Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Моноклональные антитела (мАт) являются биотерапевтический белки с ростом интереса из – за их способности действовать против нескольких хронических и дегенеративных заболеваний 1. Как и другие биомолекулы, мАт склонны пройти несколько физико – химических модификаций на всех этапах их жизненного цикла (т.е. от биосинтеза до конечного продукта). Такие модификации включают, но не ограничиваются ими: деамидированием, гликозилирование, окисление, циклизации, изомеризации, агрегации и протеолитическим расщеплением 2. Следовательно, аналитические методы, способные решить внутренние изоформы необходимы для мониторинга MAT, гетерогенность и стабильности с целью установления требований к качеству.
Капиллярного электрофореза (CE) представляет собой технологию, высокопроизводительное разделение, осуществляемое outinside узкой плавленого кварца трубки (диапазон мкм), наполненную фонового электролита (BGE). При приложении электрического поля (до 30000 В), заряженной молекулыs мигрируют к электроду с противоположным зарядом (то есть, электро-приводом разделения). Использование высоких напряжений в CE позволяет быстро анализа и повышения эффективности, которые превосходят электрофореза классического геля. Капиллярного зонного электрофореза (CZE) представляет собой метод CE на основе обычно используются в биофармацевтической промышленности для оценки качества продукта 3-9. В отличие от других режимов CE (например, электрофорез капиллярный гель, капиллярная изоэлектрической фокусирующей) или методов хроматографии на основе, CZE может проводиться без использования денатурирующих или твердофазных интерфейсов, что позволяет анализ присущей неоднородности мАт , близких к их нативном состоянии 10 , CZE разделение MAB изоформ происходит внутри плавленого кварца капилляра , покрытого гидрофильным полимером (нейтральным капилляра) и основан на их различной электрофоретической подвижности, которое управляется с помощью заряда, массы, размера и формы (или гидродинамического объема) 11. монАТ фрагменты обнаружены приони мобилизовали и проходят через окна обнаружения, которая измеряется с помощью детектора ультрафиолетового (УФ) оптической плотности при 214 нм 4.
Успешная реализация этой аналитической методики будет зависеть от надлежащего внимания к деталям до и во время эксперимента. Действуя в противном случае приведет к увеличению затрат и времени, чтобы провести анализ, в конечном счете, приводит к постоянной неудачи и разочарования.
Здесь мы представляем руководство шаг за шагом провести успешный анализ МАВ неоднородности по CZE через подробное объяснение приготовления растворов и образцов, подготовки системы CE, методов инструментов, созданных, сбора данных, и обработка. Для целей данного руководства, полностью рекомбинантный человеческий анти-фактора некроза опухоли альфа (анти-TNF-alpha) моноклональное антитело используется в качестве модели белка; Тем не менее, этот протокол можно легко настроить для анализа других белков с учетом кратких модификаций.dditionally несколько рекомендаций по смягчению предложены возможные проблемы. Читателю предлагается строго соблюдать предложенный протокол, поскольку вероятность достижения успеха будет возрастать.
В этом уроке, мы подчеркиваем важность надлежащей практики при проведении CZE анализа моноклональных антител, с тем чтобы повысить вероятность добиться успеха. Однако, когда CZE используется на регулярной основе, вопросы неизбежно возникают 12.
Для достижения наилуч?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
(Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |