Summary
这里，我们描述一个4级协议分化人胚胎干细胞在体外 NKX6-1 +胰祖细胞。这个协议可以应用于各种人多能干细胞系的。
Abstract
多能干细胞具有自我更新和分化为多种谱系，使它们有吸引力的来源可用于研究和糖尿病的未来治疗胰腺祖细胞的产生的能力。本文概述旨在产生自人胚胎干细胞（胚胎干细胞）的胰腺祖细胞的四阶段分化方案。这个协议可以被应用到许多的人多能干细胞（HPSC）线。采取产生胰腺祖细胞的方法是区分人类胚胎干细胞胰腺发展的关键阶段精确建模。这开始于定形内胚层，这是由在活化素A，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的和CHIR990210的存在下培养细胞来实现的诱导。进一步的分化和图案与成纤维细胞生长因子10（FGF10）和Dorsomorphin生成类似细胞后前肠。添加的雷廷伊斯兰会议组织酸，头蛋白，圣-1和FGF10区分后前肠细胞进入胰腺内胚层细胞的特性。最后，表皮生长因子（EGF）的结合，烟和头蛋白导致有效地产生PDX1 + / NKX6-1 +细胞。流式细胞仪进行，以确认特定的标志物的表达在胰腺发育的关键阶段。的PDX1 + / NKX6-1 +胰在阶段4的端祖细胞能够在移植后产生的成熟β细胞免疫缺陷小鼠的，并且可以进一步分化以产生在体外产生胰岛素的细胞。因此，有效地产生PDX1的+ / NKX6-1 +胰祖细胞，如在该协议证明的，是非常重要的，因为它提供了一个平台，以研究人类胰腺发育的体外和提供细胞的来源与分化为潜在可能EVβ细胞entually用于糖尿病的治疗。
Introduction
糖尿病的发病率正在增加，根据加拿大糖尿病协会，据估计超过11亿人在加拿大是糖尿病或糖尿病前期，与具有1型糖尿病（T1D）1这些个体的5-10％。 T1D]是由位于胰岛内产生胰岛素的β细胞的破坏引起的自身免疫性疾病。目前，生活在1型糖尿病人需要胰岛素2的外源性来源。尽管在胰岛素治疗的进展，患者1型糖尿病继续有困难的时候，他们的调节血糖水平，并继续遭受既低血糖症和高血糖。治疗的一个有前途的形式恢复正常血糖在T1D是利用人胚胎干细胞（胚胎干细胞），其可以用来产生胰岛素生产在体内和体外 3β细胞的无限供给的，
在从体外人类胚胎干细胞产生胰岛素生产细胞的最成功的尝试是概括胰腺发育4,5期间发生的胚胎的事件。这涉及到不同的信号传导途径的操纵到显影胰腺的关键阶段准确建模。胰腺发育开始于定形内胚层，其特点是CXCR4和CD117（C-KIT）8，9的表达的诱导。 definit的精确调节IVE内胚层组织是所必需的肠道管，其然后经历前 - 至 - 后和腹侧背侧图案的形成。背侧和腹侧胰芽来自表达胰腺十二指肠同源框基因（Pdx1的 ），这是必要的胰腺发育10的后前肠的区域出现。背，腹芽融合形成胰腺，然后经历了广泛的上皮细胞重建和扩建11。承诺内分泌和外分泌谱系伴随表达多能祖细胞（多用途储值卡）的产生，除其他外，转录因子Pdx1的，NKX6.1和Ptf1a 12,13。多用途储值卡，将成为内分泌和导管细胞继续表达Nkx6-1同时降低Ptf1a表达。与此相反，外分泌谱系细胞会失去expressioNkx6-1的n和维护Ptf1a表达12。
转录因子Nkx6-1在胰腺发育关键作用，特别是在内分泌祖细胞对β细胞的分化。如前所述胰腺发育14中，缺失Nkx6-1导致形成β细胞受损。因此，产生在体外和体内产生胰岛素的β细胞，需要Nkx6-1的有效诱导。
我们最近开发的协议，有效地生成从hPSCs PDX1 + / NKX6-1 +胰腺祖细胞。这些HPSC衍生胰腺祖细胞生成移植后成熟β细胞免疫缺陷小鼠3。该分化方案可以分为4个阶段的特点：1）定形内胚层诱导，2）后前肠图案，3）胰说明书和4）NKX6-1诱导。在这里，我们提供的定向分化的每个步骤的详细描述。
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Protocol
1.解决方案和媒体的制备
注：准备细胞培养的所有媒体在无菌环境中。媒体已作出，并立即使用。在材料表中提供的试剂的信息。
- 媒体分化
- 制备0天分化培养基：RPMI培养基中以1％谷氨酰胺，2微米CHIR 99021，100纳克/ ml激活素A，10 4M的 MTG。
- 准备1-2天分化培养基：RPMI培养基用1％谷氨酰胺，100毫微克/毫升激活素A，10 4M的 MTG，5毫微克/毫升的bFGF，50μg/ ml的抗坏血酸。
- 制备天3-5分化培养基：RPMI培养基中以1％谷氨酰胺，1％B27，10 4M的 MTG，0.75μMDorsomorphin，50纳克/毫升FGF10。
- 用1％谷氨酰胺，1％B27，50微克/毫升抗坏血酸，50纳克/毫升FGF10，0.25μMSANT-1，2μM维甲酸，50纳克/ ml成头蛋白DMEM：准备6-7天分化培养基。
注：维甲酸酸应最后添加到媒体和媒体应加以保护，以防止氧化降解15。 - 制备天8-12分化培养基：DMEM，用1％谷氨酰胺，1％B27，50微克/毫升抗坏血酸，50纳克/ ml成头蛋白，100ng / ml的人表皮生长因子，10毫烟酰胺。
- 制备FACS缓冲液：在PBS中的10％FBS，减去钙和镁。
2. HESC分化
注：HESC解冻，传代，并在补充有bFGF的16基于KOSR介质的存在下对照射的小鼠胚胎成纤维展开。胚胎干细胞是准备分化时细胞达到80-95％汇合。此时的菌落大有确定的边界和一个'domelike'结构（ 图1A）。所有细胞培养在平底，涂有0.1％明胶组织培养处理板中进行。通常情况下，将细胞在6生长或12孔板，在分别2毫升或1毫升，介质卷。
- 在第0天，通过与第0天分化培养基替换基于KOSR媒体开始分化。
- 第1天和第2，轻轻摇动板吸取之前删除从单层的死细胞。用1-2天分化培养基更换。
- 在第3天，收获的细胞进行流式细胞术。如果细胞表达90％以上的CXCR4 + / CD117 +，继续执行步骤2.4。
- 在天3和5，轻轻摇动板去除单层任何死细胞吸取之前。用3-5天分化培养基更换。
- 天6和7，更换6-7天分化培养基。
- 在天8，10和12，更换8-12天分化媒体。
- 第13天，收获细胞流式细胞仪测定PDX1和NKX6-1的表达。
3.收获细胞的流式细胞仪分析
- 分离与细胞根据制造商的协议，并在37°C孵育3分钟1×商业胰蛋白酶溶液。
- 在1000微升FACS缓冲液与30微升的DNA酶I.删除商业胰蛋白酶溶液和悬浮单个细胞
- 使用35微米的尼龙网细胞滤网，并转移到微量离心管过滤器的细胞。
- 离心机的细胞在455 XG 5分钟。制备用于任一活的或固定染色细胞。
4.染色的流式细胞仪
- 流准备活染第3天
- 悬浮细胞在1000微升FACS缓冲。转移200微升（约1-3×10 5个细胞）到96孔板的两口井（用于未染色和染色的样本）。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- APC和CD117：原发性标记的抗体，CXCR4染色PE（参见主材料板表 ）30分钟，在室温下避光保存。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- 重悬的样品在100μlFACS缓冲液。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- 悬浮每个样品和传送在300-500微升FACS缓冲液的总体积至1ml微试管或5毫升的圆底管中。
- 在流式细胞仪17的流量运行样品。如果样品不能立即运行，存储在4℃避光保存。
- 流准备固定染色第13天
- 重悬在商业固定/透化溶液中的细胞沉淀，在4℃下24小时。
- 离心样品以455×g离心5分钟。悬浮于400μl彼尔姆/洗涤溶液。
- 转移样品（约0.5-1×10 6细胞），以总重量为200微升Ø96孔板的孔（IgG的控制和PDX1 / NKX6-1染色）。离心机931 XG为2分钟。
- 在重悬含有抗PDX1和抗NKX6-1小学或同型对照抗体100微升渗透/洗涤溶液中的细胞团（见材料表 ）。在4℃孵育过夜。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。悬浮样品100微升彼尔姆/洗涤液。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- 重悬在100μl彼尔姆/洗涤含有在室温下的二抗的样品1小时避光。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- 悬浮样品100微升彼尔姆/洗涤溶液。
- 离心板在931×g离心2分钟。通过倒转板除去上清液。
- 众议员吃一步4.2.9和4.2.10。
- 悬浮每个样品和传送在300-500微升FACS缓冲液的总体积至1ml微试管或5毫升的圆底管中。
- 在流式细胞仪17的流量运行样品。如果样品不能立即运行，存储在4℃避光保存。
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Representative Results
有效地产生胰祖细胞的依赖于未分化的细胞，随后通过该分化方案中的精确加入特定信号分子的适当生长和维持，如在图1A中示意示出。在第0天，未分化的细胞应该是80-95％汇合和菌落具有限定边缘（ 图1A）。第一阶段期间，媒体将有可能出现混浊，因为细胞死亡是相当普遍的在这个阶段。由第1阶段的末尾，将细胞应共表达定形内胚层标志物，CXCR4和CD117，在比例大于90％（ 图1B）。
作为细胞分化整个四阶段协议，从细长，呈椭圆状的外观的形态学变化（在阶段1观察和2）更小，圆细胞（如在阶段3中可见和4）（
图1：胚胎干细胞和支持数据胰腺祖分化的示意图。 （ 一 ）胰腺祖的人类胚胎干细胞从诱导示意图。分化日，developmenta升阶段，基础介质，并在每一个阶段中加入的细胞因子被包括在内。下面，在胰腺分化的关键阶段相衬图像显示。在所有的有代表性的人物，H1细胞进行根据上述所示的4级分化协议鉴别。 0，未分化的胚胎干细胞日;阶段1中，定形内胚层;第二阶段，后前肠;第3阶段，PDX1 +内胚层;第4阶段，NKX6-1 +内胚层/胰腺前体细胞。比例尺= 200微米。 （B）第3天代表流式细胞仪对CXCR4图：PE和CD117：APC抗体染色。在左边，右边染色样品未染色样品。 （C）13日代表流式细胞仪积表达NKX6-1和PDX1阶段-4衍生的胰腺祖细胞。在左边，右边染色标本IgG对照。 人类胚胎干细胞-人类胚胎干细胞 ， 法案-激活素A; bFGF的-碱性成纤维细胞生长因子，FGF10 -成纤维细胞生长因子10，DM - dorsomorphin，NOG -头蛋白，RA -视黄酸，表皮生长因子-表皮生长因子，NA -烟酰胺。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
成功地从hPSCs 在体外产生NKX6-1 +胰腺祖依赖于使用hPSCs高品质的文化和定向分化涉及胰腺发育过程中的关键管理发展阶段的特定信号通路的精确调节的。虽然该协议可以用于诱导在各种HPSC线NKX6-1稳健表达如先前3所示，以确保有效的NKX6-1代以下考虑应。重要的是，所有的细胞培养和介质制剂在无菌环境中，以防止污染进行。重要的是，在胚胎干细胞集落已达到适当的汇合，并没有开始分化开始分化的第0天前。开始分化与不是最佳可能导致定形内胚层和程序发展的低效诱导胚胎干细胞人阶段。这就是为什么它是通过流式细胞术来分析在第3天的细胞的关键，以确保定形内胚层的有效诱导。双阳性CXCR4 +在第3天CD117 +细胞的比例应为有效胰腺发育3是大于90％。如果同时表达CXCR4和CD117的细胞的百分比低于90％，有效地诱导胰腺祖细胞可能会受到影响（结果未示出）。此外，相反的是在先前公布的，这是没有必要以洗涤用RPMI细胞阶段1个媒体16馈送之前。板的吸媒体前轻轻摇动足以从单层去除死细胞。
在阶段2 dorsomorphin的添加已被证明仅需要为特定HPSC线18。因此，重要的是要确定是否与二工作时dorsomorphin是必要 fferent HPSC线。此外，第3阶段的持续时间已被证明是用于指定任一monohormonal或polyhormonal祖细胞和为细胞系依赖3关键。因此，利用新的HPSC线工作时，重要的是要确定的持续时间，该细胞应在阶段中培养3个媒体来确定NKX6-1感应的最佳条件。为了确定这一点，细胞应在阶段中培养3个媒体为1-4天及5天后术分析通过流式细胞为NKX6-1表达。
有效地产生在NKX6-1 +细胞丰富的人口是非常重要的，因为Nkx6-1是β细胞发展的关键14。当别人已经开发协议，它们可以分化人类胚胎干细胞来NKX6-1 +细胞（约60％H1衍生NKX6-1 +细胞和55％HUES8衍生PDX + / NKX6-1 +细胞）4，“外部参照”> 5，我们的方法始终产生> 80％H1衍生PDX1 + / NKX6-1 +细胞。然而，我们的分化协议依赖于使用小鼠胚胎成纤维细胞，从而限制了其使用纯研究，因为我们还没有优化生产操作规范的方法。尽管我们没有试图冷冻保存我们的阶段-4-衍生PDX1 + / NKX6-1 +细胞，该方法已成功地由Schulz 等进行。 ，谁证明了冻存胰腺聚集体能够保持其功能在体内 19。
在本文中，我们描述了一个4级协议，有效地从各种HPSC线产生PDX1 + / NKX6-1 +胰腺祖细胞。通过胰腺发育的四个关键阶段区分HPSC，该协议提供了一个模型来研究体外人胰腺的发展。弗思ermore，由于PDX1 + / NKX6-1 +细胞具有产生在体内和体外产生胰岛素的细胞的电位（数据未显示）3，4，5，hESC衍生PDX1 + / NKX6-1 +胰祖细胞提供用于治疗糖尿病的一个可能来源。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这手稿是由来自多伦多总与西方基金会和班廷和最佳糖尿病中心，大学健康网络研究生奖资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
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