Summary
İmünokompetan farelerde böbrek hücreli karsinom ortotopik bir model uygulanması Araştırmacı aynı hayvanda bir primer böbrek tümörü, akciğer metastazların varlığı ile tanımlanan bir klinik açıdan ilgili bir sistem elde edilir. Bu sistem, klinik öncesi, in vivo olarak tedaviler çeşitli test etmek için de kullanılabilir.
Abstract
Böbrek hücreli karsinom (RCC) ABD'de her yıl> 60.000 kişiyi etkiler ve ~ RCC hastalarının% 30'u tanı anda birden metastazları vardır. Metastatik RCC (mRCC'li) sadece 18 aylık bir medyan hayatta kalma süresi ile tedavi edilemez. Immün bazlı girişimler (örneğin, interferon (IFN) ve interlökin (IL) -2) mRCC'li hastaların bir kısmını dayanıklı yanıtları ve multikinaz inhibitörleri (örneğin, sunitinib veya sorafenib) indükleme veya anti-VEGF reseptör monoklonal antikorlar (mAb) olan büyük ölçüde tamamlandı olarak remisyonlar nadirdir, palyatif. mRCC'li hastalar için mevcut tedavilerin bu tür eksiklikleri yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesi için dayanak oluşturmaktadır. mRCC için yeni tedavilerin Ön klinik testlerde, bir temel bileşeni uygun bir hayvan modelidir. İnsan durum özetlemek Faydalı özellikleri, herhangi bir tedavi-kaynaklı bağışıklık effecto araştırmak için bir primer böbrek tümörü, böbrek tümörü metastaz ve bozulmamış bir bağışıklık sistemi,R yanıtları ve tümör kaynaklı bağışıklık faktör oluşumu. Bu rapor, bu özelliklerin hepsi var ortotopik mRCC'li fare modeli tarif etmektedir. Tümör böbrek (birincil site) büyüme ve akciğer (metastatik bölge) değerlendirilmesi ve ardından fare böbrek adenokarsinoma hücre hattı Renca kullanarak intrarenal implantasyon yöntemi açıklar.
Introduction
Böbrek hücreli karsinom (BHK), tüm dünyada bütün yetişkin habis tümörlerinin malign böbrek neoplazmaları çoğunluğu ve yaklaşık% 3, 1, 2 oluşturmaktadır. Semptomların olmaması, yanlış tanı ve RCC için yetersiz tarama araçları dolayı, hastaların yaklaşık% 30 bir metastatik adım 2'ye gören hastalar için ilave bir% 20-30 ile, teşhis sırasında metastatik RCC (mRCC'li) ile sunacaktır. Bu vakalar her yıl ~ 13.500 ölüm 1, 3 sonuçlanır. Daha önce tespit ve primer RCC tedavisi geliştirilmiş olsa da, RCC ile ilişkili ölüm oranı metastatik hastalık mortalite 3 büyük ölçüde sorumlu olduğunu düşündüren artmaya devam ediyor. RCC için Terapi geliştirme keşif ve hedef tedavilerin ve immunoterapilerin uygulanması ile son on yıl içinde ilerlemiştir. Ne yazık ki, progresyonsuz survivEl ve gelişmiş vakaların genel sağkalım hala hastalara 4, 5, 6 çoğunluğu için de altı 2 yıldır. Bu istatistikler daha da tanımlama içine araştırma ve RCC için etkili tedavilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı garanti. yeterince mRCC için terapötik girişimlerin ilerletmek için, hastalığın translasyon-alakalı klinik öncesi modellerde ilk gereklidir.
