Summary
L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.
Abstract
L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre metodi di preparazione e caratterizzazione per le nanoparticelle (NP) di carico di NFF-caricato, ad alta densità, lipoproteine (HDL). Le HDL sono NPs endogene e sono state esplorate come veicoli per la consegna di agenti terapeutici. Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. Tuttavia, sono generalmente complicate, richiedono molto tempo e sono difficili per la scala industriale. In questo studio, l'omogeneizzazione in un passo è stata usata per mescolare gli eccipienti e formare i prototipi NP. NGF è una proteina solubile in acqua di 26 kDa. Per facilitare l'incapsulamento di NGF nell'ambiente lipidico dei NP NPN che imitano HDL, la protamina USP è stata usata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF per neutralizzare le cariche sulla superficie NGF. Il complesso NGF / protamina è stato quindi introdotto nei prototipi NP. Apolipoproteina AI è stata finalmente ricoperta sulla superficie dei NP. NGF HDL-imitando NP hanno mostrato preferibili proprietà in terminiS di dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, efficienza di entrapment, rilascio in vitro , bioattività e biodistribuzione. Con l'accurata progettazione e l'esplorazione dell'omogeneizzazione in NPs che imitano HDL, la procedura è stata notevolmente semplificata e gli NP sono stati resi scalabili. Inoltre, sono state superate diverse sfide, come la separazione di NGF scaricati dai NP, che conduce affidabili studi di rilascio in vitro e misurando la bioattività dei NP.
Introduction
Macromolecole, come proteine, peptidi e acidi nucleici, stanno emergendo come farmaci promettenti e hanno guadagnato una notevole attenzione negli ultimi decenni 1 , 2 . A causa della loro elevata efficacia e modalità di azione specifica, essi presentano un grande potenziale terapeutico per i trattamenti del cancro, della malattia immunitaria, dell'HIV e delle condizioni correlate 3 , 4 . Tuttavia, le proprietà fisiochimiche, come la loro grande dimensione molecolare, la struttura tridimensionale, le cariche superficiali e la natura idrofila, rendono la consegna in vivo di queste macromolecole molto impegnative. Ciò ostacola notevolmente il loro uso clinico 4 . Recenti progressi nei sistemi di erogazione di farmaci, come microparticelle, nanoparticelle polimeriche (NP), liposomi e NPs lipidi, hanno superato queste sfide e migliorato significativamente la distribuzione in vivo di macromolecole. HoTuttavia, sono stati rivelati alcuni inconvenienti riguardanti questi carichi di consegna, tra cui la scarsa capacità di caricamento del farmaco, l'efficienza di scarsa entrapment, l'emivita breve, la perdita di bioattività e gli effetti collaterali indesiderati 5 , 6 , 7 , 8 . Sistemi di trasporto efficaci rimangono un'area di interesse di ricerca. Inoltre, lo sviluppo di metodi analitici per caratterizzare NPs caricati da droga è più impegnativo per le macromolecole che per le piccole molecole.
La lipoproteina ad alta densità (HDL) è un NP naturale composto da un nucleo lipidico rivestito da apolipoproteine e da un monosilofo fosfolipido. L'HDL endogeno svolge un ruolo fondamentale nel trasporto di lipidi, proteine e acidi nucleici attraverso la sua interazione con i recettori target, come SR-BI, ABCAI e ABCG1. È stato esplorato come veicolo per la consegna di diversi agenti terapeutici 9, 10 , 11 , 12 . Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. La dialisi è un approccio popolare. In questo metodo, i NP sono formati dall'idratazione di un film lipidico utilizzando la soluzione di colato di sodio. Il sale viene quindi rimosso attraverso una dialisi di 2 giorni con tre tamponi 13 . I metodi di sonicazione fabbricano NP facendo subire una miscela lipidica per 60 min sotto una condizione di riscaldamento; I NP sono ulteriormente purificati mediante gel cromatografia 14 . La microfluidica genera NP attraverso un dispositivo microfluidico che mescola le soluzioni di fosfolipidi e apolipoproteine AI (Apo AI) creando microvortici in un modello di messa a fuoco 15 . Chiaramente, questi metodi possono richiedere molto tempo, duri e difficili per la scala industriale.
In questo articolo introdurremo la preparazione e la caratterizzazione di nuovi NPs imitanti HDL per il nervoL'incapsulamento del fattore di crescita (NGF). NGF è un omodimero di polipeptidi legato al disolfuro contenente due monomeri di polipeptidi di 13,6 kDa. È stata sviluppata una nuova procedura per la preparazione dei NP mediante omogeneizzazione, seguita dall'incapsulamento di NGF nei NP. I NP NPN di NGF sono stati caratterizzati per dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, potenziale zeta e rilascio in vitro . La loro bioattività è stata valutata per la crescita del neurite nelle cellule PC12. La biodistribuzione di NPs NGF HDL-imitanti è stata confrontata con quella di NGF libera dopo l'iniezione endovenosa nei topi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Gli studi sugli animali inclusi in tutte le procedure sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di North Texas Health Science Center.
1. Preparazione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti
- Sciogliere gli eccipienti, fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), colestero olio (CO) e D-a-tocoferil polietilenglicol-succinato (TPGS) in etanolo per preparare soluzioni a 1 mg / ml.
NOTA: Le soluzioni di stock sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. L'oleato di colesterilico è stato conservato in bottiglie scure. Le soluzioni PC, SM, PS e CO sono state stabili fino a 6, 3, 12 e 12 mesi rispettivamente a -20 ° C. La soluzione TPGS era stabile per almeno 12 mesi a -20 ° C. - Mescolare 10 μL di NGF (1 mg / ml in acqua) con 10 μL di protamina USP (1 mg / ml in acqua) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente aFormare il complesso.
NOTA: Le soluzioni NGF e protamina sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. Il congelamento e lo scongelamento ripetuti non sono raccomandati per lo stock NGF. - Aggiungere 59 μl di PC, 11 μL di SM, 4 μL di PS, 15 μL di CO e 45 μL di TPGS in una fiala di vetro. Mescolare ed evaporare l'etanolo sotto un flusso nitrico di azoto per circa 5 min; Tutti gli eccipienti devono formare una pellicola sottile e grassa in fondo alla fiala di vetro.
- Aggiungere 1 ml di acqua ultrapure (tipo 1) alla fiala e omogeneizzare a 9.500 giri / min (8.600 xg) per 5 minuti a temperatura ambiente per formare i prototipi NP.
- Aggiungere il complesso preparato al punto 1.2 al NP prototipo e incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione utilizzando una piccola barra di agitazione nel flaconcino di vetro.
- Raffreddare i NP in modo da agitare a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Dopo questo raffreddamento, aggiungere 106 μL di Apo AI (1,49 mg / ml) e mescolare a temperatura ambiente per una notte per formare la finaleNGF NPN che imitano HDL.
2. Caratterizzazione di nanoparticelle NGF HDL-imitanti
- Misurare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta utilizzando un analizzatore di particelle (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare una colonna cromatografica di filtrazione a gel agarosio reticolato per separare il NGF scaricato dai NP NPM NGF HDL e determinare l'efficienza di intrappolamento del NGF.
- Per la preparazione della colonna, trasferire 15 ml di sospensione di Sepharose 4B-CL in un bicchiere da 50 ml. Mescolare la sospensione del tallone utilizzando una barra di vetro e versare un po 'in una colonna (30 cm di lunghezza × 1 cm di diametro, con una fetta di vetro in basso). Toccare delicatamente la colonna per eliminare le bolle. Lasciare che il solvente venga scaricato e le perle si stabiliscano per qualche minuto.
- Continua ad aggiungere la sospensione rimanente. Sciacquare la parete interna della colonna per pulire le perle. Scaricare il solvente finché il livello del solvente è leggermente aBove la parte superiore della fase stazionaria. Lavare e condizionare la colonna con 20 ml di soluzione salina fosfato tamponata 1x (PBS, contenente 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 e 2 mM KH 2 PO 4 ).
- Per determinare le frazioni contenenti NGF scaricate, caricare 200 μL di soluzione NGF (10 μg / mL) sulla colonna di filtrazione gel (25 cm di lunghezza x 1 cm di diametro) e eluire con 1x PBS.
- Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ciascuna frazione) e misurare la concentrazione di NGF in ciascuna frazione utilizzando un kit Sandwich ELISA per NGF.
- Rileva NGF dalle frazioni da 6 a 10 utilizzando il kit Sandwich ELISA. Ottenere un cromatogramma di NGF scaricato sulla colonna. Lavare la colonna con 20 ml di PBS.
- Per determinare le frazioni contenenti NPs NGF HDL-imitanti, caricare 200 μL dei NP sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ogni frazione) e misurare l'intensità delle particelle in ogni frazione uCantare l'analizzatore di particelle. Rileva i NP NGF dalle frazioni da 2 a 4.
NOTA: L'intensità è un parametro misurato dall'analizzatore delle particelle, che indica quante nanoparticelle possono esistere nella soluzione di prova. Più NP esistono in soluzione, maggiore è l'intensità. Con questo approccio, possiamo confermare che la colonna può separare NGF NP da NGF non scaricato. - Per misurare l'efficienza di entrapamento di NGF, caricare 200 μl di NPG NGF HDL-imitanti sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere complessivamente 12 frazioni (1 mL per ogni frazione).
- Misurare la concentrazione NGF scaricata dalle frazioni da 6 a 10 usando il kit Sandwich ELISA.
- Aggiungere le quantità NGF misurate fra le frazioni da 6 a 10 come NGF scaricato e calcolare l'efficienza di entrapimento di NGF utilizzando la seguente equazione.
% EE = (1 - scaricato NGF / totale NGF aggiunto in NP) x 100% equazione (1)
3. In Vitro Release di NGF HDL-mimicking Nanoparticles
- Studiare in parallelo NGF (10 μg / mL in acqua, n = 4) e NGF HDL-imitanti NP (10 μg / mL; n = 4).
- Pre-trattare 8 tubi di dialisi (cutoff di peso molecolare: 300 kDa) seguendo le istruzioni del produttore.
- Preparare 5% di albumina bovina del siero (BSA) in PBS come mezzo di rilascio. Aggiungere 30 ml di mezzo di rilascio a un tubo da centrifuga da 50 ml e scaldare fino a 37 ° C in un agitatore con una velocità di scuotimento a 135 giri / min. Inserire altri 50 ml di mezzo di rilascio nell'evasatore per la sostituzione.
- Aggiungere 400 μL di mezzo di rilascio nel tubo di dialisi e aggiungere rapidamente 200 μL del campione esaminato per ottenere un volume sufficiente per la dialisi.
- Chiudere il tubo e mettere rapidamente il tubo di dialisi nel mezzo di rilascio (tubo di centrifuga). Ritirare rapidamente 100 μL del mezzo di rilascio dal tubo di dialisi esterno come campione per il tempo 0. Immediatamente mettere il campione in -20 ° C per ulteriori analisi. Aggiungere 100 μl di frescoImmettere il mezzo nel tubo di centrifuga per sostituire il campione ritirato. Avviare il timer.
- A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, prelevare 100 μL del mezzo di rilascio e sostituirlo con 100 μl di terreno fresco. Immediatamente mettere i campioni prelevati in -20 ° C per ulteriori analisi.
- Dopo 72 h, estrarre tutti i campioni da -20 ° C e scongelarli a temperatura ambiente. Misurare le concentrazioni di NGF dei campioni di rilascio utilizzando il kit Sandwich ELISA.
4. Bioattività delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti (studio di crescita dei neuriti)
- Coltivano le cellule PC12 nel supporto RPMI-1640 integrato con 10% di siero di cavallo caldo inattivato, 5% di siero fetale bovino, 100 μg / mL di streptomicina e 100 unità / ml di penicillina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C e con 5% CO 2 .
- Quando le cellule raggiungono la confluenza di ~ 70-80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con 1x PBS (circa 2 ml per 10 cm <Sup> 2 superficie della coltura). Rimuovere la soluzione di lavaggio. Trypsinizzare le cellule con l'aggiunta di 0,25% di soluzione Trypsin-EDTA (0,25% di trysina e 1 mM EDTA, 0,5 ml per superficie di coltura da 10 cm 2 ) nel pallone e incubare a 37 ° C fino a quando non vengono eliminate più cellule.
- Aggiungere due volumi di terreno di coltura e spin giù a 180 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura. Filtrare le cellule attraverso un ago di 22 G, ½ pollici per rompere i cluster di cellule.
- Distribuire le cellule ad un rapporto di 1: 3 in una nuova colonna di coltura cellulare. Dopo incubazione durante la notte, rimuovere le cellule PC12 non collegate. Lasciare che le cellule collegate rimangano per un'ulteriore crescita.
- Ripetere questa procedura per 3 passaggi per selezionare la sottocultura di PC12 che ha una forte proprietà di adesione. Preimballare una piastra a 6 pozzetti con 800 μL / pozzetto di collagene di tipo I di ratto (100 μg / ml).
- Trypsinizzare le celle PC12 selezionate come descritto nel passaggio 4.2 e filtrarle attraverso una22 G, ½ pollici ago per rompere i cluster di cellule. Conte le cellule con un emocitometro. Seed le cellule durante la notte a una densità di 10.000 cellule / pozzetto nella piastra a 6 pozzetti pre-rivestiti nel punto 4.5 per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra.
- Diluire il NGF (10 μg / mL) e NGF HDL-imitanti NPs (10 μg / mL) con il terreno di coltura (descritto al punto 4.1) per preparare concentrazioni di 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Rimuovere 2 mL di mezzo da ogni pozzetto e sostituire con 2 mL di NGF liberi diluiti NGF o NGF HDL-imitanti NP. Cultura per 4 giorni.
- Il giorno 4, cambiare il mezzo medio al fresco (descritto nel punto 4.1) contenente il trattamento corrispondente e proseguire il trattamento per altri 3 giorni.
- Il giorno 7, visualizza le cellule con un microscopio leggero invertito e immagine ogni pozzetto a punti casuali sotto l'ingrandimento di 10 volte.
5. Biodistribuzione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti
- Usi i topi adulti BALB / c (maschio, 25-30 g) a tEst la distribuzione dei tessuti dei NP NGF. Ridurre a caso i topi in tre gruppi di 3 topi per gruppo. Utilizzare un contenitore a forma di cono ( ad esempio, decapicone) per trattenere un topo e strofinare la coda con etanolo per promuovere la vasodilatazione e la visibilità della vena.
- Iniettare 100 μL di NPs nocivi, NGF liberi o NGF HDL, a ciascun gruppo di topi (3 gruppi) attraverso le vene della coda ad una dose di 40 μg / kg di NGF. Usare un ago da 30,5 G attaccato ad una siringa da 1 ml.
- A 30 minuti dopo l'iniezione, anestetizzano i topi usando l'isoflurano inalato del 3% (in ossigeno a portata di 2 L / min). Esegui una coda e un pizzico per determinare la profondità dell'anestesia. Raccogliere il sangue per foratura cardiaca.
- Prendi circa 1 ml di sangue dal cuore. Eutanizzare ogni mouse dalla dislocazione cervicale.
- Mettere la carcassa del mouse in ricompensa dorsale. Aprire l'addome utilizzando forbici chirurgiche e spostare grasso e intestino da parteUtilizzando un tampone di cotone per esporre il fegato, la milza e il rene. Raccogliere questi tessuti e sciacquarli in 1x PBS per pulire il sangue.
- Centrifugare immediatamente i campioni di sangue a 3.400 xg e 4 ° C per 5 minuti per ottenere il plasma. Conservare il plasma ei tessuti a -80 ° C fino alle analisi.
- Per analizzare i campioni di tessuto, spostare i campioni da -80 ° C a 4 ° C e sospendere 100 mg di campione di tessuto in un volume di 10 volte di tampone di estrazione (0,05 M di sodio acetato, 1,0 M di cloruro di sodio, 1% di tritone X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenilmetanesolfonilfluoruro e 0,2 mM benzetonio cloruro). Homogenizzare a 10.000 giri / min e 4 ° C per 5 min.
- Sacrificare due topi non trattati per raccogliere plasma e tessuti vuoti, come descritto nei passaggi 5.3 e 5.4. Preparare soluzioni standard NGF usando omogenei in polvere vuota o in tessuto vuoto.
- Determinare le concentrazioni di NGF nei homogenati del plasma e del tessuto utilizzando il kit Sandwich ELISA, come sopra descritto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nella figura 1 è mostrato lo schema di ingegnerizzazione dei NPs NGF rivestiti con α-tocoferolo emulsionati in HDL preparati da una strategia di ioni-coppia. Per neutralizzare le cariche superficiali di NGF, la protamina USP è stata usata come agente di ioni-coppia per formare un complesso con NGF. Per proteggere la bioattività, sono stati progettati prototipi NPs che imitano HDL, in primo luogo utilizzando l'omogeneizzazione; Quindi il complesso NGF / protamina è stato incapsulato nei prototipi NP. L'omogeneizzazione ha fornito energia sufficiente e promosso con successo la miscelazione degli eccipienti. Dopo un'omogeneizzazione di 3 min, sono stati ottenuti formati coerenti di particelle (circa 170 nm) per i prototipi NP ( Figura 2 ). Apo AI è stato incubato con i prototipi NP in condizioni diverse, tra cui 2 ore di agitazione a temperatura ambiente; 4 h di agitazione a temperatura ambiente; 4 h di agitazione a temperatura ambiente, seguita da incubazione a 4 ° C; E mescolando a temperatura ambiente overnight. Oltre il 26% di Apo AI è stato incorporato nei NP quando viene agitato a temperatura ambiente durante la notte. Per aggiungere il complesso NGF-protamina, il complesso è stato incubato con prototipi NP per 30 minuti a 37 ° C e poi Apo AI è stato aggiunto alla miscela per finire il rivestimento finale di Apo AI sulla superficie dei NP. Utilizzando la procedura qui descritta, i NP NPN NGF definiti in HDL avevano dimensioni particelle di 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), con il 65,9% dell'efficienza di entrapment NGF ( Tabella 1 ). NGF HDL-imitatori NP ha una carica negativa lieve ( Tabella 1 ). I NP avevano una distribuzione di dimensioni ridotte e incorporando NGF nei NP non hanno influenzato la dimensione delle particelle ( Figura 3 ).
Per misurare l'efficienza di intrusione di NGF, sono stati valutati diversi metodi per separare NGF scaricati da NGF HLD-imitanti NP. Inaspettatamente, NGF non può passare un filtro di separazione (cutoff di peso molecolare: 100 kDa). Gel fiLe colonne di collaudo, tra cui Sephadex G-50, Sephadex G-100 e Sephacryl S-100, non possono separare NGF e NGF NPN che imitano HDL, poiché entrambi usciranno nelle stesse frazioni dopo l'eluizione. Una colonna Sepharose CL-4B ha eseguito la separazione con il caricamento del campione ottimizzato, il buffer di eluizione ed il tasso di eluizione. Come mostrato in Figura 4 , NP non imbottigliati NGF e NGF HDL sono stati completamente separati su una colonna Sepharose CL-4B.
Un metodo di dialisi è stato utilizzato per studiare il rilascio in vitro di NPs NGF HDL-imitanti in PBS con 5% BSA, che è stato incluso per imitare le condizioni fisiologiche nel sangue. Aumentando la dimensione del dispositivo di dialisi (cutoff di peso molecolare: 300 kDa) e aggiungendo PBS e BSA al mezzo di rilascio, NGF non si legava con la membrana di dialisi e liberamente passò. Di conseguenza, il recupero di NGF libero in questo metodo di dialisi era superiore all'85% ( Figura 5 ). NGFNPs che imitavano HDL hanno mostrato un profilo di rilascio lento e circa il 10% dell'NGF è stato rilasciato dai NP oltre 72 ore ( Figura 5 ).
Per testare la bioattività di NPs NGF HDL-imitanti, è stata selezionata la subcultura di cellule PC12 che avevano una forte proprietà di adesione per condurre un esame di outgrowth neurite. La Figura 6 rappresenta l'immagine della crescita di neurite quando le cellule sono state trattate con 50 ng / mL di NGF liberi ( figura 6A ) e NPs di NGF HDL-imitanti ( Figura 6B ). Quando la concentrazione di trattamento era superiore a 10 ng / mL, la crescita del neurite è stata osservata chiaramente dal microscopio. A queste alte concentrazioni, i NPs NGF e NGF NPN non hanno mostrato una differenza significativa sull'effetto della crescita del neurite. Quando la concentrazione di NGF era inferiore a 10 ng / mL, la crescita del neurite non poteva essere osservata chiaramente, sia per il NGF libero che per i NP NPM NGF. Biodistribuzione stUdies sono state eseguite per confrontare i comportamenti in vivo di NPs NGF e NGF HDL liberi. Come mostrato in Figura 7 , NP NPM NGF HDL ha significativamente aumentato la concentrazione plasmatica e diminuisce l'assorbimento nel fegato, nel rene e nella milza.
