Summary
Eine einfache Homogenisierung wurde verwendet, um neuartige, hochdichte, lipoproteinimimierende Nanopartikel herzustellen, um den Nervenwachstumsfaktor einzukapseln. Herausforderungen, detaillierte Protokolle für die Nanopartikelpräparation, in vitro Charakterisierung und in vivo Studien sind in diesem Artikel beschrieben.
Abstract
Das Ziel dieses Artikels ist es, Präparations- und Charakterisierungsmethoden für Nervenwachstumsfaktor (NGF) -belastete, hochdichte, lipoprotein (HDL) -Mimiking-Nanopartikel (NPs) einzuführen. HDLs sind endogene NPs und wurden als Vehikel für die Lieferung von therapeutischen Mitteln untersucht. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Allerdings sind sie in der Regel kompliziert, zeitaufwendig und schwierig für die industrielle Scale-up. In dieser Studie wurde eine einstufige Homogenisierung verwendet, um die Hilfsstoffe zu mischen und die Prototyp-NPs zu bilden. NGF ist ein wasserlösliches Protein von 26 kDa. Um die Verkapselung von NGF in die Lipidumgebung von HDL-imitierenden NPs zu erleichtern, wurde Protamin USP verwendet, um einen Ionenpaarkomplex mit NGF zu bilden, um die Ladungen auf der NGF-Oberfläche zu neutralisieren. Der NGF / Protamin-Komplex wurde dann in die Prototyp-NPs eingeführt. Apolipoprotein AI wurde schließlich auf die Oberfläche der NPs aufgetragen. NGF HDL-imitieren NPs zeigten bevorzugte Eigenschaften im BegriffS Partikelgröße, Größenverteilung, Einfangwirkung, In-vitro- Freisetzung, Bioaktivität und Biodistribution. Mit dem sorgfältigen Design und der Erforschung der Homogenisierung in HDL-imitierenden NPs wurde das Verfahren stark vereinfacht und die NPs wurden skalierbar gemacht. Darüber hinaus wurden verschiedene Herausforderungen wie die Trennung von unbelastetem NGF von den NPs, die Durchführung zuverlässiger in vitro- Freisetzungsuntersuchungen und die Messung der Bioaktivität der NPs überwunden.
Introduction
Makromoleküle wie Proteine, Peptide und Nukleinsäuren sind als vielversprechende Medikamente aufgetaucht und haben in den vergangenen Jahrzehnten erhebliche Aufmerksamkeit erlangt 1 , 2 . Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit und spezifischen Wirkungsweisen zeigen sie ein großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung von Krebs, Immunerkrankungen, HIV und verwandten Bedingungen 3 , 4 . Jedoch machen physiochemische Eigenschaften, wie ihre große molekulare Größe, dreidimensionale Struktur, Oberflächenladungen und hydrophile Natur, die in vivo- Abgabe dieser Makromoleküle sehr anspruchsvoll. Dies beeinträchtigt ihre klinische Anwendung erheblich 4 . Jüngste Fortschritte in Arzneimittelabgabesystemen wie Mikropartikeln, Polymer-Nanopartikeln, Nerven, Liposomen und Lipid-NPs, überwand diese Herausforderungen und verbesserte die in vivo- Zufuhr von Makromolekülen erheblich. HoWeil, einige Nachteile in Bezug auf diese Liefergüter wurden aufgedeckt, einschließlich niedrige Drogenbelastung Kapazität, niedrige Einschluss Effizienz, kurze Halbwertszeit, Verlust der Bioaktivität und unerwünschte Nebenwirkungen 5 , 6 , 7 , 8 . Effektive Trägersysteme bleiben ein Forschungsgebiet. Darüber hinaus ist die Entwicklung von analytischen Methoden zur Charakterisierung von Arzneimittel-geladenen NPs für Makromoleküle schwieriger als für kleine Moleküle.
High-Density-Lipoprotein (HDL) ist ein natürlicher NP, der aus einem Lipidkern besteht, der mit Apolipoproteinen und einer Phospholipidmonoschicht beschichtet ist. Endogene HDL spielt eine wichtige Rolle beim Transport von Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren durch ihre Wechselwirkung mit Zielrezeptoren wie SR-BI, ABCAI und ABCG1. Es wurde als Vehikel für die Lieferung von verschiedenen therapeutischen Mitteln untersucht 9, 10 , 11 , 12 . Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um HDL-mimicking NPs vorzubereiten. Dialyse ist ein beliebter Ansatz. Bei diesem Verfahren werden NPs durch Hydratisierung eines Lipidfilms unter Verwendung von Natriumcholatlösung gebildet. Das Salz wird dann durch eine 2-tägige Dialyse mit drei Puffern 13 entfernt . Sonessionsverfahren herstellen NPs durch Beschallung einer Lipidmischung für 60 min unter einer Heizbedingung; Die NPs werden durch Gelchromatographie weiter gereinigt. Mikrofluidik erzeugt NPs über eine mikrofluidische Vorrichtung, die Phospholipide und Apolipoprotein AI (Apo AI) Lösungen durch die Herstellung von Mikrovortices in einem Fokussierungsmuster 15 vermischt. Klar, diese Methoden können zeitraubend, hart und schwierig für industrielle Scale-up.
In diesem Artikel stellen wir die Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-mimicking NPs für Nerven vorWachstumsfaktor (NGF) Verkapselung. NGF ist ein Disulfid-verknüpftes Polypeptid-Homodimer, das zwei 13,6-kDa-Polypeptidmonomere enthält. Ein neuartiges Verfahren zur Herstellung der NPs durch Homogenisierung, gefolgt von der Verkapselung von NGF in die NPs, wurde entwickelt. Die NGF-HDL-imitierenden NPs wurden für Partikelgröße, Größenverteilung, Zetapotential und in vitro Freisetzung charakterisiert. Ihre Bioaktivität wurde für das Neuritenwachstum in PC12-Zellen untersucht. Die Biodistribution von NGF-HDL-imitierenden NPs wurde mit der von freiem NGF nach intravenöser Injektion bei Mäusen verglichen.
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Protocol
ANMERKUNG: Die Tierstudien, die in allen Verfahren enthalten sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of North Texas Health Science Center genehmigt.
1. Vorbereitung von NGF-HDL-nachahmenden Nanopartikeln
- Lösen Sie die Exzipienten, Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Cholesteryloleat (CO) und D-α-Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat (TPGS) in Ethanol, um Stammlösungen bei 1 mg / ml zuzubereiten.
HINWEIS: Die Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Das Cholesteryloleat wurde in dunklen Flaschen gelagert. Die PC-, SM-, PS- und CO-Stammlösungen waren für bis zu 6, 3, 12 und 12 Monate bei -20 ° C stabil. Die TPGS-Lösung war für mindestens 12 Monate bei -20 ° C stabil. - Mischen Sie 10 μl NGF (1 mg / ml in Wasser) mit 10 μl Protamin USP (1 mg / ml in Wasser) in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 min bei Raumtemperatur stehenBilden den Komplex.
HINWEIS: Die NGF- und Protamin-Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 ° C gelagert. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird für die NGF-Bestände nicht empfohlen. - Es werden 59 μl PC, 11 μl SM, 4 μl PS, 15 μl CO und 45 μl TPGS in eine Glasampulle gegeben. Das Ethanol wird unter einem sanften Stickstoffstrom für etwa 5 min vermischt und verdampft; Alle Hilfsstoffe sollten einen öligen, dünnen Film an der Unterseite der Glasampulle bilden.
- Füge 1 ml ultrareines (Typ 1) Wasser in die Durchstechflasche und homogenisiere bei 9.500 U / min (8.600 xg) für 5 min bei Raumtemperatur, um die Prototyp-NPs zu bilden.
- Fügen Sie den in Schritt 1.2 hergestellten Komplex zu den Prototyp-NPs hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 30 min unter Rühren unter Verwendung eines kleinen Rührstabes in der Glasampulle.
- Die NPs unter Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 min abkühlen lassen. Danach werden 106 μl Apo AI (1,49 mg / ml) zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um das Finale zu bildenNGF HDL-Nachahmung von NPs.
2. Charakterisierung von NGF-HDL-Mimik-Nanopartikeln
- Messen Sie die Partikelgröße und das Zetapotential mit einem Partikelanalysator (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie eine vernetzte Agarose-Gelfiltrationschromatographie-Säule, um das unbelastete NGF von den NGF-HDL-imitierenden NPs zu trennen und die Einfangwirkung des NGF zu bestimmen.
- Für die Säulenpräparation 15 ml Sepharose 4B-CL Suspension in ein 50-ml-Becherglas überführen. Die Wulstaufhängung mit einem Glasstab umrühren und etwas in eine Säule geben (30 cm Länge × 1 cm Durchmesser, mit einer Glasfritte an der Unterseite). Vorsicht tippen Sie auf die Säule, um Blasen loszuwerden. Lassen Sie das Lösungsmittel abtropfen lassen und die Perlen für ein paar Minuten absetzen.
- Weiter führe die restliche Aufhängung hinzu. Spülen Sie die Innenwand der Säule, um die Perlen zu reinigen. Das Lösungsmittel abtropfen lassen, bis der Lösemittelgehalt geringfügig istBove die Oberseite der stationären Phase. Waschen und Konditionieren der Säule mit 20 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, enthaltend 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 und 2 mM KH 2 PO 4 ).
- Um die Fraktionen mit unbelastetem NGF zu bestimmen, werden 200 μl NGF-Lösung (10 μg / mL) auf die Gelfiltrationssäule (25 cm Länge x 1 cm Durchmesser) gegeben und mit 1x PBS eluiert.
- Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Konzentration von NGF in jeder Fraktion mit einem Sandwich ELISA Kit für NGF.
- Erfassen Sie NGF aus den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit. Erhalten Sie ein Chromatogramm von unbelastetem NGF auf der Säule. Die Säule mit 20 ml PBS waschen.
- Um die Fraktionen zu bestimmen, die NGF-HDL-imitierende NPs enthalten, beladen Sie 200 & mgr; l der NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) und messen Sie die Intensität der Partikel in jeder Fraktion uSingen Sie den Partikelgrößenanalysator. Erkennung der NGF-NPs aus den Fraktionen 2 bis 4.
HINWEIS: Die Intensität ist ein Parameter, der von dem Partikelanalysator gemessen wird, der angibt, wie viele Nanopartikel in der Testlösung vorhanden sein können. Je mehr NPs in Lösung existieren, desto höher ist die Intensität. Durch diesen Ansatz können wir bestätigen, dass die Spalte NGF-NPs von unbelastetem NGF trennen kann. - Um die Einfangwirkung von NGF zu messen, laden Sie 200 μl NGF HDL-nachgeahmte NPs auf die Säule und eluieren mit 1x PBS. Sammle insgesamt 12 Fraktionen (1 ml für jede Fraktion).
- Messen Sie die unbelastete NGF-Konzentration von den Fraktionen 6 bis 10 mit dem Sandwich ELISA Kit.
- Fügen Sie die NGF-Mengen, die von den Fraktionen 6 bis 10 gemessen wurden, zusammen als das unbelastete NGF und berechnen Sie die Einfangwirkung von NGF unter Verwendung der folgenden Gleichung.
% EE = (1 - unbelastetes NGF / Gesamt-NGF in NP) x 100% Gleichung (1)
3. In vitro Freisetzung von NGF HDL-Mimiking Nanopartikel
- NGF (10 μg / ml in n = 4) und NGF HDL-nachahmenden NPs (10 μg / mL; n = 4) parallel untersuchen.
- Vorbehandeln von 8 Dialyse-Röhrchen (Molekulargewichts-Cutoff: 300 kDa) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Sie 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS als Freisetzungsmedium vor. Füge 30 ml Freisetzungsmedium zu einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu und erwärme es bis zu 37 ° C in einem Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 135 U / min. Legen Sie weitere 50 ml Freisetzungsmedium in den Schüttler für den Austausch.
- Fügen Sie 400 μl Freisetzungsmedium in das Dialyseschlauch hinzu und fügen Sie schnell 200 μl der getesteten Probe hinzu, um genügend Volumen für die Dialyse zu machen.
- Schließen Sie den Schlauch und setzen Sie den Dialyseschlauch schnell in das Trennmedium (das Zentrifugenröhrchen). Ziehen Sie schnell 100 μl des Trennmediums aus dem äußeren Dialyseschlauch als Probe für die Zeit 0 ab. Setzen Sie die Probe sofort in -20 ° C für eine spätere Analyse ein. 100 μl frische ReLeasing-Medium in das Zentrifugenröhrchen, um die entnommene Probe zu ersetzen. Starten Sie den Timer.
- Bei 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 und 72 h werden 100 μl des Trennmediums abgezogen und mit 100 μl frischem Medium ersetzt. Setzen Sie die entnommenen Proben sofort in -20 ° C für die spätere Analyse ein.
- Nach 72 h alle Proben von -20 ° C herausnehmen und bei Raumtemperatur auftauen. Messen Sie die NGF-Konzentrationen der Freisetzungsproben mit dem Sandwich ELISA Kit.
4. Bioaktivität von NGF-HDL-nachgeahmten Nanopartikeln (Neurite Outgrowth Study)
- Kultur-PC12-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 5% fötalem Rinderserum, 100 μg / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5% CO 2 .
- Wenn die Zellen ~ 60-80% Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen die Zellen mit 1x PBS (ca. 2 ml pro 10 cm <)Sup> 2 Kulturfläche). Entfernen Sie die Waschlösung. Trypsinisieren der Zellen durch Zugabe von 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin und 1 mM EDTA, 0,5 ml pro 10 cm 2 Kulturoberfläche) in den Kolben und inkubieren bei 37 ° C, bis die meisten Zellen abgelöst sind.
- Füge zwei Volumina Kulturmedium hinzu und spinze bei 180 xg für 5 min ab. Den Überstand entfernen und das Zellpellet in 5 ml Kulturmedium resuspendieren. Filtern Sie die Zellen durch eine 22 G, ½ Zoll Nadel, um Zellcluster zu brechen.
- Die Zellen im Verhältnis 1: 3 in einen neuen Zellkulturkolben aufteilen. Nach der Inkubation über Nacht, entfernen Sie ungebundene PC12-Zellen. Lassen Sie die angehängten Zellen für weiteres Wachstum bleiben.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für 3 Passagen, um die Subkultur von PC12 auszuwählen, die eine starke Adhäsionseigenschaft aufweist. Vorbereiten einer 6-Well-Platte mit 800 & mgr; l / Vertiefung des Rattenschwanzkollagen Typ I (100 & mgr; g / ml).
- Trypsinisieren Sie die ausgewählten PC12-Zellen wie in Schritt 4.2 beschrieben und filtrieren sie durch eine22 G, ½ Zoll Nadel, um die Zellcluster zu brechen. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer. Die Zellen über Nacht mit einer Dichte von 10.000 Zellen / Vertiefung in der vorbeschichteten 6-Well-Platte in Schritt 4,5 abgesaugt, um die Zellen an der Platte zu befestigen.
- Verdünnen Sie freie NGF (10 μg / ml) und NGF HDL-imitierende NPs (10 μg / ml) mit dem Kulturmedium (beschrieben in Schritt 4.1), um 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 ng / ml-Konzentrationen herzustellen. 2 ml Medium aus jeder Vertiefung entfernen und mit 2 ml der verdünnten freien NGF- oder NGF-HDL-Mimik-NPs ersetzen. Kultur für 4 Tage.
- Am Tag 4 wechseln Sie das Medium auf frisches Medium (beschrieben in Schritt 4.1), das die entsprechende Behandlung enthält und die Behandlung für weitere 3 Tage fortsetzt.
- Am Tag 7, visualisieren Sie die Zellen mit einem invertierten Lichtmikroskop und Bild jedes gut an zufälligen Flecken unter 10facher Vergrößerung.
5. Biodistribution von NGF HDL-nachahmenden Nanopartikeln
- Verwenden Sie erwachsene BALB / c-Mäuse (männlich, 25-30 g) bis tEst die Gewebeverteilung von NGF-NPs. Gelegentlich teilen die Mäuse in drei Gruppen von 3 Mäusen pro Gruppe. Verwenden Sie eine kegelförmige Kunststoff-Rückhaltevorrichtung ( zB Decapicone), um eine Maus zurückzuhalten und den Schwanz mit Ethanol zu wischen, um die Vasodilatation und die Sichtbarkeit der Vene zu fördern.
- In einer Dosis von 40 & mgr; g / kg NGF werden 100 & mgr; l entweder Kochsalzlösung, freie NGF oder NGF HDL-nachgeahmte NPs zu jeder Gruppe von Mäusen (3 Gruppen) durch die Schwanzvenen injiziert. Verwenden Sie eine 30 ½ G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist.
- Nach 30 Minuten nach der Injektion die Mäuse mit 3% inhaliertem Isofluran (in Sauerstoff bei einer Durchflussmenge von 2 l / min) anästhesieren. Führen Sie eine Schwanz-und Zehen-Prise, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen. Blut durch Herzpunktion sammeln.
- Ziehe ungefähr 1 ml Blut aus dem Herzen. Euthanisieren jede Maus durch zervikale Versetzung.
- Legen Sie die Maus Karkasse in dorsal Recumbency. Öffnen Sie den Bauch mit chirurgischen Scheren und bewegen Sie Fett und Darm beiseiteMit einem Wattestäbchen, um Leber, Milz und Niere auszusetzen. Ernten Sie diese Gewebe und spülen Sie sie in 1x PBS, um das Blut zu reinigen.
- Die Blutproben sofort bei 3.400 xg und 4 ° C für 5 min zentrifugieren, um das Plasma zu erhalten. Das Plasma und das Gewebe bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren.
- Um die Gewebeproben zu analysieren, bewegen Sie die Proben von -80 ° C auf 4 ° C und suspendieren 100 mg Gewebeprobe in einem 10-fachen Volumen des Extraktionspuffers (0,05 M Natriumacetat, 1,0 M Natriumchlorid, 1% Triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM Phenylmethansulfonylfluorid und 0,2 mM Benzethoniumchlorid). Bei 10.000 U / min und 4 ° C für 5 min homogenisieren.
- Opfer zwei unbehandelte Mäuse, um leeres Plasma und Gewebe zu sammeln, wie in den Schritten 5.3 und 5.4 beschrieben. NGF-Standardlösungen mit leeren Plasma- oder Blindgewebe-Homogenaten vorbereiten.
- Bestimmen Sie die Konzentrationen von NGF in den Plasma- und Gewebehomogenaten mit dem Sandwich-ELISA-Kit, wie oben beschrieben.
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Representative Results
Das Engineering-Schema von HDL-imitierenden, α-Tocopherol-beschichteten NGF-NPs, die durch eine Ionenpaar-Strategie hergestellt wurden, ist in 1 gezeigt . Um die Oberflächenladungen von NGF zu neutralisieren, wurde Protamin USP als Ionenpaarmittel verwendet, um einen Komplex mit NGF zu bilden. Um die Bioaktivität zu schützen, wurden Prototyp-HDL-imitierende NPs entwickelt, zuerst mit Homogenisierung; Dann wurde der NGF / Protamin-Komplex in die Prototyp-NPs eingekapselt. Die Homogenisierung lieferte genügend Energie und förderte erfolgreich das Mischen der Hilfsstoffe. Nach einer 3-minütigen Homogenisierung wurden für die Prototyp-NPs konsistente Partikelgrößen (ca. 170 nm) erhalten (Abbildung 2 ). Apo AI wurde mit den Prototyp-NPs unter verschiedenen Bedingungen inkubiert, einschließlich 2 h Rühren bei Raumtemperatur; 4 h Rühren bei Raumtemperatur; 4 h Rühren bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 ° C; Und bei Raumtemperatur rührenRnight Über 26% Apo AI wurden in die NPs eingearbeitet, wenn sie bei Raumtemperatur über Nacht gerührt wurden. Um den NGF-Protamin-Komplex zuzugeben, wurde der Komplex mit den Prototyp-NPs für 30 min bei 37 ° C inkubiert und dann wurde Apo AI zu der Mischung gegeben, um die endgültige Beschichtung von Apo AI auf der Oberfläche der NPs zu beenden. Unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens hatten die endgültigen NGF-HDL-imitierenden NPs Partikelgrößen von 171,4 ± 6,6 nm (n = 3) mit 65,9% der NGF-Einfangwirkung ( Tabelle 1 ). NGF HDL-imitierende NPs hatten eine leichte negative Ladung ( Tabelle 1 ). Die NPs hatten eine enge Größenverteilung und die Einbeziehung von NGF in die NPs beeinflusste die Partikelgröße nicht (Abbildung 3 ).
Um die Einfangwirkung von NGF zu messen, wurden verschiedene Verfahren untersucht, um unbelastete NGF von NGF HLD-imitierenden NPs zu trennen. Unerwartet kann NGF keinen Trennfilter (Molekulargewichts-Cutoff: 100 kDa) passieren. Gel fiTrennsäulen, einschließlich Sephadex G-50, Sephadex G-100 und Sephacryl S-100, können nicht geladene NGF- und NGF-HDL-imitierende NPs trennen, da beide in den gleichen Fraktionen nach der Elution kommen. Eine Sepharose-CL-4B-Säule führte die Trennung mit der optimierten Probenbeladung, dem Elutionspuffer und der Elutionsrate durch. Wie in Fig. 4 gezeigt , wurden unbelastete NGF- und NGF-HDL-imitierende NPs vollständig auf einer Sepharose-CL-4B-Säule getrennt.
Eine Dialyse-Methode wurde verwendet, um die in vitro -Freisetzung von NGF-HDL-imitierenden NPs in PBS mit 5% BSA zu untersuchen, was eingeschlossen war, um die physiologischen Zustände im Blut nachzuahmen. Durch die Erhöhung der Größe der Dialysevorrichtung (Molekulargewichts-Cutoff: 300 kDa) und durch Zugabe von PBS und BSA zum Freisetzungsmedium bindet NGF nicht an die Dialysemembran und wurde frei durchlaufen. Infolgedessen lag die Rückgewinnung von freiem NGF bei dieser Dialyse-Methode bei über 85% ( Abbildung 5 ). NGFHDL-imitierende NPs zeigten ein langsames Freisetzungsprofil, und etwa 10% des NGF wurden von den NPs über 72 h freigesetzt (Abbildung 5 ).
Um die Bioaktivität von NGF-HDL-imitierenden NPs zu testen, wurde die Subkultur von PC12-Zellen, die eine starke Adhäsionseigenschaft aufwies, ausgewählt, um einen Neuriten-Auswuchs-Assay durchzuführen. Fig. 6 stellt die Abbildung des Neurit-Auswuchs dar, wenn die Zellen mit 50 ng / ml freiem NGF ( Fig. 6A ) und NGF-HDL-imitierenden NPs behandelt wurden ( Fig. 6B ). Wenn die Behandlungskonzentration höher als 10 ng / ml war, wurde das Neuritenwachstum durch das Mikroskop deutlich beobachtet. Bei diesen hohen Konzentrationen zeigten freie NGF- und NGF-HDL-imitierende NPs keinen signifikanten Unterschied zur Wirkung des Neuritenwachstums. Wenn die Konzentration von NGF niedriger als 10 ng / ml war, konnte das Neuritenwachstum nicht deutlich beobachtet werden, sowohl für freies NGF als auch für NGF HDL-imitierende NPs. Biodistribution stUdies wurden durchgeführt, um das in vivo Verhalten von freien NGF und NGF HDL-imitieren NPs zu vergleichen. Wie in Abbildung 7 gezeigt , erhöhten NGF-HDL-imitierende NPs die Plasmakonzentration signifikant und verringerten die Aufnahme in Leber, Niere und Milz.
Abbildung 1: Das Engineering-Schema von NGF-HDL-imitierenden Nanopartikeln, die durch eine Ionenpaar-Strategie hergestellt wurden. NGF ist ein negativ geladenes hydrophiles Molekül. Ein kationisches Peptid, Protamin, wurde verwendet, um die Ladungen zu neutralisieren und bildete einen Ionenpaarkomplex mit NGF. Cholesteryloleat, Phospholipide und TPGS bildete Selbstorganisation Prototyp NPs durch Homogenisierung. Der NGF / Protamin-Komplex wurde in die Prototyp-NPs eingebaut. Schließlich wurde Apo AI nach der Inkubation über Nacht auf die NP-Oberfläche aufgetragen. Diese Figur wurde von Prathipati et al. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Der Einfluss der Homogenisierung auf die Partikelgröße der Prototyp-Nanopartikel. Die in Ethanol aufgelösten Exzipienten, PC, SM, PS, CO und TPGS wurden in Glasfläschchen gegeben und das Lösungsmittel unter N 2 -Strom verdampft. 1 ml Wasser wurde zugegeben und bei 9.500 U / min für verschiedene Zeiten homogenisiert. Die Teilchengrößen der nachfolgenden Nanopartikel wurden gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4) dargestellt. Diese Figur wurde von Prathipati et al. 16 Bitte cliCk hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Partikelgröße und Größenverteilung von leeren HDL-nachahmenden Nanopartikeln und NGF-HDL-imitierenden Nanopartikeln. Die Partikelgrößen und -verteilungen wurden mit einem Partikelanalysator gemessen. Diese Figur wurde von Prathipati et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Chromatogramme freier NGF- und NGF-HDL-nachgeahmter Nanopartikel auf einer Sepharose-CL-4B-Säule, die von PBS eluiert wurde. 200 & mgr; l freie NGF-Lösung (10 & mgr; g / ml) und NGF-NP-Lösung wurden auf t aufgetragenEr Gelfiltrationssäule und eluiert mit 1x PBS. Für beide Proben wurden insgesamt zwölf Fraktionen (1 ml für jede Fraktion) gesammelt. Die NP-Intensität in jeder Fraktion wurde durch einen Partikelanalysator gemessen, und die Konzentration von NGF in jeder Fraktion wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Kits gemessen. Diese Figur wurde von Prathipati et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: In-vitro -Freisetzung von NGF-HDL-nachgeahmten Nanopartikeln, gemessen nach einer Dialyse-Methode. PBS mit 5% BSA wurde als Freisetzungsmedium verwendet. 200 & mgr; l freie NGF-Lösung (10 & mgr; g / ml) oder NGF-NPs wurden zu einem Dialyseschlauch gegeben, das mit 400 & mgr;L des Freisetzungsmediums. Das Dialyseschlauch wurde in 30 ml vorgewärmtes Freisetzungsmedium gegeben. Die Studie wurde bei 37 ° C mit 135 U / min Schütteln durchgeführt. Bei 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 und 72 h wurden 100 & mgr; l des Trennmediums entnommen und mit 100 & mgr; l frischem Medium ersetzt. Die NGF-Konzentration in jeder Probe wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Kits gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4) dargestellt. Diese Figur wurde von Prathipati et al. 16 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Der Einfluss von NGF HDL-Nachahmung von Nanopartikeln auf Neuritenwachstum in PC12-Zellen. Die Zellen wurden mit 50 ng / ml freiem NGF ( A ) und behandelt D NGF HDL-Nachahmung von Nanopartikeln ( B ) für 7 Tage. Der Neurit wurde mit einem invertierten Lichtmikroskop unter 10facher Vergrößerung abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Der Vergleich der Biodistribution zwischen freien NGF- und NGF-HDL-imitierenden Nanopartikeln bei Mäusen (n = 3). Die Mäuse wurden mit 40 mg / kg NGF durch Schwanzveneninjektion verabreicht und nach der Verabreichung bei 30 min geopfert. Das Blut, die Leber, die Milz und die Niere wurden gesammelt, und die Konzentration von NGF in jeder Probe wurde unter Verwendung eines Sandwich-ELISA-Kits gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Diese Figur wurde von Prathipati et al. 16"Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Sample | Partikelgröße (nm) | PI | EE% der NGF | Zetapotential (mV) |
| NGF HDL-Nachahmung von NPs | 171,4 ± 6,6 | 0,239 ± 0,01 | 65,9 ± 1,4 | -12,5 ± 1,9 |
Tabelle 1: Charakterisierung von NGF-HDL-Mimik-Nanopartikeln (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Diese Tabelle wurde von Prathipati et al. 16
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Discussion
In dieser Studie zeigen wir eine einfache Methode zur Vorbereitung von HDL-Mimik-NPs für die NGF-Kapselung. Verschiedene NP-Abgabesysteme wurden untersucht, um Proteine zu liefern. Derzeit umfassen viele NP-Präparate Dialyse, Lösungsmittelabscheidung und Filmhydratation. Diese Prozesse sind im Allgemeinen kompliziert und anspruchsvoll beim Scale-up. Während dieser NP-Entwicklung wurde festgestellt, dass die Lipide eine starke Haftung an der Glaswand des Behälters hatten, was zu den Schwierigkeiten bei der Hydratisierung des Dünnfilms und effizienter Vermischung der Hilfsstoffe führte. Angesichts der vielfältigen Komponenten in natürlichen HDL-NPs wurde das Mischen sehr anspruchsvoll und entscheidend für die Vorbereitung von HDL-Mimik-NPs. Entsprechend den Ergebnissen hat die Erhöhung der Temperatur und der Mischzeit keine NP-Bildung unterstützt. Der Homogenisator ist ein gemeinsames Instrument der industriellen Fertigung und bietet hohe Energie- und Scherkraft zum Mischen. Durch Anwendung dieses Instruments auf NP Vorbereitung, monodisperse NPs mit dem aInnerhalb von 3 min ( Fig. 2 und Fig. 3 ) wurden entsprechende Größen erzeugt, was die Herstellungszeit stark verringerte und das Herstellungsverfahren vereinfachte.
Die große Herausforderung, Makromoleküle auf therapeutische Verabreichung anzuwenden, ist nicht nur die Lieferung, sondern auch die Formulierung. Proteine sind normalerweise wasserlöslich und haben große Größen und Ladungen auf ihren Oberflächen, die die Verkapselung von Proteinen in Lipid-basierte NPs verhindern. Protamin USP, ein Polykation, wurde verwendet, um einen Ionenpaar-Komplex mit NGF zu bilden. Nach dem Mischen von NGF und Protamin wurde der weiße Niederschlag, der die Bildung des unlöslichen Komplexes zeigte, deutlich beobachtet. Mit Hilfe des Komplexes wurden etwa 70% des NGF innerhalb der NPs mit einer engen Größenverteilung eingeschlossen ( Tabelle 1 und Abbildung 3 ). Darüber hinaus musste die Stabilität der Proteine bei der Formulierungsentwicklung berücksichtigt werden. Um den Einfluss der Homogenisierung zu vermeidenBei der NGF-Stabilität wurde das Verfahren eingestellt, um nach der Homogenisierung einen NGF-Komplex zuzusetzen. Unter einer sehr milden Inkubationsbedingung (30 min bei 37 ° C) wurde der NGF-Komplex in die NPs eingearbeitet. Verschiedene Verfahren wurden getestet, um Apo AI hinzuzufügen; Allerdings war die Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur noch notwendig, um genügend Apo AI auf die Oberfläche der NPs zu laden. Basierend auf den Ergebnissen des Neuriten-Auswuchs-Assays wurde die Bioaktivität von NGF nach der NP-Präparation erfolgreich mit dem hier vorgestellten Verfahren beibehalten (Abbildung 6 ). Darüber hinaus erhöhte die Einkapselung von NGF in die HDL-imitierenden NPs die Blutzirkulation von NGF, wie durch die Biodistributionsstudien (Abbildung 7 ) angedeutet. Diese Ergebnisse zeigen, dass NGF erfolgreich mit einem NP-Delivery-System formuliert wurde. Die HDL-mimicking NPs können NGF unterstützen, was eine lange Halbwertszeit und In-vivo- Stabilität ermöglicht.
Die Entwicklung geeigneter analytischer Methoden ist auch chaLumpen für Protein-basierte Nanomedizin. Um die Einfangwirkung und die In-vitro- Freisetzung zu messen, ist es zwingend erforderlich, das entladene Arzneimittel aus Arzneimittel-geladenen Nanopartikeln zu trennen. Membranen mit bestimmten Molekulargewichts-Cutoffs werden üblicherweise für diesen Zweck verwendet und arbeiten gut für kleine Moleküle. Allerdings ist es nicht einfach, unbelastete Proteine und Protein-geladene Nanopartikel zu trennen, vor allem wegen der ähnlichen Größen und Bindungseigenschaften von Proteinen. Freie NGF- und NGF-HDL-beladene NPs können nicht mit dem Membran-basierten Filtrationsgerät getrennt werden, obwohl das Molekulargewichts-Cutoff der Membran 100 kDa beträgt (die größte Porengröße für kommerzielle Filtrationsvorrichtungen). Nachdem mehrere Gelfiltrationssäulen getestet worden waren, wurden freie NGF- und NGF-HDL-imitierende NPs schließlich unter Verwendung einer Sepharose-CL-4B-Säule abgetrennt. Allerdings musste die Probenbeladung auf die Säule bei 200 μl gehalten werden, um reproduzierbare Chromatogramme zu erhalten. Elutionsmittel waren auch von Bedeutung. Wenn Wasser verwendet wurdeUm NGF zu eluieren, wurde ein sehr breites Chromatogramm erhalten; NGF wurde aus den Fraktionen 5 bis 20 nachgewiesen. Das breite Chromatogramm konnte durch die starke Wechselwirkung zwischen NGF und den Perlen verursacht worden sein. Nachdem mehrere Elutionsmittel wie 5 mM NaCl und 50 mM NaCl getestet worden waren, wurde PBS als ausreichendes Elutionsmittel bestätigt. Darüber hinaus blieb die Trennungsherausforderung für die In-vitro- Studien. Die Säulentrennung eignet sich nicht für In-vitro- Versuchsstudien aufgrund der Anzahl der zu messenden Proben und des Potentials für die weitere Freisetzung von NGF aus den NPs, wenn sie die Säule passieren. Nachdem verschiedene Bedingungen getestet wurden, wurde das im Protokoll beschriebene Dialyseverfahren bestimmt. Entsprechend den Ergebnissen (Abbildung 5 ) kann freies NGF die Durchgangsmembran (Molekülgewichtsgrenze: 300 kDa) in PBS, die 5% BSA enthält, frei passieren. Mit dieser positiven Kontrolle wurde das Release-Ergebnis von NGF HDL-Mimiking NPs zuverlässig. Die erhöhte Porengröße und DehnungDie durch PBS und BSA verursacht wurden, trug zur freien Penetration von NGF durch die Dialysemembran bei.
Zusätzlich zu den vorgenannten Problemen entstand eine weitere Herausforderung mit dem Neuriten-Auswuchs-Test. Es gibt einen kommerziellen Neuriten-Auswuchs-Test-Kit, der auf einem Subklon von PC12-Zellen basiert. Der Subklon von PC12-Zellen ist jedoch nicht mehr im Handel erhältlich. Normale PC12-Zellen sind schwimmende Zellen, die keine Neuriten sehr gut wachsen und die während der experimentellen Eingriffe leicht zu verlieren sind. Nach mehreren Ausfällen wurde eine kleine Population von PC12-Zellen, die eine starke Adhäsionseigenschaft hatten, entdeckt. Somit wurde diese Population von Zellen durch mehrere Passagen, wie in dem Protokoll beschrieben, ausgewählt. Folglich wurde der Assay erfolgreich durchgeführt und zeigt die vergleichbare Bioaktivität von NGF-HDL-imitierenden NPs mit freiem NGF (Abbildung 6 ).
Die hier gemeldete Methode ist ein einfaches Verfahren für thVorbereitung von HDL-Nachahmungen von NPs. Wir haben über 26% Apo AI auf die NPs eingeschlossen, was über 3-fach höher war als in der Literatur 16 beschrieben. Über 65% der NGF wurden in die NPs eingeschlossen, was 2-fach höher war als in der Literatur 16 . Mit diesen Erhöhungen der Einfang-Effizienz sowohl für Apo AI als auch für NGF ist es nicht notwendig, die NPs zu reinigen. Folglich wurde die NP-Präparation vereinfacht. Das unbelastete Apo AI und NGF in der NP-Präparation beeinflussten die NGF- In-vitro- Freisetzung (Abbildung 6 ) und die in vivo- Biodistribution nicht (Abbildung 7 ), aber es könnte die Stabilitäts- und In-vitro -Zellstudien beeinflussen. Die Untersuchungen zeigen, dass es möglich ist, die Einfangwirkung von Apo AI und NGF durch Modifizierung von NP-Zusammensetzung und Präparationsverfahren weiter zu verbessern. Darüber hinaus könnten die neuartigen HDL-imitierenden NPs und die Strategien in diesen Studien verwendet werden, um andere gr zu ladenOwth-Faktoren, obwohl das Ionenpaar-Mittel (Protamin) geändert werden könnte, um den spezifischen Wachstumsfaktor anzupassen. Die Langzeitlagerung von Proteinformulierungen ist eine Herausforderung. Der bevorzugte Weg, um Protein-beladene NPs zu halten, ist, sie zu trocknen, um Pulver zu trocknen. Jedoch könnte die Lyophilisierung die Teilchengrße erhöhen und die Einfangwirkung des Proteins nach der Rekonstitution von lyophilisierten NPs verringern. Nur wenige Publikationen haben die Lyophilisierung von HDL-imitierenden NPs diskutiert. Wir studieren die Lyophilisierung von neuartigen HDL-imitierenden NPs. Schließlich könnten HDL-imitierende NPs klinisch anwendbar sein, wenn sie für eine lange Zeitspanne (mindestens 6 Monate) angemessen gelagert werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH R03 NS087322-01 an Dong, X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
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