Bir açıdan tutarlı modelinin geliştirilmesi birkaç önemli soru ele almalıdır ilerlemiş RCC insan durumunu özetlemek için: 1) modeli anatomik alakalı mı; 2) İnsan patolojiye benzer tümör ilerleme mu; 3) metastazları primer tümörden kaynaklanan musunuz; ve 4) primer ve metastatik tümör ilerlemesi zamanla izlenebilir mi? tedavi türüne bağlı olarak, fare RCC tümör hücre çizgileri, insan RCC tümör hücre çizgileri ve insan RCC hasta türetilmiş xenog araştırılmaktadırsallar imünokompetan veya bağışıklık yetersizliği olan farelerde kullanılabilmektedir. Bir intakt ve işlevsel immün sistemi olan bir ana bilgisayar, Balb / c farelerinin 7 kendiliğinden bir böbrek adenokarsinomundan türetilen de tarif edilen Renca hücre hattının kullanılmasını gerektiren, immünoterapi bir yönü değerlendiren bu çalışmalar için gereklidir. Çalışmaların çoğu, deneysel akciğer "metastaz" 8, 9, 10, 11, 12 elde etmek için (iv), Balb / c farelerine intravenöz olarak kolay bir tedbir, yerel tümör oluşturur veya olarak RENCA hücreleri, deri altından (sc) enjekte. İnsan BHK model sc-implante Renca tümör kullanılması damar 13 doğru olmayan innervasyon içeren sınırlamalar bir sayıda vardır, mikro-14, 15, ve organ yetersizliği / tümör hücre Haberleşme farklılıklarasyon 13, 16. Buna ek olarak, pek çok sc tümörler (özellikle Renca), ortak bir klinik özellikler 17 olan bir olayın çalışma inhibe uzak organlarda metastaz. mRCC'li incelemek için, Renca hücreleri RCC hastalarında metastaz akciğerleri birincil konumda tümör yükünü kurmak için iv olarak enjekte edilebilir. Metastatik tümörler başlatılması iv enjeksiyon yöntemi, bununla birlikte, bir araştırma izin vermez nasıl, ne zaman, ya da hücre uzak bir alanda birincil organ (örneğin, böbrek) göç neden. Aynı hayvanda belirgin hem de primer ve metastatik hastalığı olan bir model, özellikle metastaz, tipik olarak, bu hastalarda ölüm nedeni olduğu göz önüne alındığında, ilerlemiş hastalığın ilerlemesini ve çalışma tedavisi için çok önemlidir.
Bizim laboratuvar yukarıda özetlenen tüm özellikleri barındıran mRCC bir fare modeli geliştirmiştir. pr kurmakimary, ortotopik tümörleri olarak RENCA hücreleri, saydam periton içinden hayvanın böbrek doğrudan implante edilir. sol böğürde küçük bir yarık (bir dönüm noktası olarak) dalak ve sol böbrek olarak gösterebilir. Bir küçük ölçekli bir iğne kullanarak, Renca tümör hücreleri ortotopik implantasyon için periton içinden böbrek içine doğrudan enjekte edilir. Böbrek kapsülü 18 altına olarak RENCA hücreleri, implante diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, implantasyon bu yöntem, dikilmesi gerektirmez, oldukça invazif olmayan, düşük ağrı sınıfına ait ise, ve zaman etkili olduğu kadar, yüksek bir verim sağlar uygulanan.
Akciğerlerde enjekte böbrekte çoğaltılabilir bir primer tümör yükü (~% 99 alım oranı) yanı sıra, metastatik tümör yükü bu iyi karakterize edilmiş bir model ile sonuçlanır. Bu modelin önemli avantajları immünoterapi araştırmalar için izin, genetik olarak özdeş doğasını içerir; onun spontane metastaz, bir çalışmadvanced hastalığı; ve orthotopik implantasyon, hastalığın ilerlemesi ve tedavisi ile ilgili anatomik etkisini modellemek için. RCC hedeflemeye yönelik Tedaviler büyük ölçüde klinik öncesi gelişimi sırasında bu modelin kullanımı yararlanacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, indükleyici ve deneysel ortotopik renal tümörler ve herhangi bir potansiyel kendiliğinden metastazlarının büyümesini izlemek için deneysel prosedür açıklanmaktadır. Aşağıdaki prosedürlerin tamamı deney hayvanlarının insancıl kullanımına ilişkin kurumsal politika ve onaylanmış prosedürlere uygun olarak yapılır.
