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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Pluripotent के कुशल भेदभाव स्टेम कोशिकाओं को NKX6-1 Published: March 7, 2017 doi: 10.3791/55265
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

Summary

यहाँ हम NKX6-1 + विट्रो में अग्नाशय के पूर्वज करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक 4 चरण प्रोटोकॉल का वर्णन। इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल लाइनों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

स्टेम कोशिकाओं की क्षमता आत्म करने के लिए नवीनीकृत और कई प्रजातियों के लिए अंतर है, उन्हें इस बात का अध्ययन और मधुमेह के भविष्य के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक आकर्षक स्रोत बना रही है। यह लेख एक चार चरण भेदभाव मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल की रूपरेखा। इस प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल (hPSC) लाइनों की संख्या के लिए लागू किया जा सकता है। दृष्टिकोण अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लिया hESCs सही अग्नाशय विकास के प्रमुख चरणों मॉडल करने के लिए अंतर करने के लिए है। यह निश्चित एण्डोडर्म, जो Activin ए, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और CHIR990210 की उपस्थिति में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा हासिल की है की प्रेरण के साथ शुरू होता है। आगे भेदभाव और fibroblast वृद्धि कारक 10 (FGF10) और Dorsomorphin साथ patterning पीछे अग्रांत्र जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। Retin के अलावाओआईसी एसिड, नोगिन, संत-1 और FGF10 अग्नाशय एण्डोडर्म की विशेषता कोशिकाओं में पीछे अग्रांत्र कोशिकाओं differentiates। अंत में, epidermal वृद्धि कारक (EGF) के संयोजन, Nicotinamide और नोगिन Pdx1 + / NKX6-1 + कोशिकाओं के कुशल पीढ़ी की ओर जाता है। प्रवाह cytometry अग्नाशय के विकास की कुंजी चरणों में विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय स्टेज 4 के अंत में progenitors immunodeficient चूहों में प्रत्यारोपण पर परिपक्व β कोशिकाओं को पैदा करने में सक्षम हैं और आगे इन विट्रो में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए भेदभाव किया जा सकता है। इस प्रकार, Pdx1 के कुशल पीढ़ी + / NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज, के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया है, क्योंकि यह इन विट्रो में मानव अग्नाशय के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है बहुत महत्व का है और करने के फर्क की क्षमता के साथ कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करता है β कोशिकाओं कि eV कर सकता हैentually मधुमेह के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

Introduction

मधुमेह का प्रसार बढ़ता जा रहा है और कनाडा डायबिटीज एसोसिएशन के अनुसार, यह अनुमान लगाया गया है कनाडा में 11 लाख से अधिक व्यक्तियों मधुमेह या prediabetic हैं कि इन होने टाइप 1 मधुमेह (T1D) 1 व्यक्तियों के 5-10% के साथ। T1D एक autoimmune रोग है कि इंसुलिन के उत्पादन β कोशिकाओं है कि आइलेट्स की आइलेट्स के भीतर स्थित हैं के विनाश के कारण होता है। वर्तमान में, T1D साथ रहने वाले व्यक्तियों इंसुलिन 2 की बहिर्जात स्रोतों की आवश्यकता है। इंसुलिन चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, T1D रोगियों के लिए एक मुश्किल समय उनके रक्त में शर्करा की मात्रा को विनियमित करने के लिए है और दोनों hypo- और hyperglycemia ग्रस्त करने के लिए जारी रखने के लिए जारी है। उपचार का एक होनहार प्रपत्र बहाल करने के लिए T1D में normoglycemia मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) है, जो दोनों vivo में इन विट्रो 3 में β कोशिकाओं का उत्पादन इंसुलिन की एक असीमित की आपूर्ति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का इस्तेमाल होता है, 4, 5, 6, 7। HESCs फर्क बीटा-तरह के लिए कोशिकाओं यह संभव इन विट्रो में मधुमेह का अध्ययन, टाइप 2 मधुमेह के नए चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है और T1D रोगियों में प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं प्रदान करने के लिए कर सकता है।

इन विट्रो में hESCs से इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को पैदा करने में सबसे सफल प्रयास भ्रूण घटनाओं है कि अग्नाशय विकास 4, 5 के दौरान हो पुनरावृत्ति करना है। यह अलग संकेत दे रास्ते के हेरफेर सही विकासशील अग्न्याशय के प्रमुख चरणों मॉडल करने के लिए शामिल है। अग्नाशय के विकास निश्चित एण्डोडर्म, जो CXCR4 और CD117 (सी-किट) 8, 9 की अभिव्यक्ति की विशेषता है की प्रेरण के साथ शुरू होता है। definit की सटीक विनियमनIve एण्डोडर्म संगठन पेट ट्यूब, जो है तो पूर्वकाल-पीछे करने के लिए और उदर-पृष्ठीय patterning से होकर गुजरती है के गठन के लिए आवश्यक है। पृष्ठीय और उदर अग्नाशय कलियों पीछे अग्रांत्र कि अग्नाशय और ग्रहणी homeobox जीन (Pdx1), जो अग्नाशय के विकास के लिए 10 आवश्यक है व्यक्त करता है के क्षेत्र से उभरेगा। पृष्ठीय और उदर कलियों फ्यूज अग्न्याशय, जो तब व्यापक उपकला remodeling और विस्तार 11 से होकर गुजरती है के रूप में। अंत: स्रावी और बहि वंश के प्रति प्रतिबद्धता multipotent पूर्वज कोशिकाओं (MPCs) कि व्यक्त की पीढ़ी के साथ है, दूसरों के बीच में, प्रतिलेखन कारक Pdx1, Nkx6.1 और Ptf1a 12, 13। MPCs कि अंत: स्रावी और नलीपरक कोशिकाओं हो जाएगा Nkx6-1 व्यक्त करने के लिए Ptf1a अभिव्यक्ति कम हो रही है, जबकि जारी है। इस के विपरीत, बहि वंश कोशिकाओं expressio खो देंगेNkx6-1 के एन और Ptf1a अभिव्यक्ति 12 बनाए रखें।

प्रतिलेखन कारक Nkx6-1 विशेष रूप से अंत: स्रावी पूर्वज कोशिकाओं कोशिकाओं बीटा के भेदभाव के दौरान, अग्नाशय के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका है। पहले से अग्नाशय के विकास 14 के दौरान वर्णित है, β कोशिकाओं के गठन में बिगड़ा Nkx6-1 परिणामों का विलोपन के रूप में। इसलिए, दोनों इन विट्रो में और vivo में इंसुलिन के उत्पादन β कोशिकाओं को पैदा करने Nkx6-1 के कुशल प्रेरण की आवश्यकता है।

हमने हाल ही में एक प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक hPSCs से Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज उत्पन्न करने के लिए विकसित की है। ये hPSC व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वज immunodeficient चूहों 3 में प्रत्यारोपण पर परिपक्व β कोशिकाओं को उत्पन्न। 1) निश्चित एण्डोडर्म प्रेरण: भेदभाव प्रोटोकॉल 4 में विभाजित किया जा सकता है की विशेषता चरणों2) पीछे अग्रांत्र patterning, 3) अग्नाशय विनिर्देश और 4) NKX6-1 प्रेरण। यहाँ हम निर्देशित भेदभाव के हर कदम का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

ध्यान दें: एक बाँझ वातावरण में सेल संस्कृति के लिए सभी मीडिया तैयार करें। मीडिया बना दिया और तुरंत इस्तेमाल किया जा रहा है। अभिकर्मक विवरण सामग्री तालिका में प्रदान की जाती हैं।

  1. भेदभाव मीडिया
    1. 1% Glutamine, 2 माइक्रोन चीड़ 99021, 100 एनजी / एमएल Activin ए, 10 4 एम MTG साथ RPMI मध्यम: 0 दिवस भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    2. 1% Glutamine, 100 एनजी / एमएल Activin ए, 10 4 एम MTG, 5 एनजी / एमएल bFGF, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड के साथ RPMI मध्यम: दिन 1-2 भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    3. 1% Glutamine, 1% B27, 10 4 एम MTG, 0.75 सुक्ष्ममापी Dorsomorphin, 50 एनजी / एमएल FGF10 साथ RPMI माध्यम: दिन 3-5 भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    4. 1% Glutamine, 1% B27, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड, 50 एनजी / एमएल FGF10, 0.25 सुक्ष्ममापी Sant-1, 2 माइक्रोन retinoic एसिड, 50 एनजी / एमएल नोगिन साथ DMEM: दिन 6-7 भेदभाव मीडिया तैयार करें।
      नोट: Retinoicएसिड पिछले मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए और मीडिया ऑक्सीडेटिव गिरावट को रोकने के लिए 15 प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    5. 1% Glutamine, 1% B27, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड, 50 एनजी / एमएल नोगिन, 100 एनजी / एमएल hEGF, 10 मिमी Nicotinamide साथ DMEM: तैयार डे 8-12 भेदभाव मीडिया।
  2. पीबीएस में 10% FBS, शून्य से कैल्शियम और मैग्नीशियम: FACS बफर तैयार करें।

2. hESC भेदभाव

नोट: hESC, thawed passaged और एक KOSR आधारित मीडिया bFGF 16 के साथ पूरक की उपस्थिति में विकिरणित माउस भ्रूण fibroblasts पर विस्तार कर रहे हैं। HESCs जब कोशिकाओं 80-95% confluency तक पहुँचने के भेदभाव के लिए तैयार हैं। इस समय कालोनियों परिभाषित सीमाओं और एक 'domelike' संरचना (चित्रा 1 ए) के साथ बड़ा होना चाहिए। सभी सेल संस्कृति फ्लैट नीचे, टिशू कल्चर इलाज 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित प्लेट में किया जाता है। आमतौर पर, कोशिकाओं 6 में बड़े हो रहे हैं या12 अच्छी तरह प्लेटें, 2 मिलीलीटर या 1 मिलीलीटर, क्रमशः के मीडिया खंडों में।

  1. 0 दिन, साथ दिवस 0 भेदभाव मीडिया KOSR आधारित मीडिया की जगह से भेदभाव शुरू करते हैं।
  2. दिन 1 और 2 पर, धीरे श्वास से पहले monolayer से किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए थाली हिला। दिन 1-2 भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  3. 3 दिन, प्रवाह cytometry के लिए फसल कोशिकाओं। कोशिकाओं को व्यक्त करता है, तो 90% से अधिक CXCR4 + / CD117 + चरण 2.4 आगे बढ़ें।
  4. दिन 3 और 5 पर, धीरे श्वास से पहले monolayer से किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए थाली हिला। डे 3-5 भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  5. दिन 6 और 7 पर, दिन में 6-7 भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  6. दिन 8, 10 और 12 पर, दिन 8-12 भेदभाव मीडिया के साथ बदलें।
  7. 13 दिन, प्रवाह के लिए फसल कोशिकाओं cytometry Pdx1 और NKX6-1 अभिव्यक्ति का निर्धारण।

3. फ्लो का विश्लेषण के लिए कटाई प्रकोष्ठों

  1. साथ कोशिकाओं को अलग कर देना1x वाणिज्यिक trypsin समाधान निर्माता प्रोटोकॉल और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते के अनुसार।
  2. 30 μl DNase मैं के साथ 1,000 μl FACS बफर में वाणिज्यिक trypsin समाधान निकालें और एकल कोशिकाओं resuspend
  3. फ़िल्टर कोशिकाओं को एक 35 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल झरनी और एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण का उपयोग कर।
  4. 5 मिनट के लिए 455 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। या तो रहते हैं या तय धुंधला के लिए कोशिकाओं को तैयार।

4. से फ्लो के लिए धुंधला

  1. 3 दिन पर लाइव धुंधला के लिए तैयारी प्रवाह
    1. 1,000 μl FACS बफर में Resuspend कोशिकाओं। स्थानांतरण 200 μl (लगभग 1-3 x 10 5 कोशिकाओं) एक 96 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में (दोनों बेदाग और दाग नमूने के लिए)।
    2. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    3. एपीसी और CD117: प्राथमिक संयुग्मित एंटीबॉडी, CXCR4 साथ दाग पीई 3 के लिए (एम aterials तालिका देखें)कमरे के तापमान पर 0 मिनट प्रकाश से रक्षा की।
    4. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    5. 100 μl FACS बफर में Resuspend नमूने हैं।
    6. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    7. 1 मिलीलीटर सूक्ष्म टेस्ट ट्यूब या 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के लिए 300-500 μl FACS बफर की कुल मात्रा में प्रत्येक नमूना और हस्तांतरण Resuspend।
    8. कोशिकामापी 17 प्रवाह पर चलाने के नमूने हैं। नमूने तुरंत नहीं चलाया जा सकता है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान प्रकाश से रक्षा की।
  2. 13 दिन पर तय धुंधला के लिए तैयारी प्रवाह
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए वाणिज्यिक निर्धारण / permeabilization समाधान में सेल गोली Resuspend।
    2. 5 मिनट के लिए 455 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। 400 μl पेर्म / धो समाधान में Resuspend।
    3. TW के लिए नमूना (लगभग 0.5-1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) के 200 μl स्थानांतरणएक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं ओ (आईजीजी नियंत्रण और Pdx1 / NKX6-1 धुंधला के लिए)। 2 मिनट के लिए 931 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. 100 μl पेर्म / धो विरोधी Pdx1 और विरोधी NKX6-1 प्राथमिक या निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी युक्त समाधान में सेल छर्रों Resuspend (देखें सामग्री तालिका)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    5. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें। 100 μl पेर्म / धो समाधान में Resuspend नमूने हैं।
    6. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    7. 1 घंटा प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए 100 μl पेर्म / धो में नमूने कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त Resuspend।
    8. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    9. 100 μl पेर्म / धोने समाधान में Resuspend नमूने हैं।
    10. 2 मिनट के लिए 931 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    11. निरसितकदम 4.2.9 और 4.2.10 खाते हैं।
    12. 1 मिलीलीटर सूक्ष्म टेस्ट ट्यूब या 5 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूबों के लिए 300-500 μl FACS बफर की कुल मात्रा में प्रत्येक नमूना और हस्तांतरण Resuspend।
    13. कोशिकामापी 17 प्रवाह पर चलाने के नमूने हैं। नमूने तुरंत नहीं चलाया जा सकता है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान प्रकाश से रक्षा की।

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Representative Results

के रूप में चित्रा 1 ए में योजनाबद्ध में सचित्र अग्नाशय progenitors के कुशल उत्पादन, उचित वृद्धि और भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान विशिष्ट संकेतन अणुओं की सटीक अलावा द्वारा पीछा undifferentiated कोशिकाओं के रखरखाव पर निर्भर करता है। 0 दिन, undifferentiated कोशिकाओं 80-95% मिला हुआ होना चाहिए और कालोनियों में परिभाषित किनारों (चित्रा 1 ए) होना चाहिए। चरण 1 के दौरान मीडिया की संभावना बादल दिखाई देगा के बाद से कोशिका मृत्यु इस स्तर पर काफी आम है। चरण 1 के अंत तक, कोशिकाओं निश्चित एण्डोडर्म मार्कर, CXCR4 और CD117, सह-व्यक्त करना चाहिए एक अनुपात 90% से अधिक (चित्रा 1 बी) पर।

कोशिकाओं चार चरण प्रोटोकॉल भर में अंतर के रूप में, एक लम्बी, अंडाकार की तरह उपस्थिति से उनकी आकृति विज्ञान परिवर्तन (चरणों 1 में मनाया जाता है और 2) छोटे, ऑलराउंडर कोशिकाओं (के रूप में चरणों 3 पर देखा और 4) ( + / NKX6-1 + प्रवाह cytometry द्वारा पुष्टि की है। चित्रा 1C में दिखाया प्रतिनिधि चित्र में, 13 दिन में NKX6-1 + की अभिव्यक्ति के लगभग 88% है। के रूप में सचित्र, मंच के सभी 4 व्युत्पन्न NKX6-1 + कोशिकाओं सह एक्सप्रेस PDX-1 +, अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की एक विशेषता। हालांकि, NKX6-1 अभिव्यक्ति अलग सेल लाइनों भर में बदलता है, और पिछले एक रिपोर्ट से पता चला है NKX6-1 + अभिव्यक्ति 30.5-91.4% 8 अलग hPSC लाइनों में 3 का परीक्षण से चलता है कि।

आकृति 1
चित्रा 1: hESCs और समर्थन डेटा से अग्नाशय के पूर्वज भेदभाव के योजनाबद्ध। (ए) hESCs से अग्नाशय के पूर्वज की प्रेरण के योजनाबद्ध। भेदभाव के दिन, developmentÃएल मंच, आधार मीडिया, और साइटोकिन्स हर स्तर पर जोड़ा शामिल किए गए हैं। नीचे, अग्नाशय भेदभाव के प्रमुख चरणों में चरण विपरीत चित्र दिखाए जाते हैं। सभी प्रतिनिधि आंकड़े में एच 1 कोशिकाओं 4 चरण भेदभाव से ऊपर दर्शाया प्रोटोकॉल के अनुसार भेदभाव कर रहे थे। दिवस 0, undifferentiated hESCs; चरण 1, निश्चित एण्डोडर्म; स्टेज 2, पीछे अग्रांत्र; चरण 3, Pdx1 + एण्डोडर्म; स्टेज 4, NKX6-1 + एण्डोडर्म / अग्नाशय progenitors। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (बी) के दिन 3 प्रतिनिधि प्रवाह cytometry CXCR4 के लिए भूखंडों: पीई और CD117: एपीसी एंटीबॉडी धुंधला। छोड़ दिया, सही पर दाग नमूना पर बेदाग नमूना। (सी) दिवस चरण -4 निकाली गई अग्नाशय कोशिकाओं पूर्वज NKX6-1 और Pdx1 व्यक्त करने के लिए 13 प्रतिनिधि से फ्लो साजिश है। छोड़ दिया, सही पर दाग नमूना पर आईजीजी नियंत्रण। ; hESC - Activin एक - मानव भ्रूण स्टेम सेल, एक अधिनियम bFGF - बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक, FGF10 - fibroblast वृद्धि कारक 10, डीएम - dorsomorphin, खूंटी - नोगिन, आरए - retinoic एसिड, EGF - epidermal वृद्धि कारक, एनए - निकोटिनामाइड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सफलतापूर्वक इन विट्रो में hPSCs से NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज पैदा hPSCs की उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों और निर्देशित भेदभाव विशिष्ट संकेत दे रास्ते कि अग्नाशय के विकास के दौरान महत्वपूर्ण विकास के चरणों शासन के सटीक विनियमन को शामिल के उपयोग पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल के रूप में पहले 3 दिखाया गया है, कुशल NKX6-1 पीढ़ी निम्नलिखित बातों बनाया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए hPSC लाइनों की एक किस्म भर में NKX6-1 के मजबूत अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि सभी सेल संस्कृति और मीडिया तैयारी के क्रम में प्रदूषण को रोकने के लिए एक बाँझ वातावरण में किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि hESC कालोनियों उचित confluency पर पहुँच गए हैं और भेदभाव के दिन 0 शुरू करने से पहले अंतर करने के लिए शुरू नहीं किया है। hESCs कि इष्टतम निश्चित एण्डोडर्म और आगे बढ़ने से विकास का अकुशल प्रेरण में परिणाम कर सकते हैं के साथ भेदभाव नहीं शुरूअल चरणों। यही कारण है कि यह निश्चित एण्डोडर्म के कुशल प्रेरण सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा 3 दिन में कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। डबल सकारात्मक CXCR4 + 3 दिन में CD117 + कोशिकाओं का प्रतिशत कुशल अग्नाशय विकास 3 के लिए 90% से अधिक होना चाहिए। दोनों CXCR4 और CD117 व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत से कम 90% है, अग्नाशय progenitors के लिए कुशल प्रेरण संभावना समझौता हो जाएगा (परिणाम दिखाया गया है)। इसके अलावा, क्या पहले प्रकाशित किया गया था के विपरीत, यह आवश्यक नहीं चरण के साथ 1 मीडिया 16 खिलाने से पहले RPMI के साथ कोशिकाओं को धो रहा है। मीडिया aspirating से पहले थाली के कोमल झटकों monolayer से मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पर्याप्त है।

चरण 2 पर dorsomorphin के अलावा केवल विशिष्ट hPSC लाइनों 18 के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है। इस प्रकार, यह जब di के साथ काम करता है, तो dorsomorphin आवश्यक है निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है fferent hPSC लाइनों। इसके अतिरिक्त, स्टेज 3 की अवधि या तो monohormonal या polyhormonal पूर्वज कोशिकाओं और सेल लाइन पर निर्भर 3 निर्दिष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है। इस प्रकार, जब एक नया hPSC लाइन के साथ काम कर रहे हैं यह अवधि निर्धारित करने के लिए है कि कोशिकाओं स्टेज में सभ्य होना चाहिए 3 मीडिया NKX6-1 प्रेरण के लिए इष्टतम स्थितियों निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को 1-4 दिनों के लिए स्टेज में सभ्य होना चाहिए 3 मीडिया और NKX6-1 अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा 5 दिन बाद का विश्लेषण किया।

कुशलतापूर्वक NKX6-1 + कोशिकाओं में समृद्ध आबादी पैदा करने, महत्वपूर्ण है, क्योंकि Nkx6-1 βcell विकास 14 के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरों प्रोटोकॉल विकसित किया है जबकि उस NKX6-1 + कोशिकाओं (लगभग 60% एच 1 व्युत्पन्न NKX6-1 + कोशिकाओं और 55% HUES8 व्युत्पन्न PDX + / NKX6-1 + कोशिकाओं) से 4 hESC अंतर कर सकते हैं,"xref"> 5, हमारे विधि लगातार> 80% एच 1 व्युत्पन्न Pdx1 + / NKX6-1 + कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। हालांकि, हमारे भेदभाव प्रोटोकॉल माउस भ्रूणीय fibroblasts का उपयोग करें, जो करने के लिए अनुसंधान केवल इसके उपयोग को सीमित करता है, हम अभी तक विनिर्माण आचरण अच्छा में विधि अनुकूलन करने के लिए है, के रूप पर निर्भर करता है। हालांकि हम अपनी चरण -4 निकाली गई Pdx1 + / NKX6-1 + कोशिकाओं cryopreserve करने का प्रयास नहीं किया है, इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक Schulz एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया है। , जो प्रदर्शन किया है कि cryopreserved अग्नाशय समुच्चय विवो 19 में उनके कार्य को बनाए रखने में सक्षम थे।

इस पत्र में हम एक 4 चरण प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक hPSC लाइनों की एक किस्म से Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय पूर्वज उत्पन्न करने का वर्णन है। अग्नाशय के विकास के चार प्रमुख चरणों के माध्यम से hPSC फर्क द्वारा, इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में मानव अग्न्याशय के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करता है। Furthermore, क्योंकि Pdx1 + / NKX6-1 + कोशिकाओं संभावित दोनों vivo में इन विट्रो में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए (डेटा नहीं दिखाया गया है) 3, 4, 5, hESC व्युत्पन्न Pdx1 + / NKX6-1 + अग्नाशय progenitors मधुमेह के उपचार के लिए एक संभावित स्रोत प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह पांडुलिपि से टोरंटो जनरल और पश्चिमी फाउंडेशन और बैंटिंग और बेस्ट मधुमेह केन्द्र-विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क ग्रेजुएट पुरस्कार धन के द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG) Sigma M6145
Activin A R&D 338-AC/CF 
Ascorbic Acid Sigma A4544
B-27 Supplement Life Technologies 12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm Buffer BD Bioscience 554722
BD Perm/Wash buffer, 1x BD Bioscience 554723
bFGF R&D 233-FB
CHIR990210 Tocris 4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995
DNase I VWR 80510-412 
Dorsomorphin Sigma P5499
EGF R&D 236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 88150
FGF10 R&D 345-FG
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Glutamine Life Technologies 25030
Nicotinamide Sigma NO636
NOGGIN R&D 3344-NG
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063
Retinoic acid Sigma R2625
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875
SANT-1 Tocris 1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Life Technologies 12605-010
Name Company Catalogue Number Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100) Life Technologies CD11705
CXCR4 APC (1:50) BD  Bioscience 551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) Life Technologies A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 705-546-147
Isotype Control Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.  015-000-003
Isotype Control Goat IgG R&D   AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000) DSHB F55A10
PDX1 (1:100) R&D AF2419

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
  2. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
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McGaugh, E. C., Nostro, M. C.… More

McGaugh, E. C., Nostro, M. C. Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors. J. Vis. Exp. (121), e55265, doi:10.3791/55265 (2017).

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