mer än tre tiopotenser högre än kärn spinpolarisationen (Figur 1B) 4. Thans beror på gyromagnetiska förhållandet mellan elektronen (γ e = 28024,944 MHz / T) är tre tiopotenser högre än kärngyromagnetisk kvot. De svaga växelverkan mellan elektroner och atomkärnor, såsom Overhauser effekten, den fasta effekten, den korsvisa effekten och den termiska blandningseffekt, möjliggör överföring av polarisering från elektron snurrar till kärnspinn med hjälp av mikrovågsstrålning med en frekvens nära den motsvarande elektron paramagnetisk resonans (EPR) frekvens 5,6. DNP teori har vidareutvecklats för att involvera fler elektroner och termisk blandning. Ändå hittills ingen enhetlig kvantitativ teoretisk beskrivning av DNP har publicerats 7,8.

Figur 1
Figur 1: Förstå Dynamic Nuclear polarisation och hyperpolarisation. A) En schematisk jämförelse av spinnpopulationeni termisk jämvikt polarisationstillståndet och den hyperpolariserade tillstånd. B) Polarisationen är beroende av temperaturen. Polariseringen av en elektron (e -) når 100% under 1,4 K. DNP tillåter överföring av polarisationen från e till 13 C kärnorna, vilket ökar deras polarisation upp till 10 5-faldig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Att införa DNP i studier av biologiska system med 13C NMR, hade efterföljande snabb provupplösning utvecklas. 50 år efter Overhauser hypotes, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. löst tekniskt utmanande frågan om att föra den hyperpolariserade frusna provet i flytande tillstånd med minimal hyperpolarisation -6. Upplösning DNP öppnat ett nytt forskningsområde som kallas 13 CMRJag ger en ny metod för att undersöka och karakterisera olika sjukdomstillstånd 9,10. Som stabila bärare av en oparade elektron, en trityl radikal tris (8-karboxi-2,2,6,6-tetra (hydroxietyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -metyl-natriumsalt (OX063) eller (2,2,6,6-tetrametylpiperidin-1-yl) oxyl (TEMPO) används vanligen. Dessa blandas med den önskade 13 C-märkta molekylen och exponerades för mikrovågsstrålning med en frekvens nära den motsvarande EPR frekvens. Med denna teknik, kan ökas polarisationen av 13 C-kärnor upp till 37% 11. Detta resulterar i en 10 5-faldig polarisation förbättring jämfört med den termiska jämvikts polarisation 11,12. Men så snart som mikrovågsbestrålningen stoppas och / eller 13 C-molekyl överförs till flytande tillstånd, sönderfaller polarisationen med den longitudinella relaxationstiden (T 1) i 13 C kärna som polariserades. DärförUppfinningen snabb upplösning teknik eller någon efterföljande teknik förkorta tiden före experimentell mätning (dvs injektion) är avgörande för biologiska tillämpningar 13.

Det finns tre viktiga krav som kandidatmolekylen måste uppfylla för framgångsrika 13 CMRSI studier. Först den 13 C kärnan av intresse måste ha en tillräckligt lång T 1 (> 10 s). Valet av den 13 C-etikett är avgörande. Den bästa kandidaten kärnor kol utan direktkontakt med 1 H-kärnor via en bindning. Den måste också snabbt metaboliseras inom 2-3 T 1 gånger, vilket resulterar i en nedströms metabolisk produkt med en betydligt annorlunda kemisk förskjutning från den ursprungliga substansen. Provblandningen måste också bilda ett amorft glas när den är i ett fast tillstånd, så att den rumsliga fördelningen minskar avståndet mellan elektronen och 13 C, vilket gör att transföring av polarisation. Om kandidatmolekylen inte bildar amorft glas naturligt måste det vara i hög grad lösliga i en glassing medel, såsom glycerol eller dimetylsulfoxid 14. Dessa krav resulterar i ett relativt litet antal av kandidatmolekyler. Men även efter den framgångsrika upptäckten av en lämplig molekyl, utveckla en arbetsprotokoll för hyperpolarisering kan vara tekniskt utmanande 9,14,15.

Under senare år har flera substrat varit framgångsrikt polariserad, såsom [1- 13 C] pyruvat 12,16 - 36, [2- 13 C] pyruvat 37, [1- 13 C] etylpyruvat 38, [1- 13 C ] laktat 39, [1- 13 C] fumarat 40-43, 13 C-bikarbonat 36,44,45, [1- 13 C] natriumacetat 43,46 - 49, 13 C-urea 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13 C] glutamat 53,54 [1- 13 C] 2-oxoglutarat 55, [1- 13 C] alanin, och andra 14,56. En särskilt intressant och som vanligen används substrat för hyperpolarisering är [1- 13 C] pyruvat. Den används ofta i prekliniska studier för att undersöka den cellulära energimetabolism i olika sjukdomar 14,17,22. [1- 13 C] pyruvat uppfyller alla krav för en lyckad hyperpolarisation, inklusive en relativt lång T 1 och snabb transport över cellmembranet för att sedan metaboliseras. Prekliniska studier med [1- 13 C] pyruvat närvarande översätts till kliniken 57.

Metabolism av pyruvat

Det är väl känt att det finns ett direkt samband mellan mutationer i en cancercellernas DNA och förändringar i deras metaboliska vägar. Redan på 1920-talet, Otto Warburg DiscovEred att det finns en ökad metabolism av glukos och produktionen av laktat i tumörer jämfört med frisk vävnad 58-60. Därefter olika alter i andra metaboliska reaktionsvägar, såsom pentos-fosfat-vägen, den trikarboxylsyra cykeln, oxidativ fosforylering och syntes av nukleotider och lipider, har beskrivit.

Pyruvat är slutprodukten av glykolys. I tumören genomgår den anaerob glykolys katalyserad av LDH 61 och reagerar med den reducerade formen av koenzymet nikotinamidadenindinukleotid (NADH), vilket resulterar i laktat och den oxiderade formen av koenzymet (NAD +). Alternativt genomgår pyruvat en transa reaktion med glutamat för att bilda alanin, katalyseras av alaninaminotransferas (ALT). Båda reaktionerna är lätt reversibel. Pyruvat undergår också dekarboxylering katalyserad av pyruvat-dehydrogenas (PDH) till koldioxid och acetyl-CoA, representing en irreversibel reaktion på detta steg. Alter i dessa reaktionshastigheter kan kopplas till tumörmetabolism 17,21,22,25,62. De metaboliska vägar är sammanfattade i fig 2.

figur 2
Figur 2: Diagram över de stora metaboliska reaktionen av pyruvat. Pyruvat / laktat omvandling katalyseras av LDH, och pyruvat / alanin omvandling katalyseras av ALT. Pyruvat är irreversibelt omvandlas till acetyl-CoA och CO2 av PDH och CO2 är i en pH-beroende jämvikt med bikarbonat 80. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Detekteringen av hyperpolariserad [1- 13 C] pyruvat och dess metaboliter har tidigare visats hos råtta hanart 37,63 - 65, lever 66, muskler och njure 62,67. En studie visade signifikanta skillnader i laktat-till-alanin förhållandet mellan det normala och fastade råttlever 66 och visade en kraftigt förhöjd och hyper [1- 13 C] laktat nivå i levercancer 68,69. Det finns belägg för att tumörgrad kan identifieras i en transgen adenokarcinom av mus prostata (TRAMP) med hjälp av hyper [1- 13 C] pyruvat 22, med de hyperpolariserade laktatnivåer visar en hög korrelation med den histologiska grad av utskurna tumörer. Alanin katalyseras från pyruvat av ALT har också föreslagits som en användbar markör i råttlevercancer 23.

Mätning av pyruvat-laktat metabola flux har använts för att övervaka ischemi 63,65,70 och som ett svar på behandling med cytostatika 17,40, riktade läkemedel <sup> 24,25,41, eller strålbehandling 26 i djurmodeller. Det har också använts för detektion av fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) -inhibitor LY294002 svar i glioblastom och bröstcancer musmodeller 25. Förändringar i pyruvat ämnesomsättning i hjärntumörer 26 och prostatacancer 24,71 har också observerats efter behandling.

prostatakarcinom

Prostatacancer är den dominerande cancer hos äldre män och den näst vanligaste cancerrelaterade döds hos män över hela världen 72. Hittills inga tillförlitliga, icke-invasiva metoder finns tillgängliga för en tidig diagnos och karakterisering av prostatacancer 73,74, betonar det akuta behovet av nya metaboliska avbildningstekniker för att möjliggöra strängare upptäckt och iscensättning av patienterna. Prostatacancer användes som en modell för att demonstrera möjligheterna upplösnings DNP i kombination med 13 CMRSI i patientens 57. Detta arbete fortsattes i en första klinisk prövning med användning av [1- 13 C] pyruvat och 13 CMRSI för avbildning av prostatacancer, och det har nyligen har avslutats (NCT01229618).

Motiveringen bakom detta arbete var att belysa mer i detalj och för en bredare publik tillämpningen av 13 CMRSI metoden i en preklinisk miljö med celler. Mätning av LDH-katalyserade metabolismen av [1- 13 C] pyruvat till [1- 13 C] laktat in vitro i PC3 prostatacancer cellinje visar vi en eventuell tillämpning av upplösnings DNP i in vitro-studier och ta itu med de avgörande stegen och utmaningar under experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provförrådslösning Framställning

  1. Lägg gadoterate meglumin (GadM, 0,5 mol / L) till koncentrerad [1- 13 C] pyrodruvsyra för att ge en slutkoncentration av 1-mmol / L GadM. Lägg trityl radikal tris (8-karboxi-2,2,6,6-tetra- (hydroxietyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) - metyl-natriumsalt (OX063) till denna blandning för att ge en slutlig koncentration av 15 mmol / L. Vortex till fullständig upplösning.
    OBS: Denna lösning förberedelse är konstruerad för användning med en 3,35-T preklinisk DNP hyperpolariserings. När en 7-T klinisk hyperpolarisator används, är gadoterate meglumin krävs inte eftersom vid en högre magnetfält, dess fördelar är försumbara. Tillsatsen av ett gadolinium-baserade kontrastmedel ökar den uppnå solid-state polarisering och även polarisationen hastigheten. Men i det flytande tillståndet, kontrastmedlet förkortar T en relaxationstiden.

2. Växande Cell Culture

    2 tillväxtområde. Använda F-12K-medium innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS) och bibehålla cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär vid 5% CO2. Före upplösningssteget, avlägsna mediet från odlingskolven.
    OBS: Varje cellinje kräver ett visst preparat protokoll för cellutbredning. Konsultera de krav med cellinje leverantören.

3. Beredning av celler för experiment

  1. Avlägsna cellmediet och tvätta cellerna med ~ 10 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Tillsätt 5 ml trypsin till kolven och returnera cellodlingsflaskor till inkubatorn under 3 till 5 min.
  3. Lägg ~ 5 ml F-12K-medium för att inaktivera trypsin.
  4. Räkna celler med användning av en automatisk cellräknare. Blanda 10 mikroliter av cell lösning med 10 mikroliter av fläcken lösning. Blanda väl med pipett och överföra 10 mikroliter av blandningen i the kammare av en "räkna glas".
  5. Avlägsna och räkna cellerna i kolven (s). Överföra de lämpliga volymer innehållande det önskade antalet celler (t.ex., 5 x 10 6 upp till 10 8) i plastflaskor.
  6. Centrifugera cellerna vid 1200 xg under 5 min och kasta bort supernatanten.
  7. Återsuspendera cellerna i F-12K-medium innehållande 10% FCS till en total volym av 800 mikroliter och överföra dem i ett reaktionskopp (2 ml). Placera reaktions bägaren i en plastflaska fylld med varmt vatten.

4. Upplösning Agent Framställning

OBS: Upplösningsmedlet är en vätska som används för att lösa upp den hyperpolariserade provet. I biologiska tillämpningar, är upplösning vanligtvis utförs med H2O baserad eller deuteriumoxid (D2O) -baserade buffertar, såsom PBS eller tris (hydroximetyl) aminometan (Tris), innehållande 1 g / L etylendiamintetraättiksyra (EDTA).

  1. beredningarning av 20 mmol / L PBS-buffert
    1. För att förbereda 100 ml av upplösningsmedlet, lös 36 mg monofosfat (NaH 2 PO 4), 247 mg dinatriumfosfat (Na 2 HPO 4), och 10 mg av EDTA i en lösning av 20 mmol / L natriumhydroxid ( NaOH) i D 2 O. Blanda ordentligt tills fullständig upplösning.
      OBS: EDTA (1 g / L) tillsätts till bufferten för att eliminera möjliga ferromagnetiska joner, som kan förstöra hyperpolarisering. NaOH för att neutralisera den pyrodruvsyra i ett 1: 1 mol-förhållande för att nå ett pH av 7,4.

5. variabel temperatur Insert (VTI) Cooldown

  1. I DNP-NMR polarisatorn programmets huvudfönstret, klicka på "Cooldown".
    OBS: Detta växlar på vakuumpumpen och evakuerar VTI till cirka 5,0 mbar. Därefter nålventilen mellan VTI och reservoaren flytande helium öppnas helt, vilket tillåter flytande helium att flöda in i VTI. Flödeshastigheten är regulated av nålventilen för att bibehålla den optimala mängden av flytande helium i VTI tills den når helium koktemperatur. Därefter VTI evakueras till nästan fullständig vakuum och temperaturen når cirka 1,4 K. Den VTI är fyllt med flytande helium upp till 65%. Vid denna punkt, är instrumentet klart för prov införing.

6. Provberedning och Insertion

  1. Med användning av en mikropipett, tillsätt ~ 8 mikroliter av 13 C-märkt prov stamlösningen in i en plastkopp.
  2. Fäst plastmugg till inmatningsstången och inleda provinföringsprocessen genom att trycka på "Infoga prov" i programmets huvudfönster. Välj "Normal prov" och klicka på "Fortsätt."
    OBS: Under denna process först stänger nålventilen att avbryta flödet av flytande helium i VTI, och trycket i VTI ökar då. Provhållaren inuti VTI höjs från flytande helium, inloppsventilenvid toppen av VTI öppnas, och ett gasformigt heliumflöde införs från inloppsventilen för att förhindra utanför förorening med luft fukt.
  3. När du uppmanas trycker inmatningsstången med den bifogade plastmugg ner i VTI. Se till att nå provhållaren vid botten av VTI. I annat fall kan den gasformiga helium pressa provet ut ur VTI.
  4. Lösgöra och ta bort inmatningsstången.
  5. Slutföra genom att klicka på "Nästa" i dialogfönstret. Provet insättningsproceduren bör inte ta längre tid än 10 sekunder.
    OBS: Inloppsventilen stängs därefter, det gasformiga heliumflödet avbrytes, provhållaren med provkoppen är nedsänkt i flytande helium och nålventilen öppnas för att tillåta det flytande helium att strömma in i VTI. Efter 5-10 minuter, är VTI kyls under 1,4 K, vilket gör att alla de fria elektroner att polariseras.
  6. Kontrollera att plastmugg med provet infördes korrekt i VTI genom att kontrollera thatt den inte är fäst vid införingsstången eller tryckas ut från VTI av heliumgas. Klicka sedan på "Finish."

7. Mikrovågsugn Sweep (tillval)

OBS: En mikrovågsugn svep medger bestämning av den optimala mikrovågsfrekvensen att maximera hyperpolarisering hastigheten för de 13 C-kärnorna i den avsedda föreningen.

  1. För att mäta mikrovågsugn svep startar RINMR programmet, typ "HYPERSENSENMR" och klicka på "Välj Config" och "Do Microsweep."
  2. För att initiera processen, välj "kalibrera" -fliken på programmets huvudfönster.
  3. Klicka på "Skapa" och välj början och slutet frekvens (t.ex. 94,100 GHz-94,200 GHz), frekvensstegstorleken (t.ex. 20 MHz), kraften (100 mW) och tiden (60 sekunder). Klicka på "Fortsätt", "Aktivera" och "Start".
    OBS: Med dessa inställningar hyperpolarisatorn först polariserar proveti 60 s med användning av en mikrovågsfrekvens av 94.100 GHz och en effekt av 100 mW. Då det gäller en 90 ° radiofrekvent (RF) puls och förvärvar den hyperpolariserade 13 C-signalen genom att använda den inbyggda spektrometer. Dessa steg upprepas för varje steg i angiven frekvensområde. För efterföljande hyperpolarisation väljer mikrovågsugn frekvens med maximal signalens amplitud mäts.

8. Polarization

  1. För att mäta polariseringsuppbyggnaden startar RINMR programmet, typ "HYPERSENSENMR" och klicka på "Välj Config" och "Solid Build-up."
  2. I DNP-NMR polarisatorn programmets huvudfönstret, klicka på "Polarisering" att inleda hyperpolarisering processen.
  3. Välj den optimala mikrovågsugn frekvensen (som erhållits under mikrovågsugn svep) och effekt (t ex 100 mW) för provet och klicka på "Nästa".
  4. Aktivera "polariseringsuppbyggnaden övervakning" och klicka på "Finish."
  5. Polarisera provet till> 95% (~ 60 min för [1- 13 C] pyruvat).
    OBS: Under polarisering, är mikrovågor leds in i VTI och till provet, vilket gör att 13 C snurrar att anpassa med de hyperpolariserade oparade elektron snurrar. För att mäta hyperpolarisering uppbyggd, är RF-pulser med en flip-vinkel (FA) av 5 ° appliceras periodiskt (t.ex. var 300: s), och den resulterande signalen plottas som en polariseringsuppbyggnaden kurvan.

9. Upplösning

  1. När polarisationen når> 95%, initiera upplösningsprocessen genom att klicka på "Upplösning" i DNP-NMR polarisatorn programmets huvudfönster.
  2. Välj upplösningsprocessen från rullgardinsmenyn och klicka på "Nästa".
    OBS: polarisator tillåter en att definiera den önskade upplösningsprocessen genom att välja tidpunkten för den jagande gasen.
  3. Belastnings ~ 5 ml från upplösningsmedlet genom den övre ventilen i ett uppvärmt kärl i tHan upplösning del av polarisatorn. Beräkna den exakta volymen av upplösningsmedel behövs med hjälp av följande ekvation:
    ekvation 1
    där V DA är den önskade volymen av upplösningsmedel, m PA, m OX063, och m Gad är massorna av pyruvat, OX063 och gadoterate meglumin, respektive, sattes till provet stamlösning.
  4. Placera upplösnings stick i aktivt läge ovanför inloppsventilen.
    OBS: Detta gör att instrumentet för att ansluta dess upplösning instrumentering till provbägaren i VTI.
  5. Klicka på "Finish" för att starta upplösningsprocessen.
    OBS: Upplösningsmedlet är trycksatt till 3 bar av heliumgas och därefter upphettas till 200 ° C, vilket orsakar en ökning av trycket. När trycket når 10 bar, stängs nålventilen att avbryta flödet av flytande helium till VTI. Provhållaren höjer koppenfrån flytande helium. Upplösnings stick sänks ner i VTI och ansluten till provkoppen. Det konditionerade upplösningsmedlet trycks av trycket, vilket resulterar från uppvärmningskärlet innehållande upplösningsbuffert och heliumgas, genom att upplösa stick till koppen, vilket orsakar en snabb upplösning av provet. Lösningen strömmar sedan ut in i uppsamlingskolven via plaströr. Upplösnings stick med den bifogade koppen höjs sedan från VTI.
  6. Flytta upplösnings stick med den bifogade koppen till "rengöring" och avsluta processen genom att klicka på "Finish."

10. detektion av 13 C hyper Signal

  1. 13 C metabolisk magnetisk resonansspektroskopi in vitro
    1. Blanda 200 mikroliter av 20-mmol / L upplöst hyperpolariserad prov från uppsamlingskolven med 800 mikroliter av cellösningen.
      OBS: Den resulterande slutliga koncentrationenav [1- 13 C] pyruvat är 4 mmol / L.
    2. Blanda suspensionen brunn med en mikropipett och överföring ~ 600 mikroliter i en 5 mm NMR-rör.
    3. Sätt i 5-mm NMR-rör in i en-T NMR-spektrometer. I huvudfönstret i programmet, klicka på "Kör" för att starta mätningen, tillämpa serie av hundra 10 ° RF-pulser var 3 s.
      OBS: Mät tiden mellan den initiala blandningen av den hyperpolariserade provet med cellerna och början av den spektroskopiska förvärvet. Se till att blandningsförfarandet inte överstiger 30 s för att minimera polarisering förlust.
  2. 13 C metabolisk magnetisk resonanstomografi
    1. Att bygga en behållare för in vitro experiment med hjälp av MRI-spektrometer, ta en 5-ml spruta och anslut den till en kateter (d = 1,2 mm) som är tillräckligt lång för att nå från spektrometern ISO-centrum till lättillgänglig område spektrometer.
    2. Fylla behållaren in vitro med the cell lösning av den önskade koncentrationen för experimentet (t.ex., 10 8) eller med en enzymatisk lösning.
    3. Placera en in vitro behållare vid isocentret av MRI magneten. Placera en 13 C-tuned radiofrekvens mottagarspole på behållaren. Placera en koncentrerad 13 C-märkt kalibrerings fantom (t.ex. 10-mol / L 13 C-urea) i närheten.
    4. Sätt i "in vitro container" nära iso-centrum NMR skannern.
    5. Köra skannerns standard 3-planet lokaliseringssekvens och justera behållarens in vitro position till iso-centrum, vid behov.
    6. Kör en 1H T2-viktade "anatomisk" sekvens som täcker in vitro behållaren lokalisering. Använd följande inställningar: 2D spinn eko med axiell orientering, repetitionstid (TR) = 2.000 ms, eko tid (TE) = 20 ms, skivtjocklek = 1 mm, synfält täcker behållaren in vitro och16 ekon per excitation. Se till att fältmellanlägg görs på protoner under detta steg.
    7. I de anatomiska bilder väljer 5 angränsande skivor centrerade på regionen av intresse. Förskriva en 13 C spektroskopiska kalibrerings förvärv täcker utvalda anatomiska skivor. Använd följande inställningar: 2D Block-Siegert kalibreringssekvensen med axiell orientering 12 x 12 centrerad kodad, TR = 1000 ms, skivtjocklek = 5 mm, synfält matchande anatomiska bilder, antal skanningar (NS) = 64, bandbredd = 5000 Hz, och FA = 90 °.
    8. Välj 13C spektroskopiska kalibreringssekvensen (för mer information, se Schulte et al. 2011) 75 från pulssekvensbibliotek. Hämta pulssekvensen till skannern från datorn genom att klicka på "Download". Klicka på "Spectra Prescan" för att köra spektroskopiska förskanning. I spektrumet magnituden tomten, justera toppen från 13C kalibrerings fantom till center av skannern frekvensen. Ställ mottagaren vinster till maximum. Klicka på "Start" för att köra 13 C spektroskopiska kalibreringssekvensen. Notera rapporterade överföringsförstärkning och centrerad frekvens.
    9. Ställ en 13 C kemiskt skift imaging (CSI) förvärv täcker utvalda anatomiska skivor. Använd följande inställningar: 2D eko-plan spektroskopiska imaging (EPSI) med axiell orientering 12 x 12 centrerad kodad, TR = 400 ms, skivtjocklek = 5 mm, synfält matchande anatomiska bilder, NS = 300, och bandbredd = 5000 Hz .
      OBS: EPSI prover en enda linje i k-space upprepade gånger efter en RF-excitation att förvärva både rumsliga och spektral information samtidigt. För mer information om förvärvet tekniker, se artikeln av Durst et al. 2015 76.
    10. Ladda ner 13 C CSI sekvens och köra spektroskopiska förscanningen. Justera skanner frekvens och sända förstärkningen såsom specificeras av kalibreringssekvensenproduktion.
    11. Efter den hyperpolariserade lösningen deponeras i uppsamlingskolven, utarbeta ~ 3 ml i en spruta och därefter injicera det in i katetern ansluten till behållaren in vitro. Starta förvärvet. Efter förvärvet är klar, spara rådatafilen för efterföljande rekonstruktion.

11. Data Rekonstruktion

  1. Applicera en av de två beskrivna kinetiska modeller för att analysera insamlade data.
    1. I den första metoden för att beskriva de LDH kinetik, kinetisk värde (k), jämföra summan av laktat-signalen (M LAC) till signalen av alla hyperpolariserade molekyler (M x) 21,77.
      ekvation 2
    2. I den andra metoden, mäta laktat och pyruvat signaler över tiden och montera dessa till en kinetisk modell 17,25,71. För att lösa den metaboliska växelkursen, k PA → LAC, och den effektivasignal dämpfaktor av laktat, r LAC, använda följande linjära differentialekvationer med hjälp av två-site utbyte differential modell, vilket ger för laktat:

      ekvation 3

Obs: Den effektiva laktat signalen avklingningshastighet r LAC är beroende av laktat longitudinella relaxationstiden (T 1, LAC), den motsatta metaboliska växlingskursen från laktat till pyruvat k LAC → PA, den applicerade FA och TR, och signalstyrkan i pyruvat (M PA) och laktat (M LAC), med hänsyn till den irreversibla signalminskning efter varje successiv excitation:

ekvation 4

Därför resulterar r LAC i en enda, oskiljaktig löptid signal förfall. Eftersom det är möjligt att korrigera för than vända vinkel och repetitionstiden, och även om det finns ett flöde LAC → PA, antar vi att valutakursen från laktat till pyruvat (k LAC → PA) behöver inte tas med i beräkningen, på grundval av resultaten av Harrison et al. 2012 78. Deras resultat visar att k LAC → PA inte spelar så avgörande roll som man skulle anta. I detta läge kan T en relaxationstiden för laktat som skall kvantifieras. Denna modell är oberoende av pyruvat administrering till mätningen, vilket, i fallet med in vitro-experiment, är inte avgörande och kan försummas. Det har dock spela en viktig roll för in vivo-mätningar 79.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaten av "mikrovågsugn sweep" illustreras i Figur 3. Den visar att den optimala mikrovågsfrekvensen för [1- 13 C] pyruvat provet är på 94,156 GHz för den lokala 3,35-T hyperpolarisator. Alla följande hyperpolarisering experiment (n = 14) genomfördes med hjälp av denna mikrovågsugn frekvens med en effekt på 100 mW. Den mikrovågsstrålning applicerades under 60-80 min, vilket leder till en solid-state hyperpolarisering högre än 90%. Resultaten presenteras i Figur 4. Den hyperpolariserade [13 C] pyruvat blandades med 5 x 10 6 (n = 2), 10 7 (n = 2), 2 x 10 7 (n = 1), 3 x 10 7 (n = 2), 4 × 10 7 (n = 1), 6 x 10 7 (n = 2), 8 × 10 7 (n = 2), och 10 8 (n = 1) av prostatacancer-cellinjen PC3.