Hücre Hatları 1. Bakım
- murin renal adenokarsinoma hücre hattı bakımı olarak RENCA, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 yılında ortam,% 10 fetal dana serumu (FCS),% 1 penisilin-streptomisin ve 1 mM ile desteklenmiş temel olmayan amino asitler, L-glutamin, her (komple RPMI anılacaktır), ve sodyum piruvat. Kültür, 37 ° C'de bir inkübatör içinde hücre ve% 5 CO2.
Not: kurulan herhangi bir hücre hattı olduğu gibi, uzun süreli kült sonra ortaya çıkabilecek herhangi bir fenotipik veya genetik değişiklikleri en aza indirmek için transfeksiyon ve sonradan yapılan bir implantasyon için düşük geçiş numarası olarak RENCA hücreleri, kullanılması önerilirobilyaları.- kararlı bir şekilde yeşil floresan proteininin (GFP) ve ateşböceği lusiferaz ifade etmek Renca hücrelerini mühendisi bir transpozon sistemi kullanın.
- Bir transposaz ifade vektörüne (pPGK-SB11) ve ateş böceği lusiferaz ifadesi için bir transpozon vektör kodlayan, hem de GFP için bir füzyon geni kodlama ve zeosin direnç geni ile, bir katyonik lipozom bazlı transfeksiyon reaktifi ko-transfekte Renca hücreleri kullanılarak bir iki yönlü promotöre (pKT2 / LuBiG) 19 transkripsiyonel kontrolü altında hem.
- İki gün sonra, bir sınırlayıcı seyreltme ile transfekte edilmiş hücrelerin plaka ve tam RPMI zeosin (300 ug / ml) ile desteklenmiş hücreler genişletilmesine izin verir. Akış sitometrisi ile her klon GFP ifade kontrol edin. Bu hücreler Renca-GL adlandırılır.
NOT: Sınırlayıcı seyreltme klonlama tek hücreden türetilen üzere seçilen hücrelerin izin verecektir.
- kararlı bir şekilde yeşil floresan proteininin (GFP) ve ateşböceği lusiferaz ifade etmek Renca hücrelerini mühendisi bir transpozon sistemi kullanın.
- intrarenally Renca hücrelerini implant için, Renca hücrelerini i hazırlamakHank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 2 x 10 6 hücre / mL bir tek hücre süspansiyonu nto.
- HBSS içinde% 0.25 tripsin kullanılarak doku kültürü şişesi yapışık olarak RENCA hücreleri, kaldırın. ~ 5 dakika sonra, tripsin nötralize ve yıkama için bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak için şişeye tam RPMI ekleyin. Santrifüj 25 ° C'de 5 dakika boyunca 300 nispi santrifüj g kuvveti (RCF xg) hücreleri.
- Üstte kalan HBSS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve / mL, 2 x 10 6 hücre elde etmek için HBSS ile ses seviyesini ayarlamak.
- hücreleri üzerinde kesilme baskısı önlemek için bir 18 gauge iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga içine hücreleri çizin. Tümör hücrelerinin enjeksiyondan önce bir 28 gauge iğne ile 18 gauge iğne değiştirin. 0.1 mL bir enjeksiyon böbrek içine 2 x 10 5 hücre sunar.
2. Cerrahi Alan Hazırlık
- Steril cerrahi hazırlayınbir ısıtma pedi üzerinden steril bir cerrahi örtü yerleştirerek bir biyo-güvenlik kabini içinde alanı. Forseps, neşter, makas, göz damlası,% 5 povidon-iyodin antiseptik ve steril gazlı bez içeren tüm malzemeleri, toplayın. Kullanmadan önce tüm enstrümanları otoklavlayın.
- Bir aseptik uç tekniği kullanılarak ameliyat gerçekleştirin. bir kordon sterilizatör ile hayvanlar arasında sterilize araçlar. Steril eldiven, bir laboratuvar önlüğü ve bir yüz maskesi takın.
