Summary
Helsetilstanden til lungen blir reflektert av type og antall av immunceller som er til stede i bronkiolene av lungen. Vi beskriver en bronkoalveolar vasking teknikk som gjør mulig isolering og undersøkelse av ikke-adherente celler og løselige faktorer fra den nedre luftveier hos mus.
Abstract
Bronchoalveolar Lavage (BAL) er en eksperimentell prosedyre som brukes til å undersøke det cellulære og acellulære innholdet i lungelumen ex vivo for å få innsikt i en pågående sykdomstilstand.
Her beskrives en enkel og effektiv metode for å utføre BAL på munge lunger uten behov for spesialverktøy eller utstyr. BAL-væske er isolert ved å sette et kateter i luftrøret av terminalt bedøvede mus, hvorved en saltoppløsning innsettes i bronkiolene. Den innfyllte væsken trekkes forsiktig inn for å maksimere BAL-væskeopphenting og for å minimere skjærekraften. Denne teknikken gjør det mulig å bevare livskraften, funksjonen og strukturen av celler i luftveiene og BAL-væsken.
Tallrike teknikker kan brukes for å få ytterligere forståelse av sykdomstilstanden til lungen. Her er en vanlig teknikk for identifisering og oppregning av forskjellige typer immuncellerbeskrevet, hvor strømningscytometri er kombinert med en utvalgt panel av fluorescensmerkede celleoverflate-spesifikke markører. BAL prosedyre som presenteres her, kan også brukes til å analysere infeksiøse midler, fluidbestanddeler eller inhalerte partikler i murine lungene.
Introduction
Luftveiene møter mange fornærmelser, noe som kan føre til betennelse, patogen invasjon eller ondartet transformasjon. Epitelceller som strekker lungelumenet danner en av de store barrierene i pattedyrskroppen. Sammen med alveolære makrofager forhindrer de miljøstrusler fra å få tilgang til det systemiske systemet via luftveiene. Eksempler på slike trusler inkluderer organiske og uorganiske kjemikalier, bakterier og virus. På samme måte kan spesifikke immuniseringer eller terapeutiske inngrep utformes for å målrette lungene. I alle disse tilfellene er en grundig analyse av det fremkallte svaret viktig for å forstå, gripe inn eller forhindre biologiske prosesser som finner sted i luftveiene.
Bronchoalveolar lavage (BAL) er en uvurderlig metode for å analysere slike svar, da de resulterende prøver inneholder viktig informasjon om de inflammatoriske responsene, immunmekanismer og infeksjonssykdomsprogresjonsom kan forekomme i lungeluftveiene 1, 2. Ved å bruke BAL, er det mulig å studere infiltrere celler. Dette står i kontrast med ford lunger, som gir en "skitnere" celle befolkning, med mange døde og klissete celler. BAL blir utført ved innføring av en saltløsning inn i de terminale bronkioler og deretter gjenvinne denne løsningen. Den hentede -løsningen kan så brukes til å kvantifisere og fenotypisk analysere hørende lunge og infiltrerende inflammatoriske celler. Denne metode blir ofte benyttet for å studere celleinnstrømning i sykdomsmodeller i luftveiene, slik som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), og infektiøse sykdomsmodeller. Bortsett fra den cellulære sammensetning, blir den molekylære sammensetning av lungeluftveiene også reflektert i BAL-fluidet. For å analysere dette, kan Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot, og den samtidige analyse av multiple cytokiner ved et cytokin vulst matrise væreutført for å vurdere tilstedeværelse av cytokiner og kjemokiner.
BAL er en veletablert metode for å studere tilstrømning av betennelsesceller i inflammatoriske luftveissykdommer dyremodeller. Observasjonen av en endret cellulær innstrømning (f.eks, økte nivåer av lymfocytter, eosinofiler eller neutrofiler) kan føre til bedre innsikt i sykdommen, og kan være en objektiv parameter for å vurdere ytelsen av en terapeutisk intervensjon.
