Summary
在免疫活性小鼠肾细胞癌的原位模型的实现，得到研究者通过初级肾肿瘤和肺转移瘤的在相同的动物的存在所定义的临床相关系统。该系统可用于临床前测试各种体内治疗。
Abstract
肾细胞癌（RCC）每年影响> 60000人在美国，和RCC〜30％的患者在诊断时多发转移。转移性肾细胞癌（MRCC）是不治之症，与只有18个月的中位生存时间。基于免疫的干预（ 例如，干扰素（IFN）和白细胞介素（IL）-2）诱导的mRCC患者的一小部分持续反应，和多激酶抑制剂（ 例如，舒尼替尼或索拉非尼）或抗VEGF受体的单克隆抗体（单抗）是主要是治标不治本，因为完全缓解是罕见的。在目前的治疗对于患者mRCC的这些缺点提供的新颖的治疗方案的开发的理由。在新的疗法用于mRCC的临床前检测的关键部件是一个合适的动物模型。重演人的条件有益特征包括原发性肾肿瘤，肾肿瘤转移，和一个完整的免疫系统，以调查任何治疗驱动的免疫效：ř反应和肿瘤诱导的免疫抑制因子的形成。这份报告描述了具有所有这些特征的原位mRCC的小鼠模型。我们描述使用鼠标肾腺癌细胞系的Renca一个肾内注入技术，随后在肾（原发部位）肿瘤生长和肺（转移部位）的评估。
Introduction
肾细胞癌（RCC）占全世界大多数恶性肾肿瘤的和约3％所有成年恶性肿瘤的1，2。由于缺乏症状，误诊，和不足的筛选工具，用于RCC，患者几乎30％将呈现与转移性RCC（MRCC）在诊断时，与患者进展至转移期2 20-30％的额外。这些情况导致每年〜13500人死亡1，3。虽然早期检测和治疗原发性RCC的有所改善，RCC相关的死亡的速率持续增加，这表明转移性疾病是死亡3的主要原因。治疗发展RCC已经发展了与发现并实施有针对性的治疗和免疫治疗的最后十年。不幸的是，无进展surviv人与晚期病例总生存率仍远低于2年，大多数患者4，5，6。这些统计数据为保证进一步研究的识别和对RCC有效的治疗方法发展的需要。为了充分促进治疗性干预在一项针对mRCC，首先需要疾病的翻译相关的临床前模型。
相关的和一致的模型的发展概括晚期RCC人的条件应解决几个关键问题：1）是模型解剖相关; 2）是否肿瘤进展类似于人体病理学; 3）执行转移从原发肿瘤出现;及4）可原发性和转移性肿瘤进展随时间监测？根据治疗的类型被调查，小鼠RCC肿瘤细胞系，人肾细胞癌的肿瘤细胞系，和人RCC患者来源xenog筏可在免疫活性或免疫缺陷的小鼠中。具有完整和功能性免疫系统中的主机需要这些研究评估免疫疗法的一些方面中，需要使用来自Balb / c小鼠7的自发肾腺癌导出的充分描述的Renca细胞系。大多数研究注入RENCA细胞皮下（sc），其形成一个易于度量局部肿瘤，或静脉内（IV）到Balb / c小鼠，以产生实验性肺“转移” 8，9，10，11，12。的SC-植入的Renca肿瘤模型人RCC的使用具有许多限制，包括脉管系统13的不准确的神经支配，在微环境14，15，和缺乏器官/肿瘤细胞COMMUNIC差异通货膨胀13,16。此外，许多皮下肿瘤（特别的Renca）不会转移到远端器官，抑制这是一种常见的临床特征17事件的研究。为了研究mRCC的，RENCA细胞可以静脉注射以建立在RCC患者转移肺-主要位置肿瘤负荷。发起转移性肿瘤的静脉内注射的方法，然而，不允许的侦查如何，何时，或为什么细胞已经从初级器官（ 即，肾）到远端部位迁移。与原发性和转移性疾病明显在相同的动物模型是研究晚期疾病的进展和治疗是至关重要的，尤其是考虑到转移通常在这些患者中的死亡率的原因。
我们的实验室已开发海上救援协调中心的鼠模型，结合了所有上述功能。要建立公关imary，原位肿瘤，的Renca细胞直接植入到动物的透过半透明腹膜肾。在左侧面一个小切口允许脾（如地标）和左肾的可视化。使用小规格针，的Renca肿瘤细胞通过腹膜用于原位移植直接注射到肾脏。相比植入肾囊18的下方的Renca细胞的其它方法中，注入的这个方法允许更高的吞吐量，因为它是相当的非侵入性的，并不需要缝合，是一种低疼痛类的，而且是时间有效时实践。