3. Hayvan hazırlanması
- kurumsal kurallarına göre (sırasıyla 87.5 mg / kg ve 12.5 mg / kg, ip), ketamin / ksilazin ile fareler anestezi. Bir ayak tutam yaparak anestezi derinliğinin tespit edilmesi.
- Hayvan duyarlı olmayan göz önüne alındığında, (parmaklarla) koparma veya tıraş kürk (makası kullanılarak) ile Balb / c farelerinde enjeksiyon yeri (örneğin, sol yan) hazırlanması.
- Cerrahi alana (örneğin, mahfaza kafesi) cerrahi hazırlık alan farelerin taşı ve veteriner merhem uygulamakGözleri kuruluğunu önlemek için. Bolca% 5 povidon-iyodin antiseptik ile hazırlanan kesi çubukla.
- kesik, bir ameliyat öncesi analjezi gibi yapılacaktır alanına bupivakain hidroklorür (2.5 mg / ml çözelti, sc 0.1 mL) enjekte edilir.
- dikkatli şekilde periton nüfuz için, steril bir bisturi makas ile hayvanın sol kanattan - (1.5 cm-1.0) tek bir kesi olun. Steril makas ile periton dermis ayırın. Hiç kan kaldırmak için steril gazlı bez ile kesi sitesini sürün.
- kanadını desteklemek için baş ve sağ elini tutmak için sol elini kullanan iki eliyle fareyi tutun.
- alttan fareyi palpe, sağ elinin bir parmağı ile, periton üzerinden dalak belirlemek ve; Böbrek hemen periton içinden görünür olmalıdır. Periton ve böbrek genelinde gerginliği sağlamak için hayvanın sıkı bir duruş tutun.
- ikinci bir kişi tümör ce enjekte ettinizrf (Bölüm 1.2'de hazırlanan). sağlam periton içinden bir 28 gauge iğne ile donatılmış bir 1 ml hava ile böbrek merkezine. Yavaş yavaş hücreler 0.1 mL (2 x 10 5) sağlar. 10, hücrelerin geri akışını azaltmak için - hücreleri enjekte edilir kez 5 için, iğneyi yerinde tutun. Hücreler enjekte kişi fare tutan kişinin parmakları yakın içine iğne getirerek olabileceğinden bu adımı sırasında son derece dikkatli ihtiyacını dikkat etmek önemlidir.
- iğne çıkarın ve siyanoakrilat doku ince bir yapışkan tabakası ile kesiğin kapatılması.
- Steril bir kağıt havlu ile temiz kafesine geri hayvan yerleştirin. hayvanlar ısıtıcı bir ped üzerine kurtarmak için izin verin. iyileşme döneminde sahipsiz hayvanları bırakmayın. onlar dik ve sternal kadar standart konut koşulları hayvanları iade etmeyin. laboratuvar hayvanları kullanan tüm prosedürlerde kurumsal yönergeleri izleyin.
4. Biyolüminesan Görüntüleme
- biyolüminesans görüntüleme tümör büyümesini izleyin.
NOT: biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirmek için Usul ayrıntıları Lim ve arkadaşlarının elde edilebilir. 20 Lusiferaz sinyal Tümör hücresi implantasyonundan sonra kadar erken 24 olarak h tespit edilebilir. Bu modelde hiçbir harici olarak görünür tümör olduğu gibi, periyodik tümör büyümesini izlemek için esastır. tasarlanmış deney bağlı olarak, ortotopik tümör büyümesi, değişen zaman uzunlukları için devam edebilirsiniz. lusiferaz ifade Renca hücrelerini kullanmanın bir yararı tümör büyümesi defalarca deney süresi boyunca düzenli aralıklarla aynı hayvanda izlenebilir ve tümör taşıyan ve tümör içermeyen organların belirli bir sorgulama bir yapılabilir olmasıdır bir bitiş noktası.- lusiferin ip (steril PBS içinde 15 mg / ml solüsyon, 0.1 mL) enjekte edilir ve bu biyoışıldama görüntüleme sistemine fare yerleştirmeden önce, 10 dakika süreyle sirküle edilmektedir. mo yerleştirin dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde kullanmak, yukarı gelecek şekilde enjekte böbrek sahip olmak amacıyla, yan hafif devirdi.