De resulterande data är sammanfattade i fig 5 Figur 6. Förvärvade data med spektral och temporal upplösning visas i figur 5A-D och Figur 6A-D, med endast en tidsupplösning för varje molekyl observeras (Figur 5E-H och Figur 6E-H), och med endast en spektral upplösning (figur 5I -L och figur 5I-L). Vi har observerat tre stora hyperpolariserade signaler som representerar [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, och [1- 13 C] laktat, med kemiska skift vid 173 ppm, 181 ppm och 185 ppm, ungefär relativ till trimetylsilyl propansyra (TMSP) vid pH 7,4 och temperatur 20 ° C. Signalförhållandena mellan de tre metaboliterna är sammanfattade i tabell 1. Data visar en tydlig korrelation mellan laktat signalen och antalet celler närvarande i provet (Figur 7). Men resultatenfrån experimenten med mindre än 2 x 10 7 celler uppvisar betydande avvikelse, sannolikt på grund av en låg signal-till-brus-förhållande. Därför föreslår vi att du använder fler celler än detta för ytterligare experiment. När den relativa laktat signalen (kinetisk värde) normaliseras genom att antalet celler (figur 8), uppvisar det tydligt liknande upptag och metabolism genom alla cellerna. Det finns emellertid en trend av minskande laktatproduktion per cell med ett ökande antal celler. Vi tror att en av orsakerna till minskad cell metabolisk aktivitet är en mycket hög koncentration av celler i en mycket liten volym, vilket resulterar i den ökade viskositeten hos provet. Resultaten av två-site utbyte differential modellen sammanfattas i tabell 2 och visas i Figur 9. Uppgifterna följer en trend som liknar den tidigare modellen: ökande k PA → LAC med ett ökande antal celler. Men denna modell resulteras i en brantare ökning av kinetiken med antalet celler. När den metaboliska växelkursen k PA → LAC normaliseras till antalet celler, kan vi återigen se en tydlig trend med minskande k PA → LAC med ett ökande antal celler (Figur 10).

Figur 11 demonstrerar möjligheten att tillsatsen av spatial lokalisering till experimentet. Det visar en fantom som injicerats med 80 mmol / L hyper [1- 13 C] pyruvat bredvid en 10 mol / L 13 C-urea fantom. Tekniken gör det möjligt att uppnå ett spektrum med tidsmässiga och speciella upplösning (figur 11A) eller signalsönderfallet av de valda metabolit signaler i tid (Figur 11B). Spektra i tidsdomänen kan också summeras för att få en bättre signal-till-brus-förhållande (figur 11C). Den speciella upplösning medger valet av den önskade frekvensområdet of 13 C spektrum som tillhör vissa metaboliter, såsom [1- 13 C] pyruvat (Figur 11D), [1- 13 C] pyruvat hydrat (figur 11E), eller referens 13 C-urea (Figur 11F). Det kan samtidigt registreras med en 1H bild. Pulssekvensen används (EPSI) gör det möjligt att förvärva en bild av hela skivan var 4,9 s. Sammanfattningsvis kan denna teknik ge data med en spatial, temporal och spektral upplösning för någon metabolit.

figur 2
Figur 3: Resultat från en mikrovågsugn Sweep med [1- 13 C] pyruvat på lokal 3,35-T hyperpolarisator. Resultatet av mätningarna som bestämmer den optimala mikrovågsfrekvensen att maximera den hyperpolarisering hastighet av 13 C kärnor i målföreningen av [1- 13 C] pyruvat. Mikrovågssystem svep har en form av en EPR absorptionspektrum. Formen och separation av topparna är baserade på den radikal som används (i detta fall, trityl radikal), och det största inflytandet har en solid effekt och termisk blandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 4: Solid State Polarisering uppbyggnad av en [1- 13 C] pyruvat prov. Ett genomsnitt av n = 13 solid-state polarisation buildups med felet som representeras av den standardavvikelse mättes var 300 s för upp till 4500 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 5: Resultat av 13C NMR-spektroskopi för antalet celler (5 x 10 6 till 3 x 10 7 celler). Insamlade data ritas med spektral och temporal upplösning (AD), avsatt med tidsupplösning endast för [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, och [1- 13 C] laktat (EH), och plottas med spektral upplösning endast summera alla tidssteg (IL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 6: Resultat av 13C NMR-spektroskopi för antalet celler (4 x 10 7 till 1 x 10 8 celler). Insamlade data plottade med spektral och temporal upplösning ( 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, och [1- 13 C] laktat (EH), och ritas med spektral upplösning endast summera alla tidssteg (IL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 7: Resultat från Simple metabolit Ratio Kinetic Modeling. Data representerar förhållandet mellan den [1- 13 C] laktat signal till summan av [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, och [1- 13 C] laktat versus antalet celler i experiment. Felet representerar standardavvikelsen. Pleasa klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 8: Resultat från Simple metabolit Ratio Kinetic Modellering normaliserad till antalet celler. Data representerar förhållandet mellan [1- 13 C] laktat signal till summan av [1- 13 C] pyruvat, [1- 13 C] pyruvat hydrat, och [1- 13 C] laktat normaliseras till antalet celler versus antalet celler i experimenten. Felet representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 9: Resultat av två-site Exchange Differential Model. Data repr ESENT den metaboliska växelkurs (k PA → LAC) som funktion av antalet celler i experimenten. Felet representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 10: Resultat från två-site Exchange Differential Model normaliserad till antalet celler. Data representerar den metaboliska växelkurs (k PA → LAC) normaliserad till antalet celler versus antalet celler i experimenten. Felet representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 11: Resultat av magnetisk resonanstomografi av den hyperpolariserade [1- 13 C] pyruvat Probe. A) spektrum förvärvats över hela skivan och alla tidssteg. B) Den sönderfallet av [1- 13 C] pyruvat och [1- 13 C] pyruvat hydrat signal över tiden. Den tredje signalen är den 10 M 13 C-urea lokaliseringsreferens. C) Spektrumet förvärvades från hela rumsliga och temporal upplösning. D) Den 1 H bilden överlagras med 13 C bilden av den summerade [1- 13 C] pyruvat signal över alla tidssteg. E) Den 1 H bilden överlagras med 13 C bilden av den summerade [1- 13 C] pyruvat hydrat signal över alla tidssteg. F) Den 1 H bilden överlagras med <sup> 13C bild av den summerade 13 C-urea signal över alla tidssteg (referens). Den 13 C-signal i CE är normaliserade till det maximala av signalen av den specifika metaboliten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mobilnummer
5 × 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 × 10 7 (n = 1) 3 × 10 7 (n = 2) 4 × 10 7 (n = 1) 6 × 10 7 (n = 2) 8 × 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1)
[1- 13 C]
pyruvat 		92,9 ± 1,4 91,7 ± 1,0 86,7 77,5 ± 2,7 76 69,7 ± 0,5 65,9 ± 3,7 42,9
[1- 13 C]
pyruvat hydrat 		6,8 ± 1,2 6,7 ± 1,6 9,5 10,1 ± 1,8 8,9 7,7 ± 1,5 10,4 ± 0,2 13,4
[1- 13 C]
laktat 		0,3 ± 0,3 1,6 ± 0,6 3,8 12,4 ± 4,5 15,1 22,5 ± 1,1 23,7 ± 3,5 43,7

Tabell 1: det relativa förhållandet mellan hyper metaboliter med avseende på olika antal celler.

Mobilnummer 5 × 10 6 (n = 2) 10 7 (n = 2) 2 × 10 7 (n = 1) 3 × 10 7 (n = 1) 4 × 10 7 (n = 1) 6 × 10 7 (n = 2) 8 × 10 7 (n = 2) 10 8 (n = 1) k PA → LAC [* 10 -4] 0,924 ± 0,870 4,984 ± 1,19 15,135 36,289 58,904 112,174 ± 10,491 114,3 ± 37,059 349,234

Tabell 2:Resultaten av de två-site Exchange Differential modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

13 CMRSI med hyperpolariserade prober är en lovande metod för att övervaka metabolism i realtid in vitro och in vivo. En mycket viktig aspekt vid användning av denna experimentella förfarande är den rätta standardisering, särskilt när det gäller in vitro-experiment. Först måste framställningen av det prov som skall göras korrekt och konsekvent för att uppnå samma koncentration av hyperpolariserad material i varje experiment. Detta kräver en exakt vägning av både provet att vara hyperpolariserad och bufferten. Om koncentrationen inte är korrekt, är inte exakt den slutliga lösningens pH, som kan ha en påverkan på T 1 och cellernas svar. Det är också viktigt att hantera cellerna så enhetligt som möjligt. Cellerna bör alltid vara beredd på ett sådant sätt att det finns en minimal fördröjning mellan cellskörd och den efterföljande experiment för att minimera varaktigheten av tiden cellerna hålls på en mycket hög koncentreradentration och låg volym. Variation i beredningen cellprotokoll, såsom en annan förberedelsetider eller temperaturer kan leda till betydande variationer i erhållna data. Blandningen av provet med cellerna bör också standardiseras. Det är viktigt att mäta tiden mellan tillsatserna av spårämnet till cellsuspensionen och början av mätningen, eftersom detta kan variera; under dataanalysen, bör detta övervägas.

Rätt val av dataanalysen och kinetisk modellering är avgörande för tolkningen av de insamlade data. Den enkla modell är lämplig för en linjär en-vägs reaktion med en konstant kurs på två metaboliter. Såsom beskrivits i inledningen, undergår pyruvat flera enzymatiska reaktioner och, ännu viktigare, undergår det även en icke-enzymatisk reversibel-utbytesreaktion med pyruvat hydrat. Denna reaktion spelade en avgörande roll i försöken, och dess effekt är väl visat in försöket med 8 x 10 7 celler. Även om tabell 1 anger att pyruvat hydrat relativa koncentrationen liknar andra experiment, när noga undersökts i figur 6D visar den en mycket högre pyruvat hydrat signalen vid början av experimentet jämfört med de andra experimenten. Men när den temporala upplösningen summeras, är denna viktiga information förlorad och orsakar ett fel i återuppbyggnaden av data. Å andra sidan, är två-site utbyte differential modell en mer robust och exakt beskrivning av kinetiken eftersom det innehåller den temporala upplösningen i beräkningen. Sålunda innefattar den icke-enzymatiska utbyte med pyruvat hydrat, även om det utbyter snabbt med pyruvat under mätningen.

Det finns olika avbildnings strategier för att välja mellan för att observera den hyperpolariserade signalen eller för att spåra metabolismen av en hyperpolariserad molekyl i preclinical och kliniska studier. Durst et al. visat på fördelarna och nackdelarna med olika puls sequnces 76. Den fria induktions förfall kemiska skift imaging (FIDCSI) sekvens är relativt robust men har begränsad användning för multi-slice och tidsmässigt lösas avbildning. Eko-plan spektroskopiska imaging (EPSI) är robust för lutning frågor och effekter utanför resonans, men det är utsatt för återuppbyggnads artefakter. Den iterativa nedbrytning av vatten och fett med eko asymmetrisk och minsta kvadratuppskattning (IDEAL) 81, spiral kemiska skift imaging (ISPCSI), pulssekvens 35 och spiral kemiskt skift imaging (SPCSI) har hög kodningseffektivitet men är känsliga för B 0 inhomogenitet. Valet av sekvensen kommer att bero på de skanner egenskaper, den biologiska frågan, och systemet som undersöks.

Det finns många krav som måste uppfyllas för en lyckad hyperpolarisering. Emellertid tHär finns också flera begränsningar som den hyperpolariserade 13 CMRSI teknik numera inför. Den primära och oföränder begränsning är den T en relaxationstiden för 13 C kärnan i molekylen, som definierar den mängd av detekterbar signal tillgänglig vid den specifika tidpunkten för mätningen. Signalen sänks med varje RF-excitation som orsakar en förlust av hyperpolarisation signalen upprepade gånger under datainsamling. En annan begränsning är den relativt långa tidsperiod som krävs för att hyperpolarisera en molekyl. Detta tar vanligtvis från 30 till 90 min.

I jämförelse med andra tekniker för molekyl avbildning, såsom [18 F] -FDG PET, inte hyper 13 CMRSI inte kräva tumörer med ökade glykolytiska metaboliska vägar och därför ökad glukoskonsumtion. Tekniken visar en verklig metabolisk flöde i realtid. Å andra sidan, [18 F] -FDG PET ger inte direkt information ommetabolism men endast indirekt information om ackumulering i metaboliskt aktiva området. Detta kan leda till ett falskt negativt resultat, där tumören verkar vara metaboliskt inaktiv men är faktiskt med olika metaboliska vägar, såsom glutaminolysis, som kolkälla för spridning.

Sammanfattningsvis kan upplösning DNP användas i en mängd olika tillämpningar för att studera en obegränsad lista över sjukdomar (t.ex. diabetes) 82, mäta pH 15,36,45, eller övervaka metaboliska förändringar i olika typer av cancer. Dessa mätningar kan åstadkommas på olika nivåer, från i cell vitro experiment, genom prekliniska studier med djurmodeller (såsom möss, råttor, kaniner, grisar och hundar), färska kliniska studier 57. De framtida kliniska tillämpningar kommer att innehålla en mycket kraftfull och icke-invasiv diagnostiskt verktyg som kan inte bara upptäcka och lokalisera sjukdomen, men även göra det möjligt för observation av behandlingrespons i realtid 83.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901 GE Healthcare/Agilent Technologies 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon Magritek 1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 7789-20-0
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic Sigma Aldrich 7558-80-7
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 1310-73-2
Disodium edetate Sigma Aldrich 6381-92-6
Pyruvic acid - 13C1 Cambridge Isotopes Laboratories CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L) Guerbet gadoterate meglumine  
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) GE Healthcare trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line ATCC CRL1435
F-12K medium  ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1x ATCC 30-2101
Sample plastic cup Oxford Instruments
Trypan blue Bio-Rad 145-0013-MSDS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E. Clinical applications of PET in oncology. Radiology. 231 (2), 305-332 (2004).
  2. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  3. Carver, T. R., Slichter, C. P. Polarization of Nuclear Spins in Metals. Phys. Rev. 92 (1), 212-213 (1953).
  4. Abragam, A., Proctor, W. G. Spin Temperature. Phys. Rev. 109 (5), 1441-1458 (1958).
  5. Abragam, a, Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Reports Prog. Phys. 41 (3), 395-467 (2001).
  6. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  7. Shimon, D., Hovav, Y., Feintuch, A., Goldfarb, D., Vega, S. Dynamic nuclear polarization in the solid state: a transition between the cross effect and the solid effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (16), 5729-5743 (2012).
  8. Serra, S. C., Rosso, A., Tedoldi, F. Electron and nuclear spin dynamics in the thermal mixing model of dynamic nuclear polarization. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (38), 13299-13308 (2012).
  9. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Brindle, K. M. Biomedical applications of hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (4), 285-295 (2009).
  10. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Chen, A., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Hyperpolarized 13C metabolic imaging using dissolution dynamic nuclear polarization. J. Magn. Reson. Imaging. 36 (6), 1314-1328 (2012).
  11. Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  12. Golman, K., in't Zandt, R., Thaning, M. Real-time metabolic imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (30), 11270-11275 (2006).
  13. Comment, A., Rentsch, J., et al. Producing over 100 ml of highly concentrated hyperpolarized solution by means of dissolution DNP. J. Magn. Reson. 194 (1), 152-155 (2008).
  14. Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magn. Reson. Med. 66 (2), 505-519 (2011).
  15. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn. Reson. Med. 60 (2), 253-257 (2008).
  16. Chen, A. P., Albers, M. J., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magn. Reson. Med. 58 (6), 1099-1106 (2007).
  17. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
  18. Schroeder, M. A., Swietach, P., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovasc. Res. 86 (1), 82-91 (2010).
  19. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Tropp, J., Pfefferbaum, A., Spielman, D. M., Mayer, D. Cerebral dynamics and metabolism of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate using time-resolved MR spectroscopic imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (13), 1734-1741 (2010).
  20. Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66 (22), 10855-10860 (2006).
  21. Park, I., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C magnetic resonance metabolic imaging: application to brain tumors. Neuro. Oncol. 12 (2), 133-144 (2010).
  22. Albers, M. J., Bok, R., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68 (20), 8607-8615 (2008).
  23. Yen, Y. -F., Le Roux, P., et al. T(2) relaxation times of (13)C metabolites in a rat hepatocellular carcinoma model measured in vivo using (13)C-MRS of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 23 (4), 414-423 (2010).
  24. Dafni, H., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopic imaging informs on hypoxia-inducible factor-1 and myc activity downstream of platelet-derived growth factor receptor. Cancer Res. 70 (19), 7400-7410 (2010).
  25. Ward, C. S., Venkatesh, H. S., et al. Noninvasive detection of target modulation following phosphatidylinositol 3-kinase inhibition using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res. 70 (4), 1296-1305 (2010).
  26. Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magn. Reson. Med. 65 (2), 557-563 (2011).
  27. Johannesson, H., Macholl, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Dynamic Nuclear Polarization of [1-13C]pyruvic acid at 4.6 tesla. J. Magn. Reson. 197 (2), 167-175 (2009).
  28. Durst, M., Koellisch, U., et al. Bolus tracking for improved metabolic imaging of hyperpolarised compounds. J. Magn. Reson. 243, 40-46 (2014).
  29. Khegai, O., Schulte, R. F., et al. Apparent rate constant mapping using hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 27 (10), 1256-1265 (2014).
  30. Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites. NMR Biomed. 27 (5), 561-569 (2014).
  31. Aquaro, G. D., Frijia, F., et al. 3D CMR mapping of metabolism by hyperpolarized 13C-pyruvate in ischemia-reperfusion. JACC. Cardiovasc. Imaging. 6 (6), 743-744 (2013).
  32. Menzel, M. I., Farrell, E. V., et al. Multimodal assessment of in vivo metabolism with hyperpolarized [1-13C]MR spectroscopy and 18F-FDG PET imaging in hepatocellular carcinoma tumor-bearing rats. J. Nucl. Med. 54 (7), 1113-1119 (2013).
  33. Schilling, F., Duwel, S., et al. Diffusion of hyperpolarized (13) C-metabolites in tumor cell spheroids using real-time NMR spectroscopy. NMR Biomed. 26 (5), 557-568 (2013).
  34. Schulte, R. F., Sperl, J. I., et al. Saturation-recovery metabolic-exchange rate imaging with hyperpolarized [1-13C] pyruvate using spectral-spatial excitation. Magn. Reson. Med. 69 (5), 1209-1216 (2013).
  35. Wiesinger, F., Weidl, E., et al. IDEAL spiral CSI for dynamic metabolic MR imaging of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Magn. Reson. Med. 68 (1), 8-16 (2012).
  36. Wilson, D. M., Keshari, K. R., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. J. Magn. Reson. 205 (1), 141-147 (2010).
  37. Schroeder, M. A., Atherton, H. J., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  38. Hurd, R. E., Yen, Y. -F., et al. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and [1-13C] ethyl pyruvate. Magn. Reson. Med. 63 (5), 1137-1143 (2010).
  39. Chen, A. P., Kurhanewicz, J., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magn. Reson. Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
  40. Witney, T. H., Kettunen, M. I., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-(13)C]pyruvate and. Br. J. Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