这充分表征的模型的结果在注射肾再现的原发性肿瘤负担（〜99％的接受率），以及转移性肿瘤负荷于肺部。这种模式的优点显著包括它的同源性质，允许免疫治疗调查;其自发转移，以研究疾病的先进适用的;其原位移植，来模拟对疾病进展和治疗解剖的影响。旨在针对RCC的治疗会从这个模型的临床前开发过程中的利用率大大受益。
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Protocol
以下方案描述用于诱导和监测实验原位肾肿瘤和任何潜在自发转移的生长的实验程序。下面的所有程序都是按照有关人性化的使用实验动物的体制政策和批准的程序进行。
1.细胞系的维护
- 维持鼠肾腺癌细胞系的Renca，在的Roswell Park Memorial研究所（RPMI）1640培养基补充有10％胎牛血清（FCS），1％青霉素 - 链霉素，和各1mM的非必需氨基酸，L-谷氨酰胺的和丙酮酸钠（简称完全RPMI）。培养细胞在培养箱中在37℃和5％CO 2。
注意：与任何建立的细胞系，则建议使用低传代数RENCA细胞用于转染和随后的注入，以最小化长期崇拜后可能发生的任何表型或遗传变化URE。- 使用转座子系统工程师RENCA细胞稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶。
- 使用阳离子基于脂质体的转染试剂，共转染的Renca细胞与转座酶表达载体（PPGK-SB11）和萤火虫萤光素酶的表达的转座子载体编码，以及一个编码GFP融合基因和zeocin抗性基因，两者的双向启动子（PKT2 / LuBiG）19的转录控制下。
- 两天后，板转染的细胞以有限稀释并允许细胞扩大的完全RPMI补充有博莱霉素（300微克/毫升）。确认在通过流式细胞术每个克隆GFP表达。这些细胞被称为的Renca-GL。
注：限制稀释克隆将允许从单个细胞衍生的所选单元格。
- 使用转座子系统工程师RENCA细胞稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶。
- 植入RENCA细胞肾内，制备RENCA细胞我n要在Hank氏平衡盐溶液（HBSS）以2×10 6个细胞/ mL的单细胞悬浮液。
- 使用0.25％胰蛋白酶在HBSS中的组织培养瓶中除去粘附在表面的Renca细胞。约5分钟后，完全RPMI添加到该烧瓶中以中和胰蛋白酶，将细胞转移到一个离心管中进行洗涤。离心将细胞在300相对离心克力（RCF×g）离心5分钟，在25℃下。
- 倒出上清液和重悬细胞，在HBSS中。计数使用血球的细胞，并用HBSS调节音量，得到2×10 6细胞/ mL。
- 绘制细胞成1毫升注射器装配有18号针头，以防止对细胞的剪切应力。替换前的肿瘤细胞的注射一个28号针头，18号针头。 0.1毫升的注射递送2×10 5个细胞入肾。
2.手术区准备
- 准备无菌手术区在生物安全柜通过将无菌手术单过一个加热垫。收集所有用品，包括镊子，解剖刀，剪刀，滴眼剂，5％聚维酮碘防腐剂，和无菌纱布。高压灭菌器使用前所有仪器。
- 执行使用无菌尖端技术的手术。动物之间重新消毒文书，珠灭菌。戴上无菌手套，白大褂和口罩。
3.动物的制备
- 麻醉用根据机构指南氯胺酮/赛拉嗪（87.5 mg / kg和12.5毫克/千克，分别，腹膜内）的小鼠。通过执行脚趾捏确定麻醉深度。
- 当动物被认为是无反应，由拔除（用手指）或剃须（使用裁切机）的皮毛上准备Balb / c小鼠注射部位（ 例如，左侧面）。
- 从手术准备区移动小鼠（ 例如，房栊）到手术区和报考兽医药膏给眼睛，防止干燥。宽松拭制备的切口部位用5％聚维酮碘防腐剂。
- 注入盐酸布比卡因（0.1毫升2.5毫克/毫升溶液，SC的）插入其中的切口将被制成为手术前的镇痛的区域。