- Görüntü analiz yazılımı kullanılarak (ROI), tanımlanmış bir bölge içinde, ikinci (foton akısı) başına yayılan ışığın foton tümör yükünü ölçün.
- Bireysel organlarda tümör yükünün Kantifikasyonu.
Not: kantitasyonu Öldürülen farelerin çıkarılmalarından sonra, tek tek organların tanımlanan zaman noktalarında gerçekleştirilebilir.- Adım 4.1'de olduğu gibi, lusiferin ile fareler enjekte edilir.
- 10 dakika sonra, onaylanmış bir prosedür kullanılarak fareler euthanize.
- Ilgi organları teşrih (örneğin böbrekler ve akciğerler aşağıda 5. bölüme bakın). 35 x 10 mm Petri kapları doku aktarın ve biyolüminesans görüntüleme sistemi içine koyun.
- Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, tanımlanmış bir ROI içinde ikinci (foton akısı) başına yayılan ışığın foton tümör yükünü ölçün.
- Bireysel bir deney için tanımlanan son noktada, tercih edilen kurumsal rehberlere (örneğin CO2, servikal dislokasyon, anestezi doz) 'e göre, tümör taşıyan farelerin euthanize. Akciğerler Hint mürekkebi enflasyonu sonra toplanacak olan Bununla birlikte, servikal dislokasyon kaçının.
- Islak Organ ağırlıkları ölçülerek enjekte böbrekte primer böbrek tümör büyümesinin önemli bir tayinini gerçekleştirin.
- (G cinsinden), tümör kütlesini belirlemek için, 21 izole etmek ve tümör taşıyan böbrek ve böbrek ağırlıkları arasındaki fark, tümör kitlesini tanımlar aynı farenin, kontralateral böbrek tartın. Dikkatle onların ağırlıklarını ölçmek önce kesilmiştir böbreklerden gelen hiçbir yabancı bağ dokusu teşrih.
- Fekete en çözeltide akciğerleri Hindistan mürekkebi önce eksizyona ile akciğerlere şişirme ve derhal düzelterek akciğerlere tümör metastazı derecesini değerlendirinlass = "xref"> 22. Akciğer yüzeyinde metastatik lezyonların Manuel hesaplama sonra yapılabilir.
- göğüs kafesi üzerinden orta karın başlayan makas kullanılarak orta hat kesi, olun ve yukarı boyun / tükürük bezleri aracılığıyla. Dikkatle akciğer dokusunun ödün vermeden, makasları ve forsepsler kullanılarak göğüs kafesi çıkarın.
- Bağ doku kaldırarak trakea Açığa.
- HBSS içinde% 10 Hint mürekkebi çözeltisi ile doldurulmuş bir 18 gauge iğne ile 3 ml'lik bir şırınga hazırlayın.
- Forseps kullanarak dikkatli trakea altındaki bir ipek sütür iplik. Bu kez şişirilmiş trakea kapalı kravat kullanılacaktır.
- Dikkatle trakea aşağı iğneyi yavaşça Hindistan mürekkep çözeltisiyle akciğerleri şişirmek için şırıngayı düşürmek. Yaklaşık 1 - Hindistan mürekkep çözeltisinin 1.5 ml tam akciğerleri şişirir.
- mürekkep geri akışını önlemek için bir iğneye göre dikiş ile, çok sayıda düğüm bağlayarak kapamak trakea sıkıştırın.
- removE, iğne ve dikkatli bir şekilde şişirilmiş akciğerlere kaldırmak için, bağ doku kesip.
- Kimyasal bir davlumbaz olarak, 5 ml Fekete çözeltisinin ihtiva eden bir 15 mL konik tüp içine akciğerlere yer (% 95 EtOH 35 mL, dH 2 O 15 mL, formaldehit 5 ml ve buzlu asidik asit 2.5 mL 100 mL'lik bir cam şişe) 23.
- Oda sıcaklığında 48 saat önce el ile boyası tümör nodülü sayım - Akciğerler 24 için / destain düzeltmek için izin verir.
- lekenin sonra bozulmadan akciğerlere çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir 35 x 10 mm Petri kabındaki lob sabit akciğerler incelemek. bir mikroskop altında her bir lob tümör nodüllerinin sayısı (beyaz nodüller) sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renca hücrelerinin Başarılı implantasyon farelerin akciğerlerine böbrek ve metastazı tümör gelişiminde sonuçlanacaktır. Tümör taşıyan ve karşı böbreklerin eksizyonu sonra ıslak doku ağırlığı (g) daha fazla ağırlık olarak (Şekil 1) göre tümör yükünü göstermek için ölçüldü. Renca tümörler sitokeratin 8 ve 18 boyama (Şekil 2) ile imünohistokimya ile tespit edilebilir. uzunlamasına çalışmaları için, bir lusiferaz sentezleyen Renca hücre hattı implante edildi. Biyoluminesen görüntüleme tümör yükünü ve zaman (Şekil 3A) üzerinde tedaviye yanıtı izlemek için bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Akciğerlere Metastaz biyolüminesans görüntüleme (Şekil 3B) ve Hindistan mürekkep akciğer enflasyonu (Şekil 3C) tarafından doğrulandı.
s / ftp_upload / 55080 / 55080fig1.jpg"/>
Renca tümör hücrelerinin Şekil 1. Ortotopik implantasyon büyük bir renal kitle oluşturur. Renca GL hücreleri (0.1 içinde 2 x 10 5 ml) intrarenally enjekte edildi ve gram (± SEM) olarak kesilmiş tümör taşıyan böbrek ve tümörsüz karşı böbreklerin ağırlıkları günlük 24, n = 15, tümöre üzerinde belirlendi özgür ve tümör taşıyan böbrekler. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. immünofloresan tümörsüz kontralateral ve tümör taşıyan böbreklerde mikroskopik görüntü. Renca GL hücreleri (0.1 ml içinde 2 x 10 5) intrarenally enjekte edildi ve tümör taşıyan ve tümörsüz böbrekler gün böbrekler aniden dondurulmuştur ve 12. toplandı ve immunof için işlenmiştirluorescence görüntüleme 8 ve 18 ve CD31 sitokeratin, kollajen yerini görselleştirmek için. 10x resim alınır ve tüm tümör taşıyan böbrek görüntülemek için birlikte dikilmiştir. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Renca tümör hücrelerinin Şekil 3. Ortotopik implantasyon spontan akciğer metastazı yol açar. C. Renca GL hücreleri (0.1 mL, 2 x 10 5), Balb / c farelerine intrarenally enjekte edilmiştir. Biyolüminesans görüntüleri belirtilen günlerde alınmıştır. B. 23. günde, tümör içermeyen ve tümör taşıyan farelerden alınan akciğerler çıkarılmış ve biyolüminesans görüntüleri alındı. 23. günde farelerin C. Paralel setleri akciğerleri akciğer tümörü nodüller görselleştirmek için çini mürekkebi ile şişirilmiş almıştı.Ölçek çubukları = 1 cm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz ortotopik RCC fare modeli için bir protokol mevcut. fare böbrek içine fare renal adenokarsinoma tümör hücrelerinin implantasyonu mRCC bir klinik açıdan ilgili bir model sağlar. Bu model gelişmiş RCC özellikleridir her ikisi de akciğerlerinde böbrek ve uzak metastaz içinde birincil tümörün sonuçlanır. Burada sunulan açıklama, bağışıklığı Balb / c farelerinde Renca hücre hattı için spesifiktir. Bu orthotopik modeli kullanarak, tedavi edici testler 17, 24, 25, 26, 27 için bu modelin yararlılığını gösteren, Renca tümörler immünoterapi duyarlı olduklarını göstermiştir. implantasyon için bir sinjeneik tümör hücre hattı kullanma yeteneği bir immünolojik hayvanda tümör progresyonunu okuyan bir avantaj