Figura 1: Lo schema di ingegneria delle nanoparticelle NGF HDL-imitate preparate da una strategia di ioni-coppia. NGF è una molecola idrofila caricata negativamente. Un peptide cationico, protamina, è stato usato per neutralizzare le cariche e ha formato un complesso di ioni-coppia con NGF. L'olio di colestero, i fosfolipidi e il TPGS hanno costituito NP prototipi di auto-assemblaggio per omogeneizzazione. Il complesso NGF / protamina è stato incorporato nei prototipi NP. Infine, Apo AI è stata ricoperta sulla superficie NP dopo incubazione di notte. Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'influenza dell'omogeneizzazione sulla dimensione delle particelle delle nanoparticelle prototipo. Gli eccipienti, PC, SM, PS, CO e TPGS, che sono stati disciolti in etanolo, sono stati aggiunti a flaconi di vetro e il solvente è stato evaporato sotto il flusso di N 2 . 1 ml di acqua è stata aggiunta e omogeneizzata a 9.500 giri / min per tempi diversi. Sono state misurate le dimensioni delle particelle di nanoparticelle successive. I dati sono presentati come la media ± deviazione standard (n = 4). Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. 16 . Per favore cliCk qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Distribuzione delle dimensioni e delle dimensioni delle particelle di nanoparticelle di imaging HDL in bianco e NGF che simulano le nanoparticelle HDL. Le dimensioni e le distribuzioni delle particelle sono state misurate usando un analizzatore di particelle. Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. 16 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Chromatogrammi di nanoparticelle NGF e NGF HDL che imitano nanoparticelle su una colonna Sepharose CL-4B eluita da PBS. 200 μl di soluzione NGF libera (10 μg / mL) e NGF NP sono stati caricati su tColonna di filtrazione a gel e eluita con 1x PBS. Per entrambi i campioni sono stati raccolti complessivamente dodici frazioni (1 mL per ciascuna frazione). L'intensità NP in ciascuna frazione è stata misurata da un analizzatore di particelle e la concentrazione di NGF in ciascuna frazione è stata misurata utilizzando un kit Sandwich ELISA. Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. 16 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rilascio in vitro di nanoparticelle NGF HDL che misurano un metodo di dialisi. PBS con 5% BSA è stato usato come mezzo di rilascio. 200 μl di soluzione NGF libera (10 μg / mL) o NGF NPs sono stati aggiunti ad un tubo di dialisi integrato con 400 μL del mezzo di rilascio. Il tubo di dialisi è stato messo in 30 ml di mezzo di rilascio pre-riscaldato. Lo studio è stato eseguito a 37 ° C con scuotimento di 135 giri / min. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, 100 μL del mezzo di rilascio è stato ritirato e sostituito con 100 μL di terreno fresco. La concentrazione di NGF in ciascun campione è stata misurata utilizzando un kit Sandwich ELISA. I dati sono presentati come la media ± deviazione standard (n = 4). Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. 16 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: L'influenza dei nanoparticelle NGF HDL che imitano le nanoparticelle sulla crescita del neurite nelle cellule PC12. Le cellule sono state trattate con 50 ng / mL di NGF ( A ) libero D NGF HDL-imita le nanoparticelle ( B ) per 7 giorni. Il neurite è stato ripreso utilizzando un microscopio leggero invertito sotto ingrandimento 10X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Il confronto della biodistribuzione tra i nanoparticelle NGF e NGF HDL-imitanti nei topi (n = 3). I topi sono stati somministrati con 40 mg / kg di NGF mediante iniezione della coda-vena e sono stati sacrificati a 30 minuti dopo la somministrazione. Il sangue, il fegato, la milza e il rene sono stati raccolti e la concentrazione di NGF in ciascun campione è stata misurata utilizzando un kit Sandwich ELISA. I dati sono mostrati come la media ± deviazione standard. Questa cifra è stata modificata da Prathipati et al. 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campione | Dimensione delle particelle (nm) | PI | EE% di NGF | Potenziale Zeta (mV) |
| NGF NPN che imitano HDL | 171,4 ± 6,6 | 0,239 ± 0,01 | 65,9 ± 1,4 | -12,5 ± 1,9 |
Tabella 1: Caratterizzazione di nanoparticelle NGF HDL-imitanti (n = 3). I dati sono mostrati come la media ± deviazione standard. Questa tabella è stata modificata da Prathipati et al. 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo studio dimostriamo un metodo semplice per preparare NPs imitanti HDL per l'incapsulamento di NGF. Sono stati studiati diversi sistemi di erogazione di NP per fornire proteine. Attualmente, molti preparati NP coinvolgono la dialisi, la precipitazione dei solventi e l'idratazione del film. Questi processi sono generalmente complessi e impegnativi in termini di scalabilità. Durante questo sviluppo di NP, è stato determinato che i lipidi avevano una forte adesione alla parete di vetro del contenitore, che ha portato alle difficoltà nell'idratazione del film sottile e miscelando efficacemente gli eccipienti. Data la molteplicità dei componenti nei NP naturali di HDL, la miscelazione è diventata molto impegnativa e fondamentale per la preparazione di NP NPN che imitano HDL. Secondo i risultati, aumentando la temperatura e il tempo di miscelazione non hanno contribuito alla formazione di NP. L'omogenizzatore è uno strumento comune nella produzione industriale e fornisce un'elevata forza di energia e la forza di taglio per la miscelazione. Applicando questo strumento alla preparazione NP, NPs monodispersati con l'aI formati appropriati sono stati prodotti entro 3 minuti ( Figura 2 e Figura 3 ), che ha notevolmente ridotto il tempo di lavorazione e ha semplificato la procedura di preparazione.
La grande sfida per applicare macromolecole alla somministrazione terapeutica non è solo la consegna, ma anche la formulazione. Le proteine sono normalmente solubili in acqua e hanno grandi dimensioni e cariche sulle loro superfici, che impediscono l'incapsulamento di proteine in NPs a base lipidica. La protamina USP, una poliazione, è stata utilizzata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF. Dopo aver mescolato NGF e protamina, è stato osservato chiaramente il precipitato bianco che ha indicato la formazione del complesso insolubile. Con l'aiuto del complesso, circa il 70% del NGF è stato intrappolato all'interno dei NP, con una distribuzione di dimensioni ridotte ( Tabella 1 e Figura 3 ). Inoltre, la stabilità delle proteine doveva essere considerata durante lo sviluppo della formulazione. Per evitare l'influenza dell'omogeneizzazioneSulla stabilità NGF, la procedura è stata regolata per aggiungere un complesso NGF dopo l'omogeneizzazione. Sotto una condizione di incubazione molto lieve (30 min a 37 ° C), il complesso NGF è stato incorporato nei NP. Sono state testate diverse procedure per aggiungere Apo AI; Tuttavia, l'incubazione di notte a temperatura ambiente era ancora necessaria per caricare abbastanza Apo AI sulla superficie dei NP. Sulla base dei risultati del saggio di outgrowth neurite, la bioattività di NGF dopo la preparazione NP è stata mantenuta con successo con la procedura qui presentata ( Figura 6 ). Inoltre, l'incapsulamento di NGF nei NPs che imitano HDL ha migliorato la circolazione sanguigna di NGF, come indicato dagli studi di biodistribuzione ( Figura 7 ). Questi risultati dimostrano che NGF è stato formulato con successo con un sistema di consegna NP. I NP NPN che imitano HDL possono aiutare NGF, permettendo una lunga durata nel tempo e in vivo .