- 使单个切口（〜1.0 - 1.5厘米）对动物的左翼使用无菌解剖刀或剪刀，小心以免穿透腹膜。用无菌剪刀腹膜分离真皮。民建联切口部位用无菌纱布，以消除任何血液。
- 按住鼠标，用双手，用左手持有的头部和右手支撑侧翼。
- 识别脾通过腹膜和，用右手的一个手指，从下方触诊鼠标;肾脏现在应该通过腹膜可见。保持动物的坚定持有，以提供跨腹膜和肾脏紧张。
- 有第二人注入肿瘤CELLS（1.2节中制备的。）通过完整腹膜成使用1毫升注射器装配有28号针头的肾脏的中心。慢慢地递送细胞的0.1毫升（2×10 5）。一旦细胞注射，持针到位5 - 10秒，以减少细胞的回流。注意在此步骤非常谨慎的需要，因为注射细胞的人就会把针头插入接近按住鼠标的人的手指是很重要的。
- 卸下针和用氰基丙烯酸酯组织粘合剂的薄层关闭切口。
- 将动物放回一个干净的笼子消毒纸巾。让动物在加热垫上恢复。不要离开无人看管的动物在恢复期。不要将动物返回到标准的住房条件，直到他们正直和胸骨。按照使用实验动物的所有程序制度的指导方针。
4.生物发光成像
- 监测由生物发光成像的肿瘤生长。
注意：用于执行生物发光成像程序的细节可以从Lim 等来获得。 20荧光素酶信号可以在肿瘤细胞植入后早在24小时进行检测。由于有在该模型中没有外部可见的肿瘤，它周期性地监视肿瘤的生长是必不可少的。根据不同的设计的实验，原位肿瘤生长可以进行不同的时间长度。使用荧光素酶表达的Renca细胞的一个好处是，肿瘤的生长可反复在相同的动物定期监测在实验的持续时间，和荷瘤和无肿瘤的器官的特定询问可以在完成定义端点。- 注入荧光素（0.1毫升在无菌PBS中有15毫克/毫升溶液）ip和允许其将鼠标到生物发光成像系统之前循环10分钟。将莫其背部朝上使用，在其一侧略微卷起，才能有朝上注入的肾。
- 测量使用图像分析软件确定的关注区域（ROI）的区域内的每秒（光子通量）发出的光的光子的肿瘤负荷。
- 在个别器官的肿瘤负荷的定量。
注：定量可以在确定的时间点在个别器官从安乐死的小鼠其取出后进行。- 注入小鼠荧光素，如步骤4.1。
- 10分钟后，安乐死使用经批准的过程的小鼠。
- 解剖出感兴趣的器官（ 例如，肾和肺;见下文第5节）。转移组织以35×10毫米的培养皿并将其放置在生物发光成像系统。
- 测量使用图像分析软件定义的ROI内每秒（光子通量）发出的光的光子的肿瘤负荷。
- 在用于各个实验所定义的终点，根据优选机构准则（ 例如，CO 2，颈椎脱臼，麻醉过量）安乐死荷瘤小鼠。然而，要避免颈椎脱位，如果肺是印度墨通货膨胀之后被收集。
- 通过测量湿器官重量执行在所注入的肾原发性肾肿瘤生长的毛评估。
- 为了确定肿瘤块（以克计），隔离21和称重荷瘤肾脏和从同一小鼠，其中在肾重量差定义了肿瘤质量的对侧肾。测量它们的重量之前，请仔细剖析远离切除肾脏任何多余的结缔组织。
- 通过用墨汁之前切除充气肺并立即固定在的Fekete的溶液肺评估肿瘤转移至肺的程度小姑娘= “外部参照”> 22。然后可以执行的肺表面上的转移病灶的人工计算。
- 请使用开始于-腹部中期剪刀正中切口，通过胸腔，并且向上通过颈部/唾液腺。小心地取出用剪刀和镊子胸腔，而不会损害肺组织。
- 通过去除结缔组织暴露气管。
- 制备3mL注射器填充有在HBSS 10％印度油墨溶液的18号针头。
- 使用镊子，小心翼翼地拧气管下丝线。这将用于打结在充气后的气管。
- 小心地将针头顺着气管，慢慢压低注射器膨胀与印度墨液肺部。大约1 - 1.5毫升的印度油墨溶液将完全膨胀肺部。
- 捏通过把几节，与以下针缝合，以抑制墨逆流关闭气管。
- 祛瘀E中的针，小心地剪去结缔组织去除膨胀肺部。
- 在化学通风橱中，将肺成含有5的Fekete的溶液中的溶液15毫升锥形管中（35毫升95％乙醇，15毫升卫生署2 O，5毫升的甲醛，和2.5毫升冰酸性酸的中一个100毫升的玻璃瓶）23。