sağlar. Singeneik, ortotopik ve klinik olarak ilgili characteBu sistemin sosyodemografik ilgili bir ön-klinik modelinde tedavilerin test edilmesine olanak üstün bir model sunmaktadır. Bu tümörler subkutan olarak implante edilen zaman çoğaltılan edilemez. Böyle bir modelleme sistemi, anti-tümör immün yanıtları veya RCC tedavisi için çeşitli immünoterapetik yaklaşımları değerlendirmek için sınırlı olmadığını belirtmek önemlidir. Bu bağışıklık eksikliği olan farelere intrarenally implante edilmiş insan tümör hücrelerini kullanmak mümkün olur, deney tipine bağlı olarak yürütülen. Tüm hayvanlar, aynı zamanda tümör hücrelerinin eşit sayısı ile implante edilebilir, in vitro olarak kültürlenebilir kurulan BHK hücre hatları mevcudiyeti, bu in vivo ortotopik bir model tekrarlanabilirliği geliştirir. Bundan başka, tümör hücreleri hücrelerin büyümesine nasıl kontrol etmek ve / veya çevresel sinyallere yanıt imkanı sunan önce böbrek içi implantasyon in vitro olarak manipüle edilebilir. Bu (ve en çok) implan ile bir sınırlamamasa tümör modelleri bunlar tümör oluşumu, genetik olarak otokton tümörlerin oluşumu için tasarlanmış bir fare modeli kullanılarak elde edilene bir yararı sorumlu erken olayları aşmak olmasıdır.
ortotopik bir model bir sakıncası, tümör büyümesini görselleştirmek için genel yetersizlik, kolayca kaliper ölçümü ile sc tümör için izlenen bir özelliktir. genetik mühendisliği tümör hücrelerini ve biyolüminesans görüntüleme kullanılarak Güncel teknoloji iç tümörlerin uzunlamasına ölçümler için izin verir. Bu biyolojik olarak ışık veren görüntüleme ve / veya organ çıkarma 17, 24, 25 göre çeşitli zaman noktalarında primer böbrek tümörü ve metastatik yükü belirleme yeteneği göstermiştir. Bizim modelinin bir mukavemet GFP ve lusiferaz ifade Renca hücre hattının kullanılabilirliği, ama modeli başarı için bu özelliği gerektirmez. Biz karakterize olan veyaEbeveyn Renca ve Renca GL hem hücreleri ile thotopic BHK modeli. Renca GL hücrelerinin implantasyonu takiben primer tümörler hemen biyolojik olarak ışık veren görüntüleme ile ölçülebilir. Primer tümör metastaz sitesinden yayılan olabilir alt sinyalleri ağır geliyorsa bir sinyal üretebilir, ancak, bütün hayvan metastazları izlemek için zor olabilir. Excising ve bütün hayvandan bireysel organları görüntüleme bu organlarda metastaz görselleştirme ve ölçümü için izin verir. Kesilerek çıkarılmış akciğer dokusu 17 lüminesanı tarafından görüldüğü gibi Renca ortotopik bir model olarak, primer böbrek tümörü, hayvanlar gibi erken 7 gün sonra implant akciğerlerinde kendiliğinden mikro metastaz oluştururlar.
Bu sistemde, bir lusiferaz sentezleyen tümör hücre çizgisinin kullanılması, aynı hayvanda uzunlamasına tümör ilerlemesini izlemek için bir olanak tanır, aynı zamanda değerlendirme, için bir olanak tanırİmplantasyon tekniğinin hassas e. fare böbreği böbrek yoluyla direkt olarak periton içine, tümör hücresinin enjekte edilmesi için, uzun bir iğne ile, özellikle de mümkün kılar, küçük bir anatomik bir yapıdır. enjeksiyon birkaç gün içinde fare Görüntüleme tümör hücrelerinin implantasyonu böbrek lokalize edildiği ölçüde belirler. İntrarenal enjeksiyon karmaşık hale getirebilir başka özelliği hayvan yaşlandıkça birikebilir visseral yağ bir zenginliği, varlığıdır. Böbrek zayıf fare periton üzerinden kolaylıkla görülebilir, ancak böbrek zamanla gelişebilir visseral yağ lob altında gizlenmiş olabilir.
Belirli bir deneyin sonunda, değerlendirmeler arasında bir sayı tüm vücut tümör yükünü belirlemek için kullanılabilir. eksize organların biyoluminesen görüntüleme tümör yükünün objektif olarak ölçer. Primer tümörlerin ıslak ağırlık karşı kidne normalizeBir iç kontrol olarak, y, bir toplu kütle ölçümü sağlar. Akciğerde metastatik yükü de Diseksiyon mikroskop kullanarak beyaz akciğer tümör nodüllerinin görünüm için izin blok halinde Hindistan mürekkeple akciğerleri şişirerek belirlenebilir. Bu okumalar ilaç geliştirme klinik öncesi aşamada terapötik etkinliğini araştırmak için bir temel olarak kullanılabilir, toplam vücut tümör yükünü, kurabilir. Renca GL hücreleri tarafından GFP ekspresyonu sitometrik tümör taşıyan dokuların analiz akış için çok uygundur. tedavinin bir sonucu olarak üretilen bir immünolojik yanıtın bileşimi ve büyüklüğünü araştıran özellikle, ancak, dikkatli, tümör taşıyan böbreğin herhangi bir akış sitometrik değerlendirilmesi için kullanılmak zorundadır. Böbrekler bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi (ya yanlısı tümör veya anti-tümör) tüm tümör taşıyan böbreklerde "doku ve damar sistemi lokalize hem içereceğini büyük olasılıkla, yüksek oranda damar organlardırd" Organ hasat zamanında bağışıklık hücreleri. Kan immün hücrelere karşı dokuyu ayırmak için, florokrom etiketli anti-CD45.2 monoklonal antikor (mAb) ötenazi önce iv enjekte bir teknik kullanmaktadır. böbrekler daha sonra akışı için hazırlanır farklı florokrom etiketli anti-CD45.2 mAb 28, 29. Çift CD45.2 boyama hasat zamanında dokusundan damar içindeki hücrelerin ayrıştırılmasını ile ex vivo olarak boyanmasını içeren sitometrisi. Bu basit protokol, ana lökosit tanımlanmasını sağlar aksi dokularda adaptif ve immün yanıtların yorumunu yanıltabilecek damar sistemi içerisinde yer alan soy. Bu protokol ayrıca, 29 istenmeyen sonuçları 28 olabilir perfüzyon ihtiyacını ortadan kaldırır.
artmış için takdir ve immünoterapi kullanımı şu an için yokturKanseri tedavi etmek. mRCC (ve diğer kanserler) için gelecek immünolojik temelli tedavilerin geliştirilmesi bir clinically- ve fizyolojik-alakalı modeli kullanılarak laboratuvarda başlar. Burada tarif edilen ortotopik RCC modeli tedavi modalitelerinin çeşitli etkinliğini test etmek için temel özellikleri (tümör büyümesi uzunlamasına izlenmesi için, örneğin, primer böbrek tümörü, uzak metastaz tümör kaynaklı bağışıklık bastırma, ve parçaları) bir dizi içerir. Aynı zamanda, bu model, cerrahi ve / veya fokal terapi protokolleri gibi RCC, tedavi etmek için başka yollarla gelişmeleri değerlendirmek için gelecekte adapte edilebileceğini kurgulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (R15CA173657 AW ve TSG konusunda R01CA109446 için), (AW) Simmons Kanser Enstitüsü ve Minnestoa Üniversitesi'nden hibe (TSG konusunda) 4 Böbrek Kanseri Vakfı'na tırmanın tarafından desteklenmiştir. Biz immünflörosans yardım için Dr Kristin Anderson teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
- Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
- Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
- Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
- Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
- Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
- Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
- Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
- Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
- Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
- VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
- Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
- Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
- Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
- Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
- Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
- James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
- James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
- James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
- Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
- Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).