Den nøyaktig og reproduserbar tolkning av BAL cellulær analyse krever at BAL utføres korrekt, og at det oppsamlede fluid blir håndtert og behandlet på riktig måte. Begrepet "bronkial kylling" ble introdusert mer enn åtti år siden av Stitt 3. I 1961 Myrvik oppnådd alveolære makrofager fra vaskefluidet av kanin lungene 3. BAL er nå en vanlig brukt metode for å analysere og overvåke lungene i musemodellen, men likevelre er fortsatt ingen rapport av en standardisert BAL prosedyre i den vitenskapelige litteraturen 4, 5. Videre er det sannsynligvis like mange måter å utføre BAL som det er forskningslaboratorier ved hjelp av teknikken 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Det er viktig at de data som oppnås fra BAL representere hele murine lungen, og ikke bare en del av lungen. Denne type av variasjon kompliserer tolkningen og sammenligning av resultater mellom forskjellige forsøk.
Her er en grunnleggende, billig, og reproduserbar BAL prosedyre som er beskrevet som tillater oppsamling av den cellulære og løselige fraksjon til stede i luftveislumen på musen. Kort sagt, blir en kateter plassert i den eksponerte trachea ofa terminalt bedøvet mus. En sprøyte er forbundet til kateteret, og en bufret saltvannsløsning inneholdende etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) tilføres til lungene. Lunge lumen blir samplet ved forsiktig gjentatt spyling av saltoppløsning ved bruk av stemplet. Det negative trykk som utøves under dette trinn er minimal for å forhindre luftveiene kollaps. Etter samling, må det oppnådde BAL bli behandlet videre for å nummerere og identifisere celler ved flow cytometri.
Protocol
Alle dyreforsøk som er beskrevet i denne undersøkelsen ble utført i henhold til nasjonal lov (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongelig dekret 06/04/2010) og europeisk lovgivning (EU-direktiv 2010/63 / EU og 86 / 609 / EEC). Alle eksperimenter på mus og alle dyreprotokoller ble godkjent av etisk utvalg av Ghent University (tillatelsesnummer LA1400091 og EC2016-027).
1. Fremstilling
- Lavage væske
- Forbered en balansert saltløsning med 100 μM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
MERK: For å måle proteinnivåer i BAL-væsken, anbefales det å legge til proteasehemmere for å forhindre proteaseaktivitet i BAL-væsken.
- Forbered en balansert saltløsning med 100 μM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
- kateter
- Lag et kateter ved å sette inn en 23 G nål i gjennomsiktig plastpolyetylen 21 G slange (indre diameter: 0,58 mm, ytterdiameter: 0,965 mm og lengde: 0,5 cm). Premade katetre kan også brukes.
- AnesthETICS
- Forbered en terminal bedøvelse, helst en som forårsaker åndedrettsstanse ( f.eks. En barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) løsning i fosfatbuffert saltvann (PBS)).
MERK: Det anbefales å bruke injeksjonsbedøvelse i stedet for inhalert anestesi, da inhalert anestesi kan påvirke BAL-væsken. CO 2 har for eksempel innflytelse på blodets pH og følgelig på omfordeling av forskjellige forbindelser 12 .
- Forbered en terminal bedøvelse, helst en som forårsaker åndedrettsstanse ( f.eks. En barbiturat som natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) løsning i fosfatbuffert saltvann (PBS)).
- Ammoniumklorid-kalium (ACK) røde blodcellelysebuffer
- Klargjør en ACK lysisbuffer ved å oppløse 8,29 g NH4Cl og 1 g KHCO3 i 1 liter H20 med 100 μM EDTA; Rød blodcellelyserbuffer kan også kjøpes fra en ekstern kilde.
2. Utførelse av Bronchoalveolar Lavage (BAL)
- Introduksjon av kateteret i luftrøret
- Euthanize musen ved intraperitoneal injeksjon av en dødelig dose av en kortvirkende barbituratbedøvelse ved hjelp av en 26 G nål. For å bekrefte riktig dødbringende anesthetisering, klemmer du den bakre poten med musen for å kontrollere fotrefleksen.
- Plasser dyret på ryggen på en kirurgisk tallerken og fest musen ved å klemme ned lemmerne.
- Spray 70% etanol på halsen for å desinfisere. Ta et snitt i nakken i nærheten av luftrøret ved hjelp av en skalpell.
- Åpne huden for å avsløre spyttkjertlene. Separat spyttkjertlene ved å bruke pincers for å avsløre sternohyoid muskel. Opplev muskelen rundt luftrøret ved å bruke pincers for å avsløre luftrøret.
- Legg en bomullstråd under luftrøret ved å bruke pincers.
- Pek forsiktig midt på den eksponerte luftrøret mellom to bruskringer med en 26 G nål. Pass på at du ikke skader luftrøret lenger.
- Sett kateteret ca. 0,5 cm inn i luftrøret. Pass på at kattenter ikke er satt inn for langt ned i luftrøret, da dette kan føre til skade på lungen struktur.
- Stabil kateteret ved å binde luftrøret rundt kateteret ved hjelp av bomullstråd ble plassert i trinn 2.1.5. Dersom kateteret ikke er bundet i tilstrekkelig grad, kan den injiserte balanserte saltløsning, strømme mot den øvre del av luftveiene i stedet for ned i lungene.
- Samle vaskefluidet
- Laster en 1 ml sprøyte med 1 ml sterilt balanserte saltløsning med 100 mM EDTA.
- Koble 1 ml sprøyte til kateteret og forsiktig injisere salt / EDTA-løsning i lungen.
- Aspirer løsningen forsiktig mens masserer thorax av musen. Hvis aspiratet væske er ikke synlig i sprøyten, setter forsiktig kateteret litt lengre ned eller opp i luftrøret.
- Fjerne sprøyten fra nålen og overføre den gjenvundne vaskevæske inn i et 15 ml rør plassert på is. Normalt 700-900 &# 181; l av BAL utvinnes fra 1 ml av injisert oppløsning.
- Gjenta trinn 2.2.1 - 2.2.4 to ganger mer.
MERK: Hvis formålet er å analysere ikke-cellulær innhold, anbefales det å konsentrere samleprøver når det er problemer med følsomhet.
3. Oppsamling av de cellulære og ikke-cellulære komponenter i BAL-fluidet
- Sentrifuger vaskevæske i 7 minutter ved 400 xg og 4 ° C.
- Samle supernatanten og straks bruke den for videre analyse (for eksempel ELISA) eller frysing ved -80 ° C. Hold cellepelleten for å analysere celleinnstrømning i lungene.
- Resuspender cellepelleten i 200 ul av ACK lysebuffer.
MERK: Dette trinnet sikrer lyse av erytrocyttene mens de hvite blodcellene intakt. - Inkuber i 2 min ved RT.
MERK: For å redusere variasjonen forårsaket av røde cellelyse, bør dette trinnet ikke utføres i mer enn 2 min. Tilsett 1 ml kald PBS for å fortynne den ACK lyseringsbuffer. - -Sentrifuge i 7 minutter ved 400 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og re-suspendere cellene i et tilstrekkelig volum av PBS for genetisk analyse (se nedenfor).
MERK: volumet av PBS er avhengig av nedstrøms undersøkelsen som skal utføres.
4. Analyse av de forskjellige celletyper i BAL-fluidet ved strømningscytometri
MERK: En mulighet er å analysere den absolutte og relative cellulære sammensetnin av BAL-fluidet ved å utføre strømningscytometri. Målet med denne artikkelen er å utdype teknikken for BAL. Flowcytometri er en spesialisert teknikk på egen hånd. Det anbefales å lese spesialiserte papirer på flowcytometri teknikk 13, 14, 15, 16, 17. Antistoffer koblet til en fluorofor tHue gjenkjenner overflateantigener (se tabell 1 ) som er spesifikke for en bestemt celletype (e), benyttes. Ved å bruke en gatingstrategi er det mulig å identifisere T-celler, makrofager, dendritiske celler, B-celler, eosinofiler og nøytrofiler i cellens fraksjon av BAL.
| antigen | Celletype |
| Cluster of differentiation 3 (CD3) | Uttrykt på T-celler |
| Cluster of differentiation 11c (CD11c) | Høyt uttrykk på de fleste dendritiske celler, men også på monocytter, makrofager, nøytrofiler og noen B-celler. |
| Cluster av differensiering 11b (CD11b) | Uttrykt på overflaten av mange leukocytter inkludert monocytter, nøytrofiler, naturlige drepeceller, granulocytter og makrofager. |
| SiglecF | ENLveolære makrofager og eosinofiler. |
| MHCII | Normalt finnes det bare på antigen-presenterende celler som dendritiske celler, mononukleære fagocytter og B-celler. |
| CD19 | B-lymfocytt antigen |
| Ly-6G | En markør for monocytter, granulocytter og nøytrofiler |
Tabell 1: Valg av immune celloverflateantigener. Dette tabellen gir en liste over overflateepitoper som brukes til å karakterisere de forskjellige celletyper. Kombinasjoner av flere markører vil bli pålagt å pålidelig definere en bestemt celletype.
| Prøver | ||||
| Rør | Antigen-fluorofor tilsettes til celler Antibody lager konsentrasjon (mg / mL) | Antistoff fortynning | Totalt volum (μL) | |
| Fixable levedyktighet fargestoff | 0.2 | 1/1000 | 50 | |
| CD11c | 0.2 | 1/800 | 50 | |
| SiglecF | 0.2 | 1/100 | 50 | |
| Prøve X | MHCII | 0.2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD11b | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| Spenningsregulering | ||||
| Rør | Antigen-fluorofor tilsettes til celler | Antibody lager konsentrasjon (mg / mL) | Antistoff fortynning | Totalt volum (μL) |
| Ufarvede celler | / | / | / | 50 |
| Enkeltfargede celler | Fixable levedyktighet fargestoff | 0.2 | 1/1000 | 50 |
| Enkeltfargede celler | CD11c | 0.2 | 1/800 | 50 |
| Enkeltfargede celler | SiglecF | 0.2 | 1/100 | 50 |
| Enkeltfargede celler | MHCII | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Enkeltfargede celler | CD3 | 00,2 | 1/200 | 50 |
| Enkelt fargede celler | CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Enkelt fargede celler | CD11b | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Enkelt fargede celler | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 |
| kompensasjon kontroller | ||||
| Rør | Antigen-fluoroforen som skal tilsettes til kulene | Antistoff-lager-konsentrasjon (mg / ml) | antistoff fortynning | Totalt volum (ul) |
| ufargede perler | / | / | / | 200 |
| Enkelt farget perler | CD11c | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkeltfargede perler | SiglecF | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkeltfargede perler | MHCII | 0.2 | 1/200 | 200 |
| Enkeltfargede perler | CD3 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkeltfargede perler | CD19 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkeltfargede perler | CD11b | 0.2 | 1/400 | 200 |
| Enkeltfargede perler | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 200 |
Tabell 2. Liste over kontroller som skal inkluderes. Tabellen viser alle nødvendige kontroller for nøyaktig tolkning av de oppnådde resultatene.
- Celleoverfletting
MERK: Det er impoRett til å inkludere alle kritiske kontroller for flowcytometrianalysen. Tre sett med rør er nødvendig (se tabell 2 ): (1) rør som inneholder prøvene; (2) rør med BAL-celler for hvert antistoff-fluorofor å lage enkle flekker; Dette tillater bestemmelse av spenningene for hver kanal på strømningscytometeret; Og (3) rør med perler for hvert antistoff-fluorfor å lage enkle flekker; Dette er å bestemme kompensasjonsmatrisen.- Lag en blanding av antistoffene og Fc-blokk (anti-CD16 / CD32) i PBS ved passende fortynninger (se tabell 2 ). Det er nødvendig å bestemme den optimale arbeidsfortynningen for hvert antistoff før forsøket.
- Resuspender cellene i 50 μl av antistoffblandingen for prøven og tilsett 50 μl av det passende fortynnede antistoff til de kritiske kontrollene.
MERK: Fargingen kan utføres i en 96-brønn, u-formet plate. Dette gjør det mulig å enkelt redusere flekkvolumet and kjøre betydelige mengder av prøver. - Inkuber i 30 minutter i mørket ved 4 ° C.
- -Sentrifuge i 7 minutter ved 400 xg og 4 ° C. Kast supernatanten.
- Resuspendere cellene i PBS til et sluttvolum på 200 ul.
MERK: Denne endelig volum avhenger av minimalt volum flowcytometeret har tilgang til. Dette kan avvike noe mellom maskinene. I tillegg avhenger lese volum på antall celler og / eller tid prøven vil ta for å kjøre i strømningscytometer. - Bruk at prøvene og kontrollene for flowcytometrisk analyse.
MERK: For å bestemme det absolutte celle-antallet av de forskjellige cellepopulasjoner, bør telle perler tilsettes. Tilsett samme antall perler (± 25.000 perler) til hver prøve før måling. Ved å bruke forover og sidespredning, teller perler kan identifiseres ved flow-cytometri (se figur 1). Deretter kan det absolutte antall celler i prøven beregnes ved å sammenlikne thE forholdet mellom perlehendelser og cellehendelser. Følgende formel kan brukes:
- Flowcytometrisk analyse
MERK: Den flytende cytometriske analysen skal gjøres umiddelbart etter ferdigstillelse av fargeprotokollen. Et strømningscytometer med passende lasere og filtre for signaldeteksjon må brukes. Tabell 3 gir en oversikt over de lasere og filtre som trengs for studien beskrevet i dette manuskriptet. For mer informasjon om flowcytometrisk analyse, se Adan et al. 18 .- Konfigurer de primære portene basert på fremover- og sidestrømpen, unntatt rusk og dubletter (se figur 1 ).
- Juster spenningen og kompensasjonen for spektral overlapping ved hjelp av enkeltfarget celler og perler.
MERK: Disse innstillingene er forskjellige for hvert flytcytometer og må kontrolleres før hvert eksperiment. FEller korrekt strømningsanalyse, er spenningen forover- og sidespredningen kritisk. En korrekt forover- og sidestrømning kan bidra til identifisering og bekreftelse av identiteten til de analyserte cellene. For å bestemme disse spenningene, bør en ufarget prøve kjøres først. - Sett opp fluorescensportene for overflateantigenet (se figur 1 ) og analyser prøvene.
| Lasertype | Filtreringsoppsett | |
| 505 LP | 525/50 | |
| Blå (488 nm) | 550 LP | 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 | |
| Violet 405 nm | 450/50 | |
| 100 mW | ||
| rød 633 nm | 660/20 | |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
Tabell 3: Oversikt over Lasere og filtre i Flowcytometer brukt i denne studien.
Representative Results
Etter å ha utført BAL med 3 x 1 ml bufret saltløsning, bør et volum mellom 2 og 3 ml utvinnes. Dette BAL-væsken kan analyseres videre for å karakterisere det cellulære og ikke-cellulære innholdet. For å undersøke nærværet av cytokiner og kjemokiner, kan ELISA 19 , immunblot 20 og den samtidige analysen av flere cytokiner ved hjelp av et cytokinpillearrangement 21 utføres. I tillegg kan albumin og total proteininnhold av dette fluidet bestemmes 22 .
Som et eksempel beskriver dette manuskriptet hvordan man analyserer det cellulære innholdet i BAL-væsken ved hjelp av flytcytometri. Det analyserte BAL-fluidet ble samlet fra kvinnelige Balb / cAnNCrl-mus (alder: 7 uker) 24 timer etter at de ble intratrachealt inntrukket med lipopolysakkarid. De følgende antistoffer, koblet til en fluorofor, wEre brukes til å identifisere de forskjellige celletyper: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g og CD11b (se tabell 1 og tabell over materialer ). Den fikserbare levedyktighetsfargen ble også brukt. Ved å bruke en gatingstrategi basert på differensialuttrykket av antigener på overflatene av de forskjellige cellepopulasjonene ( Figur 1 ), var det mulig å identifisere makrofager, dendritiske celler, B-celler, T-celler, nøytrofiler og eosinofiler.
Først ble rusk og dubletter utelukket basert på frem- og side-scatter parametere. En levedyktighet fargestoff lettet gating på levende celler. Deretter ble CD11c-høyceller og CD11c-lave celler identifisert. I den CD11c høye befolkningen ble makrofager og dendritiske celler identifisert basert på henholdsvis MHCII og SiglecF-ekspresjon. I CD11c-lavpopulasjonen ble T-celler og B-celler identifisert basert på henholdsvis CD3ε og CD19-ekspresjon. I thE gjenværende cellepopulasjon, nøytrofiler og eosinofiler ble identifisert basert på henholdsvis CD11b og Ly-6G markøruttrykk.
Telleperler ble tilsatt for å bestemme de absolutte celle tallene for de forskjellige cellepopulasjonene ved å sammenligne forholdet mellom beadhendelser og cellehendelser 23 . Disse telleperlene ble identifisert basert på deres frem- og sidestrømsegenskaper ( figur 1 ). Tabell 4 gir en oversikt over de absolutte celle tallene for de forskjellige cellepopulasjonene i BAL-væsken av en naiv mus og en mus som ble stimulert i 24 timer med 5 ug lipopolysakkarid.
Figur 1: Gatingstrategi for strømningscytometrisk deteksjon av makrofager, dendritiske celler, T-celler, B-celler, nøytrofiler og eosinofiler iN BAL-væske. BAL-celler ble isolert ved anvendelse av den beskrevne BAL-protokollen. Celler ble isolert fra mus 24 timer etter intratracheal instillasjon av lipopolysakkarid. Telleperler og celler ble identifisert basert på frem- og side-scatter egenskaper. I celleporten ble enkeltceller identifisert ved bruk av frem- og sidestrømning. I denne siste populasjonen ble celler som var i live identifisert. CD11c-høyceller og CD11c- lave celler ble deretter identifisert. I den CD11c høye befolkningen ble makrofager og dendritiske celler identifisert basert på henholdsvis MHCII og SiglecF-ekspresjon. I CD11c-lavpopulasjonen ble T-celler og B-celler identifisert basert på henholdsvis CD3ε og CD19-ekspresjon. I den gjenværende cellepopulasjonen ble nøytrofiler og eosinofiler identifisert basert på henholdsvis CD11b og Ly-6G-ekspresjon. Vennligst klikk her for å se enStørre versjon av denne figuren.
| Cellepopulasjon | Absolutt antall celler i naive mus | Absolutt antall celler i LPS-stimulerte mus |
| makrofager | 79612 | 25439 |
| Dendritiske celler | 495 | 671 |
| T-celler | 45271 | 28089 |
| B-celler | 4164 | 2926 |
| nøytrofile | 632 | 566716 |
| eosinofile | 3483 | 4332 |
Tabell 4: Representerav kvalitativ Resultater av flowcytometrianalyse på BAL-fluidet av naive og LPS-stimulerte mus.
Discussion
BAL er en nyttig teknikk for å oppnå cytologiske og biokjemisk informasjon som svar på infeksjoner eller narkotika. Til å begynne med BAL ble brukt til å styre den overdreven slimproduksjon i humane pasienter som lider av fosgen toksisitet 3. I dag er den teknikk som anvendes i mennesker for å undersøke lunge patogenese, diagnose og terapeutisk behandling av sykdommer 3, 24. I laboratoriedyr, blir BAL vanligvis brukes til å overvåke inflammatoriske responser, immunmekanismer, og infeksiøse sykdomsprosesser som forekommer i lungeluftveiene 1, 2.
For å studere den inflammatoriske cellulære mønster i respiratoriske sykdomsmodeller, bør BAL følges av absolutte og differensial celletelling. I tillegg til det absolutte celle nummer, de relative celleantall er også av interesse. For eksempel, reparasjon og kreft modeller viser vEry liten eller ingen BAL celletall øker. I denne modellen er vurderingen av cellulær sammensetning nyttig. Ved å bruke cellefarging kombinert med lysmikroskopi, kan forskjellige celletyper, som eosinofiler, nøytrofiler, makrofager og lymfocytter, identifiseres basert på morfologi 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flowcytometri kan brukes til spesifikke vurderinger, for eksempel å identifisere forskjellige T-cellefenotyper 7 , 31 . I tillegg til identifisering av de forskjellige infiltrerende cellepopulasjonene, kan den ikke-cellulære sammensetningen av lungen undersøkes ved bruk av BAL. Metoder som ELISA, immunblot, cytokinperlermatrise, immunhistokjemi og kvantitativ polymerasekjedereaksjon utføres på BAL-væske for å bestemme cytokiner, vekstFaktorer og andre inflammatoriske komponenter. For å bestemme lungeskader kan total protein og laktat dehydrogenase nivåer i BAL væsken også måles 32 , 33 .
Med utviklingen av nye diagnostiske verktøy vil den genomiske og proteomiske karakteriseringen av BAL-komponenter være mulig i nær fremtid. Kombinasjonen av å utvide beregningsmessige evner og høy-gjennomstrømmingsgeneksjonsteknologi vil gjøre det mulig å definere spesifikke genuttrykksprofiler for ulike sykdomstilstander. Utførelse av disse teknikkene på BAL-væske kan gi gen- og proteinuttrykksmønstre for å identifisere de viktige molekylene som er involvert i de forskjellige faser av lungesykdommer.
Hovedbegrensningen av data oppnådd fra BAL-væske er mangelen på sammenlignbarhet mellom ulike forsøksforsøk 3 , 9 . Det er en høy grad avvariabilitet i lavage teknikk og den etterfølgende behandling av BAL-fluidet. For å kunne sammenligne hver BAL prøveperioden, er det nødvendig å standardisere typen av vaskevæske som er innpodet, stedet for drypping, og den fraksjonen som skal bli analysert for cellulær og ikke-cellulær sammensetning. Det er betydelige forskjeller i antallet av skyllevæske fraksjoner mellom forskjellige forsøk, varierende fra en til 14 ganger 34, 35, 36. Denne forskjellen kan ha en innvirkning på de estimerte totale celleantall i lungene. Det er viktig å vite hvilke BAL væske brøkdel inneholder de fleste av cellene. Song et al. viste at ca. 70% av det totale antall celler ble gjenfinnes i fraksjon 1-3 22. Men andre rapporter antydet at den andre lavage inneholdt flere celler enn den første 37, 38
Den ikke-cellulære sammensetningen av BAL-væsken inneholder verdifull informasjon om helsestatusen til lungene 33 , 39 , 40 . Variasjoner i fortynningen av BAL-væsken bidrar til forskjellen i kvantifiseringen av den løselige fraksjonen og følgelig til forskjeller i resultatene mellom forsøkene. Song et al. Sammenlignet protein- og laktatdehydrogenase-nivåene i hver lavningsfraksjon og konkluderte med at den første lavningsfraksjonen inneholdt to til tre ganger mer enn den andre fraksjonen.
For å hente en representativ BAL-prøve for analyse, er noen tekniske hensyn avgjørende. En av dem er å utføre riktig bedøvelse. Det er veldig viktig å sjekke fotreflex av musen for å sikre terminal sedasjon. Dette er ikke bare viktig for etiske grunner, men også fordi det er vanskelig å plassere og holde kateteret i riktig posisjon hvis musen ikke er ordentlig bedøvet.
En annen viktig teknisk betraktning er posisjonen av kateteret i luftrøret. Når kateteret er satt inn for dypt, kan det skade lungestrukturen. Den distale ende av kateteret bør ikke nå lungene i løpet av BAL prosedyre. Kateteret bør også være stabilisert og bundet av med en bomullstråd. Dersom kateteret ikke er stabilisert, kan den injiserte saltløsning strømme oppover inn i det nasale hulrom i stedet for ned i lungene. Under injeksjon og aspirasjon av saltløsningen, er det viktig å holde kateteret stødig.
Resultatene oppnådd fra BAL-fluidet data skal representere hele murine lungen. Derfor er det viktig å innpode et tilstrekkelig volum av saltoppløsningsbuffer (dvs.3 ml, delt i 3 alikvoter på 1 ml hver). Det er ikke noe lineært forhold mellom celleutbyttet og BAL-fluidutbyttet. Det er viktig å samle opp løsningen forsiktig mens du masserer thoraxen til musen. Hvis skjærekraften er for sterk, kan livskraften, funksjonen og strukturen til cellene i luftveiene og BAL-væsken bli kompromittert. Hvis det aspirerte væsken ikke er synlig i sprøyten, beveger du kateteret dypere eller høyere i luftrøret forsiktig.
Spesiell oppmerksomhet bør gis til spesifikke aspekter ved behandling og analyse av BAL. Dette vil maksimere informasjonen beholdt fra BAL-prøver. Etter BAL er cellene i et næringsfattig saltvannsmedium. Det er derfor svært viktig å behandle prøvene innen 1 time etter BAL-prøvetaking. Hvis det er nødvendig med langvarig oppbevaring, er det nødvendig å bruke næringsstoffer.
For å bevare cellens levedyktighet, unngå rør som fremmer celleadhesjon til overflaten. Unngå ceNtrifugering av cellesuspensjoner ved hastigheter som sannsynligvis vil kompromittere cellulær integritet eller for å forhindre jevn resuspendering av de hentede BAL-cellene. BAL-væskeholdige celler bør sentrifugeres ved 400 xg og 4 ° C i 7 minutter. Det er viktig å huske på at cellesuspensjonene skal holdes ved 4 ° C under behandlingen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
LVH er vitenskapelig assistent ved Institutt for Biomedical Molecular Biology of Ghent universitet. ERJ er støttet av UniVacFlu, er tilskuddet nummer 607690. KR støttet av EU-FP7 prosjekt FLUNIVAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23 G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0.60 x 30 mm |
| 26 G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0.45 x 12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | nonpyrogenic and nontoxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 mL | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 mL | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile-filtered |
| live/dead - efluor 506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
References
- Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
- Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
- Gee, J. B., Fick, R. B.
- Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
- Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
- Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
- Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
- Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
- Baughman, R. P.
- Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
- Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
- Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
- Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
- Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
- Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
- Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
- Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
- Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
- Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
- Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
- Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
- Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
- Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
- Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
- Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
- Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
- Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
- Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).