  41. Bohndiek, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to a vascular disrupting agent using hyperpolarized (13)C magnetic resonance spectroscopy. Mol. Cancer Ther. 9 (12), 3278-3288 (2010).
  42. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (47), 19801-19806 (2009).
  43. Jensen, P. R., Peitersen, T., et al. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J. Biol. Chem. 284 (52), 36077-36082 (2009).
  44. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
  45. Scholz, D. J., Janich, M. A., et al. Quantified pH imaging with hyperpolarized 13C-bicarbonate. Magn. Reson. Med. 73 (6), 2274-2282 (2015).
  46. Koellisch, U., Gringeri, C. V., et al. Metabolic imaging of hyperpolarized [1-(13) C]acetate and [1-(13) C]acetylcarnitine - investigation of the influence of dobutamine induced stress. Magn. Reson. Med. 74 (4), 1011-1018 (2015).
  47. Koellisch, U., Laustsen, C., et al. Investigation of metabolic changes in STZ-induced diabetic rats with hyperpolarized [1-13C]acetate. Physiol. Rep. 3 (8), (2015).
  48. Jensen, P. R., Meier, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Duus, J. O., Karlsson, M., Lerche, M. H. Detection of low-populated reaction intermediates with hyperpolarized NMR. Chem. Commun. (34), 5168-5170 (2009).
  49. Koelsch, B. L., Keshari, K. R., Peeters, T. H., Larson, P. E. Z., Wilson, D. M., Kurhanewicz, J. Diffusion MR of hyperpolarized 13C molecules in solution. Analyst. 138 (4), 1011-1014 (2013).
  50. Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10435-10439 (2003).
  51. von Morze, C., Larson, P. E. Z., et al. Imaging of Blood Flow Using Hyperpolarized [(13)C]Urea in Preclinical Cancer Models. J. Magn. Reson. Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
  52. Chiavazza, E., Kubala, E., et al. Earth's magnetic field enabled scalar coupling relaxation of 13C nuclei bound to fast-relaxing quadrupolar 14N in amide groups. J. Magn. Reson. 227, 35-38 (2013).
  53. Jensen, P. R., Karlsson, M., Meier, S., Duus, J., Lerche, M. H. Hyperpolarized amino acids for in vivo assays of transaminase activity. Chem. - A Eur. J. 15 (39), 10010-10012 (2009).
  54. Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Detection of tumor glutamate metabolism in vivo using 13C magnetic resonance spectroscopy and hyperpolarized [1-13C]glutamate. Magn. Reson. Med. 66 (1), 18-23 (2011).
  55. Chaumeil, M. M., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized [1-13C] glutamate: a metabolic imaging biomarker of IDH1 mutational status in glioma. Cancer Res. 74 (16), 4247-4257 (2014).
  56. Keshari, K. R., Wilson, D. M. Chemistry and biochemistry of 13C hyperpolarized magnetic resonance using dynamic nuclear polarization. Chem. Soc. Rev. 43 (5), 1627-1659 (2014).
  57. Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Transl. Med. 5 (198), (2013).
  58. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  59. Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. {Ü}ber den Stoffwechsel von Tumoren im K{ö}rper. Klin. Wochenschr. 5 (19), 829-832 (1926).
  60. Barnes, A. B., De Paepe, G., et al. High-Field Dynamic Nuclear Polarization for Solid and Solution. Biological NMR. Appl. Magn. Reson. 34 (3-4), 237-263 (2008).
  61. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K. C., Harris, A. L. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 7 (1), 1-6 (2005).
  62. Golman, K., Petersson, J. S. Metabolic Imaging and Other Applications of Hyperpolarized 13C1. Acad. Radiol. 13 (8), 932-942 (2016).
  63. Golman, K., Petersson, J. S., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magn. Reson. Med. 59 (5), 1005-1013 (2008).
  64. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Jeffrey, F. M., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  65. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia NMR detection of hyperpolarized 13CO2 and H13CO3-. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  66. Hu, S., Chen, A. P., et al. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol. imaging Biol. MIB Off. Publ. Acad. Mol. Imaging. 11 (6), 399-407 (2009).
  67. Kohler, S. J., Yen, Y., et al. In vivo 13 carbon metabolic imaging at 3T with hyperpolarized 13C-1-pyruvate. Magn. Reson. Med. 58 (1), 65-69 (2007).
  68. Hu, S., Lustig, M., et al. 3D compressed sensing for highly accelerated hyperpolarized (13)C MRSI with in vivo applications to transgenic mouse models of cancer. Magn. Reson. Med. 63 (2), 312-321 (2010).
  69. Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
  70. Schroeder, M. A., Cochlin, L. E., Heather, L. C., Clarke, K., Radda, G. K., Tyler, D. J. In vivo assessment of pyruvate dehydrogenase flux in the heart using hyperpolarized carbon-13 magnetic resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (33), 12051-12056 (2008).
  71. Zierhut, M. L., Yen, Y. -F., et al. Kinetic modeling of hyperpolarized 13C1-pyruvate metabolism in normal rats and TRAMP mice. J. Magn. Reson. 202 (1), 85-92 (2010).
  72. Dennis, L. K., Resnick, M. I. Analysis of recent trends in prostate cancer incidence and mortality. Prostate. 42 (4), 247-252 (2000).
  73. Jambor, I., Borra, R., et al. Functional imaging of localized prostate cancer aggressiveness using 11C-acetate PET/CT and 1H-MR spectroscopy. J. Nucl. Med. 51 (11), 1676-1683 (2010).
  74. Presti, J. C. J., Hricak, H., Narayan, P. A., Shinohara, K., White, S., Carroll, P. R. Local staging of prostatic carcinoma: comparison of transrectal sonography and endorectal MR imaging. AJR. Am. J. Roentgenol. 166 (1), 103-108 (1996).
  75. Schulte, R. F., Sacolick, L., et al. Transmit gain calibration for nonproton MR using the Bloch-Siegert shift. NMR Biomed. 24 (9), 1068-1072 (2011).
  76. Durst, M., Koellisch, U., et al. Comparison of acquisition schemes for hyperpolarised (1)(3)C imaging. NMR Biomed. 28 (6), 715-725 (2015).
  77. Janich, M. A., Menzel, M. I., et al. Effects of pyruvate dose on in vivo metabolism and quantification of hyperpolarized (1)(3)C spectra. NMR Biomed. 25 (1), 142-151 (2012).
  78. Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13 C NMR. NMR Biomed. 25 (11), 1286-1294 (2012).
  79. Gómez Damián, P. A., Sperl, J. I., et al. Multisite Kinetic Modeling of (13)C Metabolic MR Using [1-(13)C]Pyruvate. Radiol. Res. Pract. 2014, (2014).
  80. Talbot, J. -N., Gutman, F., et al. PET/CT in patients with hepatocellular carcinoma using [(18)F]fluorocholine: preliminary comparison with [(18)F]FDG PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33 (11), 1285-1289 (2006).
  81. Reeder, S. B., Pineda, A. R., et al. Iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation (IDEAL): application with fast spin-echo imaging. Magn. Reson. Med. 54 (3), 636-644 (2005).
  82. Laustsen, C., Ostergaard, J. A., et al. Assessment of early diabetic renal changes with hyperpolarized [1-(13) C]pyruvate. Diabetes. Metab. Res. Rev. 29 (2), 125-129 (2013).
  83. Serrao, E. M., Brindle, K. M. Potential Clinical Roles for Metabolic Imaging with Hyperpolarized [1-(13)C]Pyruvate. Front. Oncol. 6, 59 (2016).

Tags

Cancer Research hyperpolarisering DNP, NMR magnetisk resonansspektroskopi magnetisk resonanstomografi MRI, LDH pyruvat laktat prostatakarcinom
hyperpolariserad<sup&gt; 13</sup&gt; C Metabolic magnetisk resonansspektroskopi och Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, … More

Kubala, E., Muñoz-Álvarez, K. A., Topping, G., Hundshammer, C., Feuerecker, B., Gómez, P. A., Pariani, G., Schilling, F., Glaser, S. J., Schulte, R. F., Menzel, M. I., Schwaiger, M. Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging. J. Vis. Exp. (118), e54751, doi:10.3791/54751 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter