Abstract
In de afgelopen decennia, nieuwe methoden voor tumor staging, restaging, de behandeling respons monitoring, en herhaling detectie van een verscheidenheid van kanker naar voren zijn gekomen in samenwerking met de positron emissie tomografie state-of-the-art met 18 F-fluorodeoxyglucose ([18 F ] -FDG PET). 13 C spectroscopische magnetische resonantie imaging (13 CMRSI) een minimaal invasieve imaging methode die de controle van metabolisme in vivo en in real time mogelijk maakt. Zoals met elk ander procédé gebaseerd op 13C kernmagnetische resonantie (NMR), is de uitdaging lage thermische polarisatie en een daaropvolgende lage signaal-ruisverhouding als gevolg van de relatief lage gyromagnetische verhouding van 13 C en een lage natuurlijke overvloed in biologische monsters. Door het overwinnen van deze beperkingen is dynamische nucleaire polarisatie (DNP) gevolgd monster dissolutie kort ingeschakeld gebruikte NMR en magnetische resonantie imaging (MRI) systemen meten, Studie, en het belangrijkste metabole routes in verschillende biologische systemen. Een bijzonder interessante en veelbelovende molecule gebruikt 13 CMRSI is [1- 13 C] pyruvaat, die in de afgelopen tien jaar, is op grote schaal meer recent toegepast voor in vitro, preklinische en klinische studies naar het cellulaire energiemetabolisme onderzoeken bij kanker en andere ziekten. In dit artikel schetsen we de techniek van ontbinding DNP gebruik van een 3,35 T preklinische DNP hyper- en demonstreren het gebruik ervan in in vitro studies. Een soortgelijk protocol voor hyperpolarisatie worden toegepast voor het grootste deel in vivo studies ook. Hiervoor gebruikten we lactaat dehydrogenase (LDH) gekatalyseerde en de metabolische omzetting van [1- 13 C] pyruvaat om [1- 13 C] lactaat in een prostaatcarcinoom cellijn, PC3, in vitro gebruik 13 CMRSI.
Introduction
Momenteel is de meest gebruikte werkwijze voor klinische stagering, restaging behandeling aanspreekbewaking en herhaling detectie van diverse kankers [18 F] -FDG PET. 1 Echter, onlangs, een aantal nieuwe en alternatieve benaderingen naar voren zijn gekomen. Een van die methodes is 13 CMRSI. Deze techniek houdt de invoering van de 13 C-molecuul in een biologisch monster, gevolgd door minimaal invasieve MRI om het metabolisme te beoordelen in vitro of in vivo in real time. Toch is de grootste uitdaging van 13 CMRSI, vergeleken met andere methoden zoals [18 F] -FDG PET of computertomografie, is de lage signaal-ruisverhouding.
Het NMR-signaal is recht evenredig met de mate van polarisatie, een verhouding van de spin ½ kernen verschil populatie in twee energietoestanden de totale populatie (Figuur 1A). De polarisatie is een product van the gyromagnetische verhouding (γ) van de kernen en het aangelegde magnetische veldsterkte over de temperatuur. Een typische polarisatie van 1 H kernen in de orde van 0,001% tot 0,005% in 3 T, dat een relatief slechte signaal-ruisverhouding geeft. De huidige state-of-the-art MRI is een succesvolle beeldvormingstechniek is alleen door de grote dichtheid van 1 H in biologische monsters en de hoge gyromagnetische verhouding van 1 H (y 1H = 42,576 MHz / T). Echter, het waarnemen andere kernen, zoals koolstof, is veeleisender. De enige stabiele, magnetisch actieve kool isotoop 13 C, vertegenwoordigt slechts 1,1% van alle koolstofatomen. Bovendien, de gyromagnetische verhouding van 13 C (13C γ = 10,705 MHz / T) vier maal lager dan die van 1H, wat leidt tot een lagere detectie-efficiëntie. Samengevat, de lage 13 dichtheid en lage C γ 13C veroorzaken thermische 13 C gemeten tot 0,0176% van de gevoeligheid van een 1 bereikenH-NMR meting in vivo.
Dynamic Nuclear Polarisatie
Werkwijze voor de relatief lage sensitiviteit van 13 C gemeten overwinnen is DNP. Het werd oorspronkelijk beschreven metalen in 1953 van Albert W. Overhauser. In zijn artikel, verklaarde hij: "Het is aangetoond dat als de electron spin resonantie van de geleidingselektronen verzadigd, de kernen worden gepolariseerd in dezelfde mate ze zouden zijn als de gyromagnetische verhouding waren die van het electron spin." 2 later dat jaar, Carver en Slichter experimenteel bevestigd Overhauser hypothese 3. In 1958, Abragam en Proctor beschreef dit effect voor elektronen in vloeistoffen en noemde het de "vaste-effect." Bij temperaturen onder 4 K, electron spin polarisatie bereikt bijna 100% en meer dan drie ordes van grootte hoger dan de kern-spin polarisatie (Figuur 1B) 4. Thij treedt op omdat de gyromagnetische verhouding van het elektron (e γ = 28024,944 MHz / T) is drie ordes van grootte hoger dan de nucleaire gyromagnetische verhouding. De zwakke wisselwerking tussen elektronen en kernen, zoals het Overhauser effect, het vaste zin crosseffect en de thermische mengwerking kan de overdracht van polarisatie van elektronspins naar kernspins via microgolfbestraling met een frequentie nabij de overeenkomstige elektron paramagnetische resonantie (EPR) frequentie 5,6. DNP theorie is verder ontwikkeld om meer elektronen en thermische mengen omvatten. Niettemin, tot op heden geen uniforme kwantitatieve theoretische beschrijving van DNP is gepubliceerd 7,8.
Figuur 1: Het begrijpen van Dynamic Nuclear Polarisatie en hyperpolarisatie. A) Een schematische vergelijking van de spin bevolkingin het thermisch evenwicht polarisatietoestand en het hypergepolariseerde toestand. B) De polarisatie is afhankelijk van de temperatuur. De polarisatie van een elektron (e -) bereikt 100% onder 1,4 K. De DNP voor de overdracht van de polarisatie van de e naar de 13 C kernen, die de polarisatie tot 10 5 voudig verhoogt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
DNP introduceren in studies van biologische systemen gebruik 13 C NMR had daaropvolgende snelle dissolutie monster te ontwikkelen. 50 jaar na Overhauser hypothese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. loste het technisch uitdagende kwestie van het brengen van het hypergepolariseerde bevroren monster in vloeibare toestand met een minimaal verlies hyperpolarisatie 6. Ontbinding DNP opende een nieuw onderzoeksgebied genaamd 13 CMRSIk, het verstrekken van een nieuwe methode om te onderzoeken en te karakteriseren verschillende ziektebeelden 9,10. Zo stabiel dragers van een ongepaard elektron, een trityl groep tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -methyl natriumzout (OX063) of (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-yl) oxyl (TEMPO) wordt meestal gebruikt. Deze zijn gemengd met de gewenste 13-gelabeld molecuul en blootgesteld aan bestraling met microgolven met een frequentie nabij de overeenkomstige EPR frequentie. Met deze techniek kan de polarisatie van 13 C kernen worden verhoogd tot 37% 11. Dit resulteert in een 10-voudige 5 verhoging polarisatie ten opzichte van de thermisch evenwicht polarisatie 11,12. Echter, zodra de microgolfstraling wordt gestopt en / of de 13 C-molecuul naar de vloeibare toestand, de polarisatie vervalt onder longitudinale relaxatietijd (T1) van de 13 C kern die is gepolariseerd. Dus deuitvinding van de snelle ontbinding technieken of elke latere techniek het verkorten van de tijd voordat de experimentele meting (dwz injectie) is cruciaal voor biologische toepassingen 13.
Er zijn drie belangrijke eisen waaraan de kandidaat molecuul moet voldoen voor een succesvolle 13 CMRSI studies. Ten eerste, de 13 C kern plaats moet een voldoende lange t 1 (> 10 s) hebben. De keuze van de 13 C-label is cruciaal. De beste kandidaat kernen zijn koolstoffen zonder direct contact met 1 H-kernen via een obligatie. Het moet ook snel worden gemetaboliseerd binnen 2-3 T 1 keer, wat resulteert in een stroomafwaarts metaboliet met een significant verschillende chemische verschuiving van de oorspronkelijke stof. Het monstermengsel moeten ook een amorf glas als in vaste toestand, zodat de ruimtelijke verdeling vermindert de afstand tussen het elektron en 13 C, waardoor de transfer polarisatie. Indien de kandidaat molecuul amorf glas niet van nature vormt, moet goed oplosbaar in een glassing middel, zoals glycerol of dimethylsulfoxide 14 worden. Deze eisen leiden tot een relatief klein aantal kandidaat moleculen. Maar zelfs na de succesvolle ontdekking van een geschikt molecuul, het ontwikkelen van een werkende protocol voor hyperpolarisatie kan technisch uitdagend 9,14,15 zijn.
De laatste jaren hebben verschillende substraten succes gepolariseerd zijn, zoals [1- 13 C] pyruvaat 12,16 - 36, [2- 13 C] pyruvaat 37 [1- 13 C] ethyl pyruvaat 38 [1- 13 C ] 39 lactaat, [1- 13 C] fumaraat 40-43, 13 C-bicarbonaat 36,44,45, [1- 13 C] natriumacetaat 43,46 - 49, 13 C-ureum 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13 C] glutamaat 53,54 [1- 13 C] 2-oxoglutaraat 55 [1- 13 C] alanine en anderen 14,56. Een bijzonder interessante en meest gebruikte substraat voor hyperpolarisatie is [1- 13 C] pyruvaat. Het wordt veel gebruikt in preklinische studies om de cellulaire energie-metabolisme in verschillende ziekten 14,17,22 te onderzoeken. [1- 13 C] pyruvaat voldoet aan alle eisen voor een succesvolle hyperpolarisatie, met inbegrip van een relatief lange T 1 en snel transport over de celmembraan alvorens vervolgens wordt gemetaboliseerd. Preklinische studies met [1- 13 C] pyruvaat worden momenteel vertaald in de kliniek 57.
Stofwisseling van pyruvaat
Het is bekend dat er een rechtstreeks verband tussen mutaties in DNA en veranderingen in hun metabole routes kanker cellen. Reeds in de jaren 1920, Otto Warburg Discovuitgegaan dat er een verhoogd metabolisme van glucose en de productie van lactaat in tumoren in vergelijking met gezond weefsel 58-60. Vervolgens verschillende afwisselingen in andere metabole routes, zoals de pentose-fosfaat route, de citroenzuurcyclus, oxidatieve fosforylering en de synthese van nucleotiden en lipiden, zijn beschreven.
Pyruvaat is het eindproduct van glycolyse. In de tumor ondergaat anaërobe glycolyse gekatalyseerd door LDH 61 en reageert met de gereduceerde vorm van het co-enzym nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), waardoor lactaat en de geoxideerde vorm van co-enzym (NAD +). Alternatief pyruvaat ondergaat transamineringsreaktie reactie met glutamaat alanine te vormen, gekatalyseerd door alanine transaminase (ALT). Beide reacties zijn gemakkelijk omkeerbaar. Pyruvaat ondergaat gekatalyseerd door decarboxylering pyruvaat dehydrogenase (PDH) kooldioxide en acetyl-CoA, representing een irreversibele reactie bij deze stap. Afwisselingen in deze reactiesnelheden kunnen worden gekoppeld aan tumormetabolisme 17,21,22,25,62. De metabole route zijn in figuur 2.
Figuur 2: Schematische weergave van de belangrijkste metabole reactie van pyruvaat. Pyruvaat / lactaat omzetting wordt gekatalyseerd door LDH en pyruvaat / alanine omzetting wordt gekatalyseerd door ALT. Pyruvaat is irreversibel omgezet in acetyl-CoA en CO 2 door PDH en CO 2 in een pH-afhankelijke evenwicht met bicarbonaat 80. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De detectie van gehyperpolariseerde [1- 13 C] pyruvaat en zijn metabolieten is eerder aangetoond in de rat hijart 37,63 - 65, 66 lever, spieren en nieren 62,67. Een studie toonde significante verschillen in de lactaat-to-alanine verhouding tussen de normale en vastten rattenlever en 66 vertoonden een zeer verhoogde en gehyperpolariseerde [1- 13 C] lactaat niveau leverkanker 68,69. Er zijn aanwijzingen dat de tumor rang kunnen worden geïdentificeerd in een transgene adenocarcinoom van muizen prostaatkanker (TRAMP) middels gehyperpolariseerde [1- 13 C] pyruvaat 22, met het gehyperpolariseerde lactaat niveaus die een hoge correlatie met de histologische graad van de tumoren uitgesneden. De alanine gekatalyseerd van pyruvaat door ALT is ook gesuggereerd als een bruikbare marker in ratten leverkanker 23.
Meten van de pyruvaat-lactaat metabole flux is gebruikt voor de monitoring ischemie 63,65,70 en als reactie op behandeling met cytotoxische chemotherapie 17,40, gerichte geneesmiddelen <sup> 24,25,41, of radiotherapie 26 in diermodellen. Het is ook gebruikt voor de detectie van de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) remmer LY294002 reactie in glioblastoma en borstkanker muismodellen 25. Veranderingen in pyruvaatstofwisseling in hersentumoren 26 en prostaatkanker 24,71 zijn eveneens waargenomen na behandeling.
prostaatcarcinoom
Prostaatcarcinoom is de belangrijkste kanker bij oudere mannen en de tweede belangrijkste kanker gerelateerde dood bij mannen wereldwijd 72. Tot op heden zijn geen betrouwbare, niet-invasieve methoden beschikbaar voor een vroege diagnose en typering van prostaatkanker 73,74, met nadruk op de dringende behoefte aan nieuwe metabole beeldvormende technieken aan strenge opsporing en enscenering van de patiënten mogelijk te maken. Prostaatcarcinoom werd gebruikt als een model om de mogelijkheden van ontbinding DNP in combinatie met 13 CMRSI in de patiënt aan te tonens 57. Dit werk werd voortgezet in een eerste klinische studie in dienst [1- 13 C] pyruvaat en 13 CMRSI voor de beeldvorming van prostaatkanker, en het heeft onlangs is afgerond (NCT01229618).
De motivatie achter dit werk was om te illustreren in meer detail en voor een breder publiek de toepassing van de 13 CMRSI methode in een preklinische omgeving met cellen. Het meten van de LDH-gekatalyseerde metabolisme van [1- 13 C] pyruvaat om [1- 13 C] lactaat in vitro in de PC3 prostaatcarcinoom cellijn, tonen we de mogelijke toepassing van ontbinding DNP in in vitro studies en het adres van de cruciale stappen en uitdagingen tijdens de experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steekproef Stock Solution Voorbereiding
- Voeg gadoterate meglumine (GadM, 0,5 mol / l) geconcentreerde [1- 13 C] pyrodruivenzuur tot een eindconcentratie van 1-mmol / l GadM geven. Voeg trityl groep tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) - methyl natriumzout (OX063) aan dit mengsel tot een eindconcentratie van 15 mmol / L te geven. Vortex tot volledige oplossing.
LET OP: Deze voorraad oplossing voorbereiding is ontworpen voor gebruik met een 3,35-T preklinische DNP hyperpolarisator. Bij een 7-T klinische hyperpolarisatoreenheid wordt gebruikt, wordt de gadoterate meglumine niet nodig omdat bij een hogere magnetische veld, de voordelen verwaarloosbaar. De toevoeging van een gadoliniumhoudende contrastmiddel verhoogt de haalbaar solid-state polarisatie en ook de polarisatie rate. Echter, in de vloeibare toestand, het contrastmiddel verkort de T1 relaxatietijd.
2. Het kweken van de celkweek
OPMERKING: Elke cellijn vereist een specifieke voorbereiding protocol voor mobiele voortplanting. Raadpleeg de eisen met de cellijn provider.
3. Bereiding van de cellen voor Experiment
- Verwijder het celmedium en was de cellen met ~ 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 5 ml trypsine aan de kolf en geeft het celkweekkolven de incubator gedurende 3 tot 5 minuten.
- Voeg ~ 5 ml F-12K medium om de trypsine te deactiveren.
- Tel de cellen met een automatische celteller. Mix 10 pi van de celoplossing met 10 pi van de kleuroplossing. Meng goed met de pipet overgebracht 10 pi van het mengsel in de te kamer van een van "het tellen van glas".
- Verwijder en tel de cellen in de kolf (s). Breng de passende hoeveelheden die het gewenste aantal cellen (bijvoorbeeld 5 x 10 6 tot 10 8) in plastic flesjes.
- Centrifugeer de cellen bij 1200 xg gedurende 5 min en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in de F-12K medium dat 10% FCS tot een totaal volume van 800 ul en overbrengen naar een reactie kop (2 ml). Plaats de reactie beker in een plastic flesje gevuld met warm water.
4. Ontbinding Agent Voorbereiding
OPMERKING: Het oplossen middel een vloeistof die wordt gebruikt om het gehyperpolariseerde monster op te lossen. In biologische toepassingen wordt ontbinding traditioneel met H 2 O-gebaseerde of deuteriumoxide (D2O) gebaseerde buffers, zoals PBS of tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris), bevattende 1 g / l ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).
- preparatie van 20 mmol / L PBS-buffer
- Aan 100 ml van de oplossing-middel, los 36 mg mononatriumfosfaat (NaH 2 PO 4), 247 mg dinatriumfosfaat (Na 2 HPO 4) en 10 mg van EDTA in een oplossing van 20 mmol / l natriumhydroxide ( NaOH) in D 2 O. Mix behoren tot volledige oplossing.
OPMERKING: EDTA (1 g / l) toegevoegd aan de buffer om mogelijke ferromagnetische ionen elimineren, die de hyperpolarisatie kan bederven. NaOH wordt gebruikt om de pyrodruivenzuur in een 1 neutraliseren: 1 molaire verhouding tot een pH van 7,4 te bereiken.
- Aan 100 ml van de oplossing-middel, los 36 mg mononatriumfosfaat (NaH 2 PO 4), 247 mg dinatriumfosfaat (Na 2 HPO 4) en 10 mg van EDTA in een oplossing van 20 mmol / l natriumhydroxide ( NaOH) in D 2 O. Mix behoren tot volledige oplossing.
5. Variabele Temperatuur Insert (VTI) Cooldown
- In de polarisator programma hoofdvenster DNP-NMR, klik op "Cooldown."
LET OP: Deze schakelt de vacuümpomp en evacueert het VTI tot ongeveer 5,0 mbar. Vervolgens heeft de naald klep tussen het VTI en het vloeibare helium reservoir helemaal open, waardoor vloeibaar helium te stromen in het VTI. Het debiet is regulated door de naaldklep om de optimale hoeveelheid vloeibare helium in het VTI handhaven totdat de helium kooktemperatuur bereikt. Vervolgens wordt het VTI geëvacueerd tot bijna volledig vacuüm en de temperatuur bereikt ongeveer 1,4 K. De VTI is gevuld met vloeibaar helium tot 65%. Op dit moment is het instrument klaar voor monster inbrengen.
6. Monstervoorbereiding en Insertion
- Met behulp van een micropipet, voeg ~ 8 pi 13 C-gelabelde monster voorraadoplossing in een plastic beker.
- Bevestig de plastic beker met de inbrengstang en start het monster inbrengen proces door te drukken "Insert sample" in het hoofdvenster. Selecteer "Normal monster" en klik op "Doorgaan."
OPMERKING: Tijdens dit proces, de naaldklep sluit eerst de stroom van vloeibaar helium in VTI stoppen, en de druk in het VTI neemt dan toe. De monsterhouder in het VTI wordt verhoogd van het vloeibare helium, de inlaatklepbovenaan de VTI opent, en een gasvormig helium stroom wordt geïntroduceerd van de inlaatklep buiten verontreiniging met lucht vocht. - Wanneer u wordt gevraagd, drukt u op de inbrengstang met de bijgevoegde plastic beker naar beneden in het VTI. Zorg ervoor dat de monsterhouder bereikt onderaan het VTI. Anders kan het gasvormige helium het monster uit het VTI te duwen.
- Los te maken en verwijder de inbrengstang.
- De procedure te beëindigen door te klikken op "Next" in het dialoogvenster. Het monster inbrengen procedure mag niet langer duren dan 10 s.
OPMERKING: De inlaatklep sluit vervolgens de gasvormige helium stroom wordt onderbroken, de monsterhouder met de monsterhouder wordt ondergedompeld in vloeibaar helium, en de naaldklep wordt geopend om de vloeibare helium stroomt in het VTI. Na 5-10 min, wordt het VTI onder 1,4 K afgekoeld, waardoor alle vrije elektronen worden gepolariseerd. - Controleer of de plastic beker met het monster goed in het VTI werd geïntroduceerd door het controleren thoed is niet verbonden aan de inbrengstang of geduwd uit het VTI door heliumgas. Klik vervolgens op "Finish."
7. Magnetron Sweep (optioneel)
OPMERKING: Een magnetron zwaai maakt de bepaling van de optimale microgolffrequentie de hyperpolarisatie snelheid van 13 C kernen in de doelverbinding te maximaliseren.
- Om de magnetron sweep te meten, start het RINMR programma, type "HYPERSENSENMR," en klik op "Select Config" en "Do Microsweep."
- Om het proces te starten, selecteert u de "kalibreren" tab op het hoofdvenster.
- Klik op "Generate" en kies het begin en einde frequentie (bijvoorbeeld 94,100 GHz-94,200 GHz), de frequentie stapgrootte (bijvoorbeeld 20 MHz), het vermogen (100 mW) en de tijd (60 s). Klik op "Doorgaan", "Enable" en "Start."
OPMERKING: Met deze instellingen, de hyperpolarisator polariseert eerste het monster60 s met een microgolffrequentie van 94,100 GHz en een vermogen van 100 mW. Dan geldt een 90 ° radiofrequente (RF) puls en verwerft het gehyperpolariseerde 13 C sein uit het ingebouwde spectrometer. Deze stappen worden herhaald voor elke stap in de opgegeven frequentiebereik. Voor de daaropvolgende hyperpolarisatie, kies de microgolf frequentie met de maximale signaalamplitude gemeten.
8. Polarisatie
- Om de polarisatie opbouw meten, start de RINMR programma, type "HYPERSENSENMR," en klik op "Select Config" en "Solid Build-up."
- In de polarisator programma hoofdvenster DNP-NMR, klikt u op "Polarisatie" om het hyperpolarisatie te starten.
- Kies de optimale magnetron frequentie (verkregen tijdens de magnetron sweep) en het vermogen (bijvoorbeeld 100 mW) voor de steekproef in en klik op 'Volgende'.
- Enable "Polarisatie opbouw bewaking" en klik op "Finish."
- Polariseren het monster tot> 95% (~ 60 min voor [1- 13 C] pyruvaat).
LET OP: Tijdens de polarisatie, microgolven worden geleid in het VTI en het monster, waardoor de 13 C spins aan te sluiten bij het hypergepolariseerde ongepaard elektron spins. De hyperpolarisatie opbouw te meten, worden RF pulsen met een kantelhoek (FA) van 5 ° periodiek toegepast (bijvoorbeeld 300 seconden) en het resulterende signaal wordt uitgezet als polarisatie opbouw curve.
9. Ontbinding
- Wanneer de polarisatie> 95% bereikt, inleiding van de ontbinding door te klikken op "Ontbinding" in de polarisator programma hoofdvenster DNP-NMR.
- Kies de ontbinding proces van de drop-down menu en klik op 'Volgende'.
OPMERKING: De polarisator kan men de gewenste oplossingsproces definiëren door het kiezen van de timing van de achtervolgende gas. - Load ~ 5 ml van de oplossing middel door de bovenste klep in een verwarmd vat tHij ontbinding deel van de polarisator. Bereken het exacte volume van de ontbinding middel nodig met behulp van volgende vergelijking:
waarbij V DA is het gewenste volume van ontbinding middel, m PA, m OX063, en m Gad zijn de massa's van de pyruvaat, OX063 en gadoterate meglumine, respectievelijk toegevoegd aan de steekproef voorraad oplossing. - Plaats de ontbinding stok in de actieve positie boven de inlaatklep.
LET OP: Dit laat het instrument om de ontbinding instrumenten aan te sluiten op het monster cup in het VTI. - Klik op "Finish" om de ontbinding te starten.
Opmerking: Het oplossen middel onder een druk van 3 bar bij heliumgas en vervolgens tot 200 ° C verhit, waardoor drukverhoging. Wanneer de druk 10 bar bereikt, de naaldklep gesloten om de stroming van vloeibaar helium in het VTI beëindigen. Het monster houder verhoogt de bekervan vloeibaar helium. Het oplossen stick is neergelaten in het VTI en verbonden met de monsterhouder. Het geconditioneerde oplossen middel wordt geduwd door de druk die voortvloeit uit het verwarmingsvat met de ontbinding buffer en heliumgas, door ontbinding vasthouden aan de cup, waardoor een snelle oplossing van het monster. De oplossing stroomt vervolgens uit in de collectie kolf via plastic buizen. De ontbinding stick met de bijgevoegde beker wordt vervolgens verhoogd van het VTI. - Beweeg de ontbinding stick met de bijgevoegde beker naar de "schoonmaken" positie en voltooi het proces door te klikken op "Finish."
10. Detectie van de 13 C hypergepolariseerde Signal
- 13 C metabole resonantiespectroscopie in vitro
- Meng 200 pi van de 20-mmol / l opgelost gehyperpolariseerde monster uit de collectie kolf met 800 pi van de celoplossing.
NB: De verkregen eindconcentratievan [1- 13 C] pyruvaat is 4 mmol / l. - Meng de suspensie goed met behulp van een micropipet en overdracht ~ 600 pi tot op 5 mm NMR-buis.
- Plaats de 5 mm NMR-buis in de 1-T NMR spectrometer. In het hoofdvenster van de software, klikt u op "Run" om de meting te starten, het aanbrengen van series van honderd 10 ° RF pulsen om de 3 s.
OPMERKING: Meet de tijd tussen de eerste vermenging van het gehyperpolariseerde monster met de cellen en het begin van de spectroscopische acquisitie. Controleer of de mengprocedure niet meer dan 30 s polarisatie te minimaliseren.
- Meng 200 pi van de 20-mmol / l opgelost gehyperpolariseerde monster uit de collectie kolf met 800 pi van de celoplossing.
- 13 C metabole MRI
- Om een container voor de in vitro experimenten met de MRI-spectrometer te bouwen, neem dan een 5-mL spuit en sluit deze aan op een katheter (d = 1,2 mm) die lang genoeg is te bereiken vanaf de spectrometer het iso-centrum naar het benaderbaar gebied van de spectrometer.
- Vul het in vitro container met the celoplossing van de gewenste concentratie van het experiment (bijvoorbeeld 10 8) of met een enzymatische oplossing.
- Plaats een in vitro verpakking bij het isocentrum van de magneet MRI. Plaats een 13 C-afgestemde radiofrequentieontvanger spoel op de houder. Plaats een geconcentreerde 13 C-gelabeld calibratie fantoom (bv 10-mol / L 13 C-ureum) in de buurt.
- Plaats de "in vitro container" in de buurt van het iso-centrum van de NMR-scanner.
- Werking van de scanner standaard 3-plane lokalisatiesequentie en plaats het in vitro container passen aan het iso-centrum, indien nodig.
- Voer een 1 H-T2-gewogen "anatomische" sequentie met betrekking tot de in vitro container lokalisatie. Gebruik de volgende instellingen: 2D spin-echo met axiale oriëntatie, herhalingstijd (TR) = 2,000 ms, echo tijd (TE) = 20 ms, slice dikte = 1 mm, gezichtsveld voor de in vitro container, en16 echo's per excitatie. Zorg ervoor dat het veld shimming wordt op protonen gemaakt tijdens deze stap.
- In de anatomische beelden, selecteert 5 opeenvolgende segmenten gecentreerd op het gebied van belang. Voorschrijven van een 13 C spectroscopische calibratie overname met betrekking tot de geselecteerde anatomische plakjes. Gebruik de volgende instellingen: 2D Block-Siegert kalibratieprocedure met axiale richting 12 x 12 centric gecodeerd, TR = 1,000 ms, plakdikte = 5 mm, gezichtsveld bijpassende anatomische beelden, het aantal scans (NS) = 64, bandbreedte = 5000 hz en FA = 90 °.
- Selecteer de 13 C spectroscopische kalibratieprocedure (voor meer informatie, zie Schulte et al. 2011) 75 van de pulssequentie bibliotheek. Download de pulssequentie om de scanner van de computer door te klikken op "Download." Klik op "Spectra Prescan" om de spectroscopische prescan draaien. In het spectrum magnitude plot, past het hoogtepunt van het 13 C kalibratie fantoom aan de center van de scanner frequentie. Stel de ontvanger krijgt tot het maximum. Klik op "Start" om de 13 C spectroscopische calibratie volgorde uit te voeren. Let op de gerapporteerde winst zend- en centric frequentie.
- Stel een 13 C chemische verschuiving imaging (CSI) overname voor de geselecteerde anatomische plakjes. Gebruik de volgende instellingen: 2D echo-vlakke spectroscopische beeldvorming (EPSI) met axiale oriëntatie 12 x 12 centric gecodeerd, TR = 400 ms, plakdikte = 5 mm, gezichtsveld bijpassende anatomische beelden, NS = 300, en bandbreedte = 5000 Hz .
LET OP: EPSI samples een enkele lijn in k-ruimte herhaaldelijk na één RF excitatie om zowel ruimtelijke en spectrale informatie tegelijkertijd te verwerven. Voor meer informatie over de overname technieken, zie het artikel van Durst et al. 2015 76. - Download de 13 C CSI volgorde en voer de spectroscopische Prescan. Stel de scanner frequentie en het doorsturen van de winst zoals gespecificeerd door de kalibratie-sequentieoutput.
- Na het gehyperpolariseerde oplossing in de kolf verzameling wordt aangebracht, stellen ~ 3 ml in een injectiespuit en injecteren in de katheter verbonden met de in vitro verpakking. Start de overname. Na de overname is voltooid, slaat u het ruwe data bestand voor latere wederopbouw.
Reconstructie 11. Gegevens
- Breng één van de twee beschreven kinetische modellen om de verkregen gegevens te analyseren.
- In de eerste werkwijze voor het beschrijven van de LDH kinetiek, kinetische waarde (k), vergelijk de som van de lactaat signaal (M LAC) het signaal van gehyperpolariseerd moleculen (Mx) 21,77.
- In de andere methode, het meten van de lactaat en pyruvaat signalen over de tijd en passen deze aan een kinetisch model 17,25,71. Om de stofwisseling wisselkoers op te lossen, k PA → LAC, en de effectievesignaal vervalsnelheid van lactaat, r LAC, gebruikt u de volgende lineaire differentiaalvergelijkingen met behulp van de twee eigen omrekeningsverschillen model, waardoor voor lactaat:
- In de eerste werkwijze voor het beschrijven van de LDH kinetiek, kinetische waarde (k), vergelijk de som van de lactaat signaal (M LAC) het signaal van gehyperpolariseerd moleculen (Mx) 21,77.
Noot: De effectieve lactaat signaal vervalsnelheid r LAC is afhankelijk van de lactaat longitudinale relaxatietijd (T1, LAC), het andere metabolische koers van lactaat tot pyruvaat k LAC → PA, de toegepaste FA en TR, en de signaalintensiteit van pyruvaat (M PA) en lactaat (M LAC), rekening houdend met de onomkeerbare signaal reductie na elke opeenvolgende excitatie: 
Daarom r LAC resulteert in een enkele, onafscheidelijk termijn van het signaal verval. Omdat het mogelijk te corrigeren thij kantelhoek en de herhalingstijd, en hoewel er een flux LAC → PA, aangenomen dat de koers van lactaat lactaatdehydrogenase (k LAC → PA) behoeft niet te worden opgenomen in de berekening, gebaseerd op de resultaten van Harrison et al. 2012 78. De resultaten tonen aan dat de k LAC → PA als een cruciale rol zou veronderstellen niet werkt. In deze modus kan de T1 relaxatietijd van lactaat te kwantificeren. Dit model is onafhankelijk van pyruvaat toediening aan de meting die, bij in vitro experimenten, is niet cruciaal en kan worden verwaarloosd. Wel, spelen een belangrijke rol in vivo metingen 79.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de "microwave sweep" zijn aangegeven in figuur 3. Het toont aan dat de optimale frequentie van de microgolf [1- 13 C] pyruvaat monster op 94,156 GHz voor de lokale 3,35-T hyperpolarisator. Alle volgende hyperpolarisatie experiment (n = 14) werden uitgevoerd met deze microgolf frequentie met een vermogen van 100 mW. De microgolfbestraling werd gedurende 60 tot 80 minuten, wat leidt tot een vaste toestand hyperpolarisatie hoger dan 90%. De resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Het gehyperpolariseerde [13 C] pyruvaat werd gemengd met 5 x 10 6 (n = 2), 10 7 (n = 2), 2 x 10 7 (n = 1), 3 x 10 7 (n = 2), 4 x 10 7 (n = 1), 6 x 10 7 (n = 2), 8 x 10 7 (n = 2) en 10 8 (n = 1) van de prostaatkanker cellijn PC3.
De verkregen gegevens worden samengevat in figuur 5 figuur 6. Verkregen gegevens spectrale en temporele resolutie worden getoond in Figuur 5A-D en Figuur 6A-D, met slechts een temporele resolutie voor elk molecuul waargenomen (Figuur 5E-H en Figuur 6E-H), en met slechts een spectrale resolutie (figuur 5I -L en figuur 5I-L). We hebben drie belangrijke gehyperpolariseerde signalen die [1- 13 C] pyruvaat, [1- 13 C] pyruvaat hydraat en [1- 13 C] lactaat waargenomen chemische verschuivingen bij 173 ppm, 181 ppm en 185 ppm, ongeveer relatieve de trimethylsilyl propaanzuur (TMSP) bij pH 7,4 en temperatuur 20 ° C. Het signaal verhoudingen tussen de drie metabolieten worden samengevat in tabel 1. De gegevens tonen een duidelijk verband tussen het lactaat signaal en het aantal cellen in het monster (Figuur 7). De resultatenuit de experimenten met minder dan 2 x 10 7 cellen vertonen aanzienlijke afwijking waarschijnlijk door een lage signaal-ruisverhouding. Daarom raden we het gebruik van meer cellen dan dit voor verdere experimenten. Wanneer het relatieve lactaat signaal (kinetische waarde) wordt genormaliseerd door het aantal cellen (Figuur 8), het toont duidelijk soortgelijke opname en metabolisme door heel de cellen. Echter, er is een trend van afnemende lactaatproductie per cel met een toenemend aantal cellen. Wij geloven dat een van de oorzaken van verminderde metabolische activiteit cel is een zeer hoge concentratie van cellen in een klein volume leidt tot een toegenomen viscositeit van het monster. De resultaten van de twee plaatsen omrekeningsverschillen model zijn samengevat in tabel 2 en figuur 9. De data volgen een trend vergelijkbaar met het vorige model: toenemende k PA → LAC met een toenemend aantal cellen. Echter, dit model resulterens in een steilere stijging van de kinetiek van het aantal cellen. Wanneer de stofwisseling koers kPa → LAC is genormaliseerd naar het aantal cellen, kunnen we weer zien een duidelijke trend van afnemende kPa → LAC met een toenemend aantal cellen (figuur 10).
Figuur 11 toont de mogelijkheid van het toevoegen van ruimtelijk lokaliseren om het experiment. Het toont een fantoom geïnjecteerd met 80 mmol / L hyperpolarized [1- 13 C] pyruvaat naast een 10 mol / L 13 C-ureum fantoom. De techniek maakt het mogelijk het bereiken van een spectrum met temporele en speciale resolutie (figuur 11A) of van het signaal verval van de gekozen metaboliet signalen in de tijd (figuur 11B). De spectra in het tijdsdomein ook samengevoegd tot een betere signaal-ruisverhouding (figuur 11C) te ontvangen. De speciale resolutie maakt de keuze van de gewenste frequentie regio of de 13C spectrum uit bepaalde metabolieten zoals [1- 13 C] pyruvaat (Figuur 11D) [1- 13 C] pyruvaat hydraat (figuur 11E), of verwijzing 13 C-ureum (Figuur 11F). Het kan worden co-geregistreerd beeld 1 uur. De pulssequentie gebruikt (EPSI) kan de verwerving van een beeld van de hele slice elke 4,9 s. Samenvattend, kan deze techniek gegevens met een ruimtelijke, temporele en spectrale resolutie voor elk metaboliet.
Figuur 3: Resultaten van een magnetron Sweep met [1- 13 C] pyruvaat op lokaal 3.35-T hyperpolarisator. Het resultaat van de metingen bepalen van de optimale frequentie de magnetron hyperpolarisatie snelheid van 13 C kernen maximaliseren de doelverbinding van [1- 13 C] pyruvaat. De magnetron sweep heeft een vorm van een EPR absorptiespectrum. De vorm en scheiding van de pieken op basis van de groep die (in dit geval, trityl groep), en de grootste invloed hebben een solide effect en thermische mengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Solid State Polarisatie is de vorming van een [1- 13 C] pyruvaat Sample. Een gemiddelde van n = 13 solid-state polarisatie buildups met de fout weergegeven door de standaarddeviatie gemeten elke 300 s voor maximaal 4.500 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Resultaten van de 13C NMR-spectroscopie van het aantal cellen (5 x 6-3 oktober x 10 7 cellen). De verkregen gegevens uitgezet met spectrale en temporele resolutie (AD), uitgezet met temporele resolutie alleen voor [1- 13 C] pyruvaat, [1- 13 C] pyruvaat hydrateren, en [1- 13 C] lactaat (EH), en uitgezet met slechts spectrale resolutie, het optellen van alle tijden stappen (IL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Resultaten van de 13C NMR-spectroscopie van het aantal cellen (4 x 07-01 oktober x 10 8 cellen). De verkregen gegevens uitgezet met spectrale en temporele resolutie (
Figuur 7: Resultaten van de Simple metaboliet Ratio Kinetic Modeling. Gegevens de verhouding van [1- 13 C] lactaat signaal aan de som van [1- 13 C] pyruvaat, [1- 13 C] pyruvaat hydraat en [1- 13 C] lactaat versus het aantal cellen in de experimenten. De fout stelt de standaardafwijking. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Resultaten van de Simple metaboliet Ratio Kinetic Modeling genormaliseerd naar het aantal cellen. De gegevens stellen de verhouding tussen de [1- 13 C] lactaat signaal aan de som van [1- 13 C] pyruvaat, [1- 13 C] pyruvaat hydraat en [1- 13 C] lactaat genormaliseerd naar het aantal cellen versus het aantal cellen in de experimenten. De fout stelt de standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: De resultaten van de twee eigen Exchange Differential Model. De gegevens repr ESENT de stofwisseling koers (k PA → LAC) versus het aantal cellen in de experimenten. De fout stelt de standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Resultaten van de Two-website Exchange Differential Model genormaliseerd naar het aantal cellen. De gegevens stellen de stofwisseling koers (kPa → LAC) genormaliseerd naar het aantal cellen versus het aantal cellen in de experimenten. De fout stelt de standaardafwijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Resultaat van Magnetic Resonance Imaging van het hypergepolariseerde [1- 13 C] pyruvaat Probe. A) Het spectrum verworven over de hele slice en alle tijd stappen. B) Het verval van de [1- 13 C] pyruvaat en [1- 13 C] pyruvaat hydraat signaal over de tijd. Het derde signaal wordt de 10 M 13 C-ureum lokalisatie referentie. C) Het spectrum verkregen van het gehele ruimtelijke en temporele resolutie. D) Het beeld 1H overtrok de 13C beeld van de opgetelde [1- 13 C] pyruvaat signaal over alle tijd stappen. E) Het beeld 1H overtrok de 13C beeld van de opgetelde [1- 13 C] pyruvaat hydrateren signaal over alle tijd stappen. F) Het beeld 1H bedekt met de <sup> 13 C beeld van de opgetelde 13 C-ureum signaal over all time stappen (referentie). De 13 C-signaal CE is genormaliseerd tot het maximum van het signaal van de specifieke metaboliet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gsm-nummer | ||||||||
| 5 x 10 6 (n = 2) | 10 7 (n = 2) | 2 x 10 7 (n = 1) | 3 x 10 7 (n = 2) | 4 x 10 7 (n = 1) | 6 x 10 7 (n = 2) | 8 x 10 7 (n = 2) | 10 8 (n = 1) | |
| [1- 13 C] pyruvaat | 92,9 ± 1,4 | 91,7 ± 1,0 | 86.7 | 77,5 ± 2,7 | 76 | 69,7 ± 0,5 | 65,9 ± 3,7 | 42.9 |
| [1- 13 C] pyruvaat hydrateren | 6.8 ± 1.2 | 6.7 ± 1.6 | 9.5 | 10,1 ± 1,8 | 8.9 | 7.7 ± 1.5 | 10,4 ± 0,2 | 13.4 |
| [1- 13 C] melk geven | 0,3 ± 0,3 | 1,6 ± 0,6 | 3.8 | 12,4 ± 4,5 | 15.1 | 22,5 ± 1,1 | 23,7 ± 3,5 | 43.7 |
Tabel 1: De relatieve verhouding gehyperpolariseerd metabolieten ten opzichte van het verschillend aantal cellen.
Tabel 2:De resultaten van de twee eigen Exchange Differential Model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
13 CMRSI met gehyperpolariseerde probes is een veelbelovende methode om metabolisme in real time in vitro en in vivo. Een belangrijk aspect bij toepassing van deze experimentele werkwijze is de juiste normalisatie, met name wat betreft in vitro experimenten. Ten eerste, de voorbereiding van het monster moet behoren en consistent worden gedaan met dezelfde concentratie gehyperpolariseerd materiaal bereiken elk experiment. Dit vereist een nauwkeurige weging van zowel het monster gehyperpolariseerde en de buffer zijn. Indien de concentratie niet correct is, de uiteindelijke pH van de oplossing is niet nauwkeurig, die invloed op T 1 en responsen van de cellen kan hebben. Het is ook van cruciaal belang om de cellen te behandelen zo gelijkmatig mogelijk. De cellen moeten altijd worden bereid op zodanige wijze dat er een minimale vertraging tussen celoogst en vervolgexperiment om de duur van de tijd de cellen met zeer hoge conc gehouden minimaliserenentration en een laag volume. Variatie in het celpreparaat protocol, zoals een ander preparaat tijden of temperaturen, kan leiden tot aanzienlijke variaties in de verkregen gegevens. Het mengen van het monster met de cellen moet worden gestandaardiseerd. Het is belangrijk om de tijd tussen de toevoegingen van de tracer aan de celsuspensie en het begin van de meting te meten, omdat deze kunnen variëren; tijdens de data-analyse, moet dit worden beschouwd.
De juiste keuze van de data-analyse en kinetische modellering is cruciaal in de interpretatie van de verkregen gegevens. Het simpele model is geschikt voor een lineaire one-way reactie met een constante wisselkoers van twee metabolieten. Zoals beschreven in de inleiding, pyruvaat ondergaat verschillende enzymatische reacties en, nog belangrijker, het ondergaat een niet-enzymatische omkeerbare-uitwisselingsreactie met pyruvaat hydraat. Deze reactie heeft een cruciale rol in de experimenten, en het effect is goed aangetoond in het experiment met 8 x 10 7 cellen. Hoewel Tabel 1 geeft aan dat de relatieve concentratie pyruvaat hydraat is vergelijkbaar met andere experimenten, wanneer nauw onderzocht in Figuur 6D toont een veel hogere pyruvaat hydraat signaal aan het begin van het experiment in vergelijking met de andere experimenten. Wanneer de tijdsresolutie wordt samengevat, deze belangrijke informatie verloren en veroorzaakt een fout in de reconstructie van de data. Anderzijds, de twee plaatsen omrekeningsverschillen model is een krachtiger en nauwkeurige beschrijving van de kinetiek omdat het ook de temporele resolutie in de berekening. Aldus omvat de niet-enzymatische uitwisseling met pyruvaat hydraat, ook al snel uitwisselt met pyruvaat tijdens de meting.
Er zijn verschillende beeldvormingsstrategieën kiezen tussen de gehyperpolariseerde signaal waarneemt of het metabolisme van een gehyperpolariseerd molecuul preclinica bijhoudenl en klinische studies. Durst et al. aangetoond dat de voor- en nadelen van verschillende puls sequnces 76. De volgorde vrije inductie verval chemical shift imaging (FIDCSI) is relatief robuust, maar heeft beperkt gebruik voor multi-slice en tijdelijk opgelost beeldvorming. Echo-vlakke spectroscopische beeldvorming (EPSI) is robuust voor het verloop kwesties en off-resonantie-effecten, maar het is gevoelig voor de wederopbouw artefacten. Het iteratieve ontleding van water en vet met echo asymmetrische en kleinste kwadraten schatting (IDEAL) 81, spiraal chemische verschuiving imaging (ISPCSI), pulssequentie 35, en spiraal chemische verschuiving imaging (SPCSI) hebben een hoge codering rendementen, maar zijn gevoelig voor B 0 inhomogeniteit. De keuze van de sequentie zullen afhangen van de scanner kenmerken, de biologische vraag en het systeem dat wordt onderzocht.
Er zijn veel eisen waaraan moet worden voldaan voor een succesvolle hyperpolarisatie. Echter, tHier zijn ook verschillende beperkingen die het hypergepolariseerde 13 CMRSI techniek tegenwoordig wordt geconfronteerd. De primaire en onveranderlijk beperking is de T1 relaxatietijd van de kern 13 C in het molecuul, waarbij de hoeveelheid detecteerbaar signaal beschikbaar is op een specifieke meetmoment definieert. Het signaal wordt verlaagd door elk RF excitatie dat een verlies van het signaal veroorzaakt hyperpolarisatie drukken tijdens de gegevensverwerving. Een andere beperking is het relatief lange tijdsperiode die nodig is om een molecuul hyperpolariseren. Dit duurt normaliter van 30 tot 90 minuten.
In vergelijking met andere technieken molecule beeldvorming, zoals [18 F] -FDG PET gaat gehyperpolariseerde 13 CMRSI geen tumoren met verhoogde glycolytische metabole routes en derhalve verhoogde consumptie glucose nodig. De techniek geeft een echte metabole flux in real time. Anderzijds, [18 F] -FDG PET geen directe informatie over temetabolisme maar slechts indirect informatie over accumulatie in het metabolisch actieve gebied. Dit zou een vals negatief resultaat, waarbij de tumor lijkt metabolisch inactief zijn, doch het gaat gebruiken verschillende metabole routes, zoals glutaminolysis, als koolstofbron proliferatie veroorzaken.
Concluderend kan oplossen DNP in diverse toepassingen worden gebruikt voor onderzoek een onbeperkte lijst van ziekten (zoals diabetes) 82, 15,36,45 meet pH, of monitor metabole veranderingen in diverse typen tumoren. Deze metingen kunnen worden uitgevoerd op verschillende niveaus, uit in vitro celexperimenten via preklinisch onderzoek bij diermodellen (zoals muizen, ratten, konijnen, varkens en honden), recente klinische studies 57. De toekomstige klinische toepassingen zal beschikken over een zeer krachtig en niet-invasieve diagnose-instrument dat niet alleen kon detecteren en lokaliseren van de ziekte, maar ook toestaan dat de observatie van de behandelingrespons in real time 83.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer | |
| GE/Agilent MR901 | GE Healthcare/Agilent Technologies | 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent | |
| Spinsolve Carbon | Magritek | 1 T NMR spectrometer with permanent magnet | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 7789-20-0 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monbasic | Sigma Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Disodium edetate | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | |
| Pyruvic acid - 13C1 | Cambridge Isotopes Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Dotarem (0.5 mmol/L) | Guerbet | gadoterate meglumine | |
| tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) | GE Healthcare | trityl radical used as a sourse of free electron | |
| PC3 cell line | ATCC | CRL1435 | |
| F-12K medium | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | SCRR-30-2020 | |
| Trypsine-EDTA Solution, 1x | ATCC | 30-2101 | |
| Sample plastic cup | Oxford Instruments | ||
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013-MSDS |
References
- Rohren, E. M., Turkington, T. G., Coleman, R. E.
- Overhauser, A. W.
- Carver, T. R., Slichter, C. P.
- Abragam, A., Proctor, W. G.
- Abragam, a, Goldman, M.
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Shimon, D., Hovav, Y., Feintuch, A., Goldfarb, D., Vega, S. Dynamic nuclear polarization in the solid state: a transition between the cross effect and the solid effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (16), 5729-5743 (2012).
- Serra, S. C., Rosso, A., Tedoldi, F. Electron and nuclear spin dynamics in the thermal mixing model of dynamic nuclear polarization. Phys. Chem. Chem. Phys. 14 (38), 13299-13308 (2012).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Brindle, K. M. Biomedical applications of hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55 (4), 285-295 (2009).
- Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Chen, A., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Hyperpolarized 13C metabolic imaging using dissolution dynamic nuclear polarization. J. Magn. Reson. Imaging. 36 (6), 1314-1328 (2012).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Golman, K., in't Zandt, R., Thaning, M.
- Comment, A., Rentsch, J., et al. Producing over 100 ml of highly concentrated hyperpolarized solution by means of dissolution DNP. J. Magn. Reson. 194 (1), 152-155 (2008).
- Brindle, K. M., Bohndiek, S. E., Gallagher, F. A., Kettunen, M. I. Tumor imaging using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Magn. Reson. Med. 66 (2), 505-519 (2011).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., Day, S. E., Lerche, M., Brindle, K. M. 13C MR spectroscopy measurements of glutaminase activity in human hepatocellular carcinoma cells using hyperpolarized 13C-labeled glutamine. Magn. Reson. Med. 60 (2), 253-257 (2008).
- Chen, A. P., Albers, M. J., et al. Hyperpolarized C-13 spectroscopic imaging of the TRAMP mouse at 3T-initial experience. Magn. Reson. Med. 58 (6), 1099-1106 (2007).
- Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
- Schroeder, M. A., Swietach, P., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovasc. Res. 86 (1), 82-91 (2010).
- Hurd, R. E., Yen, Y. -F., Tropp, J., Pfefferbaum, A., Spielman, D. M., Mayer, D. Cerebral dynamics and metabolism of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate using time-resolved MR spectroscopic imaging. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (13), 1734-1741 (2010).
- Golman, K., Zandt, R. I., Lerche, M., Pehrson, R., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Metabolic imaging by hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging for in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66 (22), 10855-10860 (2006).
- Park, I., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C magnetic resonance metabolic imaging: application to brain tumors. Neuro. Oncol. 12 (2), 133-144 (2010).
- Albers, M. J., Bok, R., et al. Hyperpolarized 13C lactate, pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers for prostate cancer detection and grading. Cancer Res. 68 (20), 8607-8615 (2008).
- Yen, Y. -F., Le Roux, P., et al. T(2) relaxation times of (13)C metabolites in a rat hepatocellular carcinoma model measured in vivo using (13)C-MRS of hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 23 (4), 414-423 (2010).
- Dafni, H., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopic imaging informs on hypoxia-inducible factor-1 and myc activity downstream of platelet-derived growth factor receptor. Cancer Res. 70 (19), 7400-7410 (2010).
- Ward, C. S., Venkatesh, H. S., et al. Noninvasive detection of target modulation following phosphatidylinositol 3-kinase inhibition using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. Cancer Res. 70 (4), 1296-1305 (2010).
- Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting response of rat C6 glioma tumors to radiotherapy using hyperpolarized [1- 13C]pyruvate and 13C magnetic resonance spectroscopic imaging. Magn. Reson. Med. 65 (2), 557-563 (2011).
- Johannesson, H., Macholl, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H. Dynamic Nuclear Polarization of [1-13C]pyruvic acid at 4.6 tesla. J. Magn. Reson. 197 (2), 167-175 (2009).
- Durst, M., Koellisch, U., et al. Bolus tracking for improved metabolic imaging of hyperpolarised compounds. J. Magn. Reson. 243, 40-46 (2014).
- Khegai, O., Schulte, R. F., et al. Apparent rate constant mapping using hyperpolarized [1-(13)C]pyruvate. NMR Biomed. 27 (10), 1256-1265 (2014).
- Sogaard, L. V., Schilling, F., Janich, M. A., Menzel, M. I., Ardenkjaer-Larsen, J. H. In vivo measurement of apparent diffusion coefficients of hyperpolarized (1)(3)C-labeled metabolites. NMR Biomed. 27 (5), 561-569 (2014).
- Aquaro, G. D., Frijia, F., et al. 3D CMR mapping of metabolism by hyperpolarized 13C-pyruvate in ischemia-reperfusion. JACC. Cardiovasc. Imaging. 6 (6), 743-744 (2013).
- Menzel, M. I., Farrell, E. V., et al. Multimodal assessment of in vivo metabolism with hyperpolarized [1-13C]MR spectroscopy and 18F-FDG PET imaging in hepatocellular carcinoma tumor-bearing rats. J. Nucl. Med. 54 (7), 1113-1119 (2013).
- Schilling, F., Duwel, S., et al. Diffusion of hyperpolarized (13) C-metabolites in tumor cell spheroids using real-time NMR spectroscopy. NMR Biomed. 26 (5), 557-568 (2013).
- Schulte, R. F., Sperl, J. I., et al. Saturation-recovery metabolic-exchange rate imaging with hyperpolarized [1-13C] pyruvate using spectral-spatial excitation. Magn. Reson. Med. 69 (5), 1209-1216 (2013).
- Wiesinger, F., Weidl, E., et al. IDEAL spiral CSI for dynamic metabolic MR imaging of hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Magn. Reson. Med. 68 (1), 8-16 (2012).
- Wilson, D. M., Keshari, K. R., et al. Multi-compound polarization by DNP allows simultaneous assessment of multiple enzymatic activities in vivo. J. Magn. Reson. 205 (1), 141-147 (2010).
- Schroeder, M. A., Atherton, H. J., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 23 (8), 2529-2538 (2009).
- Hurd, R. E., Yen, Y. -F., et al. Metabolic imaging in the anesthetized rat brain using hyperpolarized [1-13C] pyruvate and [1-13C] ethyl pyruvate. Magn. Reson. Med. 63 (5), 1137-1143 (2010).
- Chen, A. P., Kurhanewicz, J., et al. Feasibility of using hyperpolarized [1-13C]lactate as a substrate for in vivo metabolic 13C MRSI studies. Magn. Reson. Imaging. 26 (6), 721-726 (2008).
- Witney, T. H., Kettunen, M. I., et al. Detecting treatment response in a model of human breast adenocarcinoma using hyperpolarised [1-(13)C]pyruvate and. Br. J. Cancer. 103 (9), 1400-1406 (2010).
- Bohndiek, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to a vascular disrupting agent using hyperpolarized (13)C magnetic resonance spectroscopy. Mol. Cancer Ther. 9 (12), 3278-3288 (2010).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Production of hyperpolarized [1,4-13C2]malate from [1,4-13C2]fumarate is a marker of cell necrosis and treatment response in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (47), 19801-19806 (2009).
- Jensen, P. R., Peitersen, T., et al. Tissue-specific short chain fatty acid metabolism and slow metabolic recovery after ischemia from hyperpolarized NMR in vivo. J. Biol. Chem. 284 (52), 36077-36082 (2009).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate. Nature. 453 (7197), 940-943 (2008).
- Scholz, D. J., Janich, M. A., et al. Quantified pH imaging with hyperpolarized 13C-bicarbonate. Magn. Reson. Med. 73 (6), 2274-2282 (2015).
- Koellisch, U., Gringeri, C. V., et al. Metabolic imaging of hyperpolarized [1-(13) C]acetate and [1-(13) C]acetylcarnitine - investigation of the influence of dobutamine induced stress. Magn. Reson. Med. 74 (4), 1011-1018 (2015).
- Koellisch, U., Laustsen, C., et al. Investigation of metabolic changes in STZ-induced diabetic rats with hyperpolarized [1-13C]acetate. Physiol. Rep. 3 (8), (2015).
- Jensen, P. R., Meier, S., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Duus, J. O., Karlsson, M., Lerche, M. H. Detection of low-populated reaction intermediates with hyperpolarized NMR. Chem. Commun. (34), 5168-5170 (2009).
- Koelsch, B. L., Keshari, K. R., Peeters, T. H., Larson, P. E. Z., Wilson, D. M., Kurhanewicz, J. Diffusion MR of hyperpolarized 13C molecules in solution. Analyst. 138 (4), 1011-1014 (2013).
- Golman, K., Ardenkjaer-Larsen, J. H., Petersson, J. S., Mansson, S., Leunbach, I. Molecular imaging with endogenous substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (18), 10435-10439 (2003).
- von Morze, C., Larson, P. E. Z., et al. Imaging of Blood Flow Using Hyperpolarized [(13)C]Urea in Preclinical Cancer Models. J. Magn. Reson. Imaging. 33 (3), 692-697 (2011).
- Chiavazza, E., Kubala, E., et al. Earth's magnetic field enabled scalar coupling relaxation of 13C nuclei bound to fast-relaxing quadrupolar 14N in amide groups. J. Magn. Reson. 227, 35-38 (2013).
- Jensen, P. R., Karlsson, M., Meier, S., Duus, J., Lerche, M. H. Hyperpolarized amino acids for in vivo assays of transaminase activity. Chem. - A Eur. J. 15 (39), 10010-10012 (2009).
- Gallagher, F. A., Kettunen, M. I., et al. Detection of tumor glutamate metabolism in vivo using 13C magnetic resonance spectroscopy and hyperpolarized [1-13C]glutamate. Magn. Reson. Med. 66 (1), 18-23 (2011).
- Chaumeil, M. M., Larson, P. E. Z., et al. Hyperpolarized [1-13C] glutamate: a metabolic imaging biomarker of IDH1 mutational status in glioma. Cancer Res. 74 (16), 4247-4257 (2014).
- Keshari, K. R., Wilson, D. M. Chemistry and biochemistry of 13C hyperpolarized magnetic resonance using dynamic nuclear polarization. Chem. Soc. Rev. 43 (5), 1627-1659 (2014).
- Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Transl. Med. 5 (198), (2013).
- Warburg, O.
- Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. {Ü}ber den Stoffwechsel von Tumoren im K{ö}rper. Klin. Wochenschr. 5 (19), 829-832 (1926).
- Barnes, A. B., De Paepe, G., et al. High-Field Dynamic Nuclear Polarization for Solid and Solution. Biological NMR. Appl. Magn. Reson. 34 (3-4), 237-263 (2008).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Gatter, K. C., Harris, A. L. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 7 (1), 1-6 (2005).
- Golman, K., Petersson, J. S. Metabolic Imaging and Other Applications of Hyperpolarized 13C1. Acad. Radiol. 13 (8), 932-942 (2016).
- Golman, K., Petersson, J. S., et al. Cardiac metabolism measured noninvasively by hyperpolarized 13C MRI. Magn. Reson. Med. 59 (5), 1005-1013 (2008).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Jeffrey, F. M., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Hyperpolarized 13C allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (50), 19773-19777 (2007).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia NMR detection of hyperpolarized 13CO2 and H13CO3-. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1029-1036 (2008).
- Hu, S., Chen, A. P., et al. In vivo carbon-13 dynamic MRS and MRSI of normal and fasted rat liver with hyperpolarized 13C-pyruvate. Mol. imaging Biol. MIB Off. Publ. Acad. Mol. Imaging. 11 (6), 399-407 (2009).
- Kohler, S. J., Yen, Y., et al. In vivo 13 carbon metabolic imaging at 3T with hyperpolarized 13C-1-pyruvate. Magn. Reson. Med. 58 (1), 65-69 (2007).
- Hu, S., Lustig, M., et al. 3D compressed sensing for highly accelerated hyperpolarized (13)C MRSI with in vivo applications to transgenic mouse models of cancer. Magn. Reson. Med. 63 (2), 312-321 (2010).
- Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of cancer metabolism by imaging hyperpolarized nuclei: prospects for translation to clinical research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Schroeder, M. A., Cochlin, L. E., Heather, L. C., Clarke, K., Radda, G. K., Tyler, D. J. In vivo assessment of pyruvate dehydrogenase flux in the heart using hyperpolarized carbon-13 magnetic resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (33), 12051-12056 (2008).
- Zierhut, M. L., Yen, Y. -F., et al. Kinetic modeling of hyperpolarized 13C1-pyruvate metabolism in normal rats and TRAMP mice. J. Magn. Reson. 202 (1), 85-92 (2010).
- Dennis, L. K., Resnick, M. I. Analysis of recent trends in prostate cancer incidence and mortality. Prostate. 42 (4), 247-252 (2000).
- Jambor, I., Borra, R., et al. Functional imaging of localized prostate cancer aggressiveness using 11C-acetate PET/CT and 1H-MR spectroscopy. J. Nucl. Med. 51 (11), 1676-1683 (2010).
- Presti, J. C. J., Hricak, H., Narayan, P. A., Shinohara, K., White, S., Carroll, P. R. Local staging of prostatic carcinoma: comparison of transrectal sonography and endorectal MR imaging. AJR. Am. J. Roentgenol. 166 (1), 103-108 (1996).
- Schulte, R. F., Sacolick, L., et al. Transmit gain calibration for nonproton MR using the Bloch-Siegert shift. NMR Biomed. 24 (9), 1068-1072 (2011).
- Durst, M., Koellisch, U., et al. Comparison of acquisition schemes for hyperpolarised (1)(3)C imaging. NMR Biomed. 28 (6), 715-725 (2015).
- Janich, M. A., Menzel, M. I., et al. Effects of pyruvate dose on in vivo metabolism and quantification of hyperpolarized (1)(3)C spectra. NMR Biomed. 25 (1), 142-151 (2012).
- Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13 C NMR. NMR Biomed. 25 (11), 1286-1294 (2012).
- Gómez Damián, P. A., Sperl, J. I., et al. Multisite Kinetic Modeling of (13)C Metabolic MR Using [1-(13)C]Pyruvate. Radiol. Res. Pract. 2014, (2014).
- Talbot, J. -N., Gutman, F., et al. PET/CT in patients with hepatocellular carcinoma using [(18)F]fluorocholine: preliminary comparison with [(18)F]FDG PET/CT. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33 (11), 1285-1289 (2006).
- Reeder, S. B., Pineda, A. R., et al. Iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation (IDEAL): application with fast spin-echo imaging. Magn. Reson. Med. 54 (3), 636-644 (2005).
- Laustsen, C., Ostergaard, J. A., et al. Assessment of early diabetic renal changes with hyperpolarized [1-(13) C]pyruvate. Diabetes. Metab. Res. Rev. 29 (2), 125-129 (2013).
- Serrao, E. M., Brindle, K. M. Potential Clinical Roles for Metabolic Imaging with Hyperpolarized [1-(13)C]Pyruvate. Front. Oncol. 6, 59 (2016).