- 允许肺修复/脱色24 - 在室温下48小时之前手动计数脱色肿瘤结节。
- 脱色后取出完整肺和仔细叶在35×10毫米的培养皿解剖固定肺。算肿瘤结节（白色结节）上在解剖显微镜下每个叶的数目。
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Representative Results
RENCA细胞的成功植入会导致肿瘤的发展在肾脏和转移到小鼠肺。荷瘤和对侧肾脏切除后，湿组织重量（克）进行测定，以证实基于增加的重量（ 图1）的肿瘤负荷。 RENCA肿瘤可以通过免疫组化通过细胞角蛋白8和18染色（ 图2）来识别。对于纵向研究中，荧光素酶表达的Renca细胞系植入。使用体内成像系统（IVIS）来跟踪肿瘤负荷和对治疗的反应随着时间的推移（ 图3A）中进行生物发光成像。转移到肺，通过生物发光成像（ 图3B）和印度油墨肺膨胀（ 图3C）证实。
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图1.的Renca肿瘤细胞的原位移植形成大肾质量。 RENCA-GL细胞（2×10 5在0.1毫升）肾内注射，测定第24天，N = 15肿瘤以克（+ SEM）切除的荷瘤肾脏和无肿瘤对侧肾脏的权重自由和荷瘤肾脏。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.免疫荧光无肿瘤对侧和荷瘤肾脏的显微图像。 RENCA-GL细胞（2×10 5在0.1毫升）肾内注射，并收获上12将肾脏快速冷冻天荷瘤和无肿瘤肾脏和immunof处理luorescence成像可视化胶原蛋白的位置，细胞角蛋白8和18，和CD31。 10倍的图像拍摄和缝合在一起以查看整个荷瘤肾脏。比例尺= 1mm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.的Renca肿瘤细胞的原位移植导致自发的肺转移。 A.的Renca-GL细胞（2×10 5在0.1毫升）肾内注射到Balb / c小鼠。生物发光图像拍摄所指示的日子。 B.第23天，从没有肿瘤和荷瘤小鼠肺切除并取生物发光图像。 C.并行在第23天的小鼠的组已经它们的肺墨汁充气以显现肺肿瘤结节。比例尺= 1厘米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们提出了一个原位RCC小鼠模型的协议。小鼠肾腺癌肿瘤细胞植入小鼠肾脏提供海上救援协调中心临床相关模型。该模型导致在肺中，这两者都是晚期RCC的标志的肾脏和远处转移中的原发肿瘤。本文中所呈现的描述是具体的在免疫活性Balb / c小鼠的的Renca细胞系。使用这种原位模型，我们已经表明的Renca肿瘤响应免疫，表明治疗性测试17，24，25，26，27这个模型的有效性。使用同基因肿瘤细胞系用于植入的能力提供了在免疫完整的动物研究肿瘤进展的优点。同基因，原位，和临床相关characte该系统的ristics提供了优越的模式，允许治疗在相关临床前模型测试。当肿瘤皮下植入这不能被复制。需要提及的是这样的建模系统不限于评价抗肿瘤免疫应答或用于治疗肾癌的各种免疫治疗方法是很重要的。它是使用植入肾内到免疫缺陷小鼠的人肿瘤细胞是可行的，这取决于实验的类型而进行的。可在体外培养建立的RCC细胞系的可用性提高该体内原位模型的再现性，因为所有的动物可以与在同一时间相等数量的肿瘤细胞的植入。此外，肿瘤细胞可以在体外肾内植入之前操纵提供，以控制细胞如何生长和/或对环境信号作出反应的可能性。与此（最）IMPLAN一个限制表肿瘤模型是他们规避负责肿瘤的形成，是通过使用小鼠模型遗传工程原地肿瘤的形成提供有益的早期事件。
原位模型的一个缺点是，一般不能以可视化的肿瘤生长，即容易通过测径器测量的皮下肿瘤监视的功能。使用基因工程的肿瘤细胞和生物发光成像当前技术允许内部肿瘤的纵向测量。我们已经证明，以确定在基于生物发光成像和/或器官的提取17，24，25的不同时间点原发性肾肿瘤和转移性负担的能力。我们的模型的力量是GFP和荧光素酶表达的Renca细胞系的可用性，但该模型并不需要此功能成功。我们有特点的或thotopic RCC模型亲代的Renca和的Renca-GL细胞。以下的Renca-GL细胞的注入，原发肿瘤可以容易地通过生物发光成像测定。它可以是难以监测转移在整个动物，然而，如原发肿瘤可以产生压垮可能从转移部位要发射的下信号的信号。切除并从整个动物成像个别器官允许在这些器官转移的可视化和量化。在原位的Renca模型，主肾肿瘤引起自发微转移的动物早7天植入后的肺部，由发光的切除肺组织17所示。
虽然在该系统中使用的荧光素酶表达的肿瘤细胞系的方式使用户可以在相同的动物纵向跟踪肿瘤进展的能力的用户，还为用户提供了到evaluat的能力e是植入技术的精度。小鼠肾脏是一个小的解剖结构，使得有可能，使用长针特别是当，通过肾脏并直接进入腹膜注射肿瘤细胞。内注射的几天成像鼠标确定该肿瘤细胞的植入局限于肾脏中的程度。可以在肾内注射复杂化的另一个特点是丰富的内脏脂肪，其可以积累作为动物年龄的存在。肾脏是通过在瘦鼠腹膜容易看到，但肾能成为下的内脏脂肪瓣，可随着时间的推移开发模糊。
在给定的实验结束时，一些评估可以用于确定全身肿瘤负荷。切除的器官的生物发光成像提供的肿瘤负荷客观量度。原发性肿瘤的湿重标准化为对侧kidneÿ作为内部对照提供了一种散装质量测量。在肺中的转移负荷，也可通过膨胀用印度墨水肺整块以允许使用解剖显微镜白肺肿瘤结节的可视化来确定。这些读数可以建立的全身肿瘤负荷，其可被用作基线用于在临床前阶段的药物开发的研究的治疗功效。 GFP的由的Renca-GL细胞中的表达也适合于流过的携带肿瘤的组织的流式细胞术分析。然而，调查作为治疗的结果产生的任何免疫反应的组合物和大小尤其是当必须谨慎的荷瘤肾脏的任何流式细胞评估。肾脏是高度血管器官，使之成为可能的免疫反应的评价（无论是亲肿瘤或抗肿瘤）在全荷瘤肾脏将包括“组织 - 和血管局部化D”的免疫细胞在器官收获时，为了区分组织与血液的免疫细胞，我们使用其中荧光染料标记的抗CD45.2单克隆抗体（mAb）的安乐死之前静脉注射的技术。肾脏，然后用于制备流流式细胞术，其包括具有不同荧光染料标记的抗CD45.2单抗28,29。双CD45.2染色鉴别从在收获时组织中的血管系统内的细胞离体染色，这种简单的协议使得主要的白细胞的识别载，否则可能会混淆在组织适应性和先天免疫应答的解释血管内谱系。该协议也省去了灌注，这可能会产生意想不到的后果，28，29。
目前用于增加了解和利用免疫疗法治疗癌症。未来基于免疫的治疗方法治疗mRCC（和其他癌症）的发展，在实验室使用clinically-和生理相关的模型开始。本文所描述的原位RCC模型包含若干关键特征（ 例如，原发性肾肿瘤，远处转移，肿瘤诱导的免疫抑制，和组件的肿瘤生长的纵向监测）用于测试的各种治疗方法的功效。它也很诱人的推测，这模型可以在将来被适配为评估在治疗肾癌，例如手术和/或聚焦治疗协议的其它装置的进步。
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Acknowledgments
这项工作是由美国国家癌症研究所（R15CA173657到AW和R01CA109446到TSG），西蒙斯癌症研究所（至AW），以及Minnestoa大学助学金爬上4肾脏癌症基金会（TSG到）的支持。我们感谢克丽斯廷·安德森博士与免疫援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
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