Sviluppare metodi analitici appropriati è anche chaPer la nanomedicina a base di proteine. Per misurare l'efficienza di entrapment e il rilascio in vitro , è obbligatorio separare la droga non caricata da nanoparticelle cariche. Le membrane con determinati tagli di peso molecolare vengono comunemente utilizzati per questo scopo e funzionano bene per le piccole molecole. Tuttavia, non è facile separare le proteine scaricate e le nanoparticelle caricate da proteine, principalmente a causa delle dimensioni simili e delle proprietà leganti delle proteine. Gli NPs liberi NGF e NGF HDL non possono essere separati utilizzando il dispositivo di filtrazione a membrana, sebbene la taglia di peso molecolare della membrana sia di 100 kDa (la più grande dimensione dei pori per i dispositivi di filtrazione commerciale). Dopo che sono state testate diverse colonne di filtrazione gel, NPs NGF e NGF HDL-imitanti sono stati infine separati utilizzando una colonna Sepharose CL-4B. Tuttavia, il caricamento del campione sulla colonna doveva essere mantenuto a 200 μL per ottenere cromatogrammi riproducibili. Anche gli agenti di eluzione erano importanti. Quando l'acqua era usataPer eluire NGF, è stato ottenuto un cromatogramma molto ampio; NGF è stato rilevato dalle frazioni da 5 a 20. L'ampio cromatogramma potrebbe essere stato causato dalla forte interazione tra NGF e le perle. Dopo che sono stati testati diversi agenti di eluizione, quali 5 mM NaCl e 50 mM NaCl, PBS è stato confermato come un agente di eluizione sufficiente. Inoltre, la sfida di separazione è rimasta per gli studi in vitro . La separazione delle colonne non è adatta per gli studi di rilascio in vitro a causa del numero di campioni liberati da misurare e del potenziale per l'ulteriore rilascio di NGF dai NP quando passano la colonna. Dopo che sono state testate varie condizioni, è stato determinato il metodo di dialisi descritto nel protocollo. Secondo i risultati ( Figura 5 ), il NGF libero può liberamente passare la membrana passante (peso molecolare di taglio: 300 kDa) in PBS contenente 5% BSA. Con questo controllo positivo, il risultato di rilascio dei NPs NGF HDL-imitatori è diventato affidabile. L'aumento della dimensione dei pori e decrementoIl legame associato a membrana causato da PBS e BSA ha contribuito alla penetrazione libera di NGF attraverso la membrana di dialisi.
Oltre alle suddette problematiche, un'altra sfida con il test di outgrowth neurite è sorto. Esiste un kit di analisi di outgrowth neurite commerciale che si basa su una subclone delle cellule PC12. Tuttavia, la subclone delle cellule PC12 non è più disponibile in commercio. Le cellule normali PC12 sono cellule galleggianti che non coltivano molto bene i neuriti e che sono facilmente perdibili durante le procedure sperimentali. Dopo diversi errori, è stata scoperta una piccola popolazione di cellule PC12 che presentavano una forte proprietà di adesione. Così, questa popolazione di cellule è stata selezionata attraverso diversi passaggi, come descritto nel protocollo. Di conseguenza, il dosaggio è stato condotto con successo e dimostra la bioattività comparata di NGF HDL-imitanti NP con NGF libero ( Figura 6 ).
Il metodo riportato qui è una procedura semplice per la thE preparazione di NPs imitanti HDL. Abbiamo attaccato il 26% di Apo AI sui NP, che è stato più di tre volte superiore a quello riportato in letteratura 16 . Oltre il 65% di NGF è stato intrappolato nei NP, pari a 2 volte superiore a quello della letteratura 16 . Con questi aumenti dell'efficienza di entrapment sia per Apo AI che per NGF, potrebbe non essere necessario purificare i NP. Di conseguenza, la preparazione del NP è stata semplificata. L'Apo AI e NGF scaricati nella preparazione NP non hanno influenzato il rilascio in vitro di NGF ( Figura 6 ) e la biodistribuzione in vivo ( Figura 7 ), ma potrebbe influenzare gli studi di stabilità e in vitro . Gli studi qui dimostrano che è possibile migliorare ulteriormente l'efficienza di entrapimento di Apo AI e NGF modificando la composizione e le procedure di preparazione di NP. Inoltre, i romanzi NPs che imitano HDL e le strategie in questi studi potrebbero essere utilizzati per caricare altri grSebbene l'agente di ioni-coppia (protamina) possa essere modificato per adattarsi al fattore di crescita specifico. L'immagazzinamento a lungo termine delle formulazioni proteiche è impegnativo. Il modo preferito per mantenere NPs caricate da proteine è quello di liofilizzare le polveri secche. Tuttavia, la liofilizzazione potrebbe aumentare la dimensione delle particelle e ridurre l'efficienza di entrapment della proteina dopo la ricostituzione di NPs liofilizzati. Alcune pubblicazioni hanno discusso la liofilizzazione di NPs che imitano HDL. Stiamo studiando la liofilizzazione di nuovi NP NPN che imitano HDL. Infine, NPs che imitano HDL potrebbero diventare clinicamente applicabili quando possono essere immagazzinati in modo appropriato per un lungo periodo di tempo (almeno 6 mesi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K.
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
