Summary
使用亲脂性1,1'-二十八烷-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高碘酸盐（DiI）染色技术， 墨西哥眼囊炎可以进行血管灌注，以便容易地观察脉管系统。
Abstract
灌注技术已经被使用了几个世纪来可视化的组织的循环。 Axolotl（Ambientoma mexicanum）是一种蝾螈，已经成为再生研究的基本模型。在这些动物的再生背景下，如何发生血运重建知之甚少。这里我们报告了一种简单的方法，可以通过灌注1,1'-二十八烷-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）来观察轴突血管的脉管系统。 DiI是一种亲脂性碳菁染料，可瞬间插入内皮细胞的质膜。使用蠕动泵进行灌注，使得DiI通过主动脉进入循环。在灌注过程中，染料流经腋窝血管，并与血管内皮细胞的脂质双层接触。灌注程序大约需要一个小时，一个8英寸的腋窝。灌注后立即wi可以用共聚焦荧光显微镜观察腋窝。当用绿色荧光过滤器激发时，DiI发出红橙色范围内的光。该DiI灌注程序可用于显示腋窝的血管结构或显示再生组织中血运重建的模式。
Introduction
脉管系统的可视化在理解许多物种生物体的结构和功能方面起着至关重要的作用。从达芬奇到十六世纪开始，研究了流通模式和图形表达方式1 。使用蜡和橡胶模具，灌注组织以产生脉管系统的三维模型，其允许研究器官发生和发病机制1,2 。树脂和蜡被染色，如印度墨水或胭脂红，以使其易于观察1，2 。然而，这些技术引起许多问题，因为它们的高粘度阻止了感兴趣组织的完全灌注1 。随着现场变得越来越复杂，使用共焦和电子显微镜发挥作用，移动灌注技术远离铸模和脉管系统的液体灌注，其中一些允许血管的灌注和成像，而不会破坏初始组织3 。 DiI，荧光碳菁染料，是一种这样的污渍，允许动物的灌注而不损伤血管组织。
碳花青染料是亲油性染料，其在接触时并入细胞膜。这些染料允许血管内皮细胞容易和即时的染色，然后可以在荧光共焦显微镜下观察。 DiI通过细胞脂质膜中的侧向扩散移动，如神经元4的标记和追踪所示 。在化学上，DiI的两个烷基链赋予染料对细胞膜的高亲和力，而来自荧光染料的两个共轭环，当由绿色荧光灯过滤器激发时负责发出红色波长> 4。 DiI已被广泛使用，包括成功标记质膜，并在神经元5,6 中进行顺行和逆行标记。 DiI先前已被用于灌注协议，同时可视化小鼠的脉管系统7 。
鸵鸟（ Ambosoma mexicanum ）是蝾螈，仅在墨西哥墨西哥城附近的咸水湖泊生活。这些动物已经成为理解再生过程的重要模型，因为它们可以再生全肢，尾巴（包括神经线），心脏和其他内脏的部分，以及部分眼睛作为成年人8,9 。此外，随着近来在斧头应用遗传工具，现在有可能对分子和驱动这些过程的细胞进行前所未有的洞察。成功的再培训整个肢体的配对需要广泛的血运重建过程，其可以在再生中起重要作用，而不仅仅是提供氧气和营养物质的血管的传统功能。了解组织再生背景下的血运重建势在必行。以前使用印度墨水可视化Axolotl血管，而结果令人感兴趣，这一过程在接下来的几十年中没有被重新审视。我们力求适应开发用于哺乳动物的DiI灌注协议，以允许完整的灌注和可视化的轴突脉管系统7 。该协议描述了用DiI染色技术成功灌注并随后使腋窝循环显现的步骤。该程序将允许在内稳态组织以及再生组织中专利血管的精确可视化，并提供一种新颖的视觉化方法n和腋窝血运重建过程的分析。
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Protocol
所有腋窝实验均按照布莱根妇女医院（BWH）机构动物护理和使用委员会进行。
1.设置灌注实验
- 将成年腋窝置于装有0.1％三卡因溶液（MS222）的塑料容器中15-20分钟或直到完全麻醉。确保容器中充满足够的三氯氰胺溶液，使腋窝完全浸没。
注意：所有程序必须按照机构动物护理指南进行。在BWH时，如果脚踝测试失败，则认为腋窝完全麻醉，这意味着当脚轻轻挤压时，没有反射运动。
注意事项：尽管三奈因是特别用于水生生物的麻醉剂，但应避免与三氯氰菊酯溶液直接皮肤接触。 - 设置axolotl灌注站。
- 放置吸收垫在平坦的水平表面上，吸收面朝上。
- 在聚苯乙烯泡沫框架中切割一个适当尺寸和形状的孔，使麻醉的腋窝躺在仰卧位。将框架放在吸收垫上。
注意：一些额外的纸巾可以立即放在框架下面以获得更多的吸收。 - 用灌注管装入蠕动泵。将泵设置为0.7ml / min的流速，顺时针方向流动。
- 在1：4混合物中用0.7倍PBS和5％葡萄糖稀释溶液。
- 将10mL稀释液与200μLDiI储备溶液混合在50mL锥形管中。盖帽并通过倒置混合。用铝箔纸覆盖该管，以保护工作溶液免受光照。
注意：体积应根据腋窝尺寸按比例进行更改。这些值是一个大约15厘米的轴向长度（鼻子到尾部的长度）。一个这个大小的小数可能没有达到完全的性成熟度，所以动物的性别可能不会在这个时候确定。 - 用0.7x PBS填充50mL锥形管。
注意：PBS将用于引发环和axolotl放血。 - 将27号蝶形针连接到灌注管的出口端。将蝴蝶翅膀彼此折叠并放置在夹具架上。
- 将灌注管的自由端放入装有0.7x PBS的50mL锥形管中，并运行灌注泵，直到整个管填充溶液。一旦整个管道充满PBS就暂停泵。
注意：确保管道始终没有气泡，因为这些将导致轴突中的空气栓塞，并防止充分灌注。 - 在聚苯乙烯泡沫框架的斧形模具中放置纸巾。使用转移移液管，用三卡因溶液浸泡毛巾。
注意：在纸巾中间切一个小方块以允许在灌注过程期间排出液体。 - 将麻醉的腋窝仰卧放置在聚苯乙烯泡沫框架内的纸巾上。
2.打开Axolotl胸部
- 使用外科镊子沿着axolotl胸部的中心轴线夹紧皮肤，就在肩膀的下方。拉起。
- 使用手术刀做一个小切口，皮肤被拉。
- 在胸部取出一个方形斑块，以露出两个软骨板。
- 去除皮肤以在胸腔上打开一个足够大的窗口，以清楚地看到心脏和大约5毫米的从心脏分支的主动脉。
- 使用镊子或封闭的剪刀小心撕开结缔组织，以避免切割任何主要的血管。
- 使用镊子单独提起每个软骨板，并将其切除用外科剪刀。
- 使用镊子小心地夹住心包，用手术剪刀拉起并刺穿心包;该切口应该足够深以刺穿非常薄的心包，并且应该足够大以允许去除心包。小心别切心。
- 精心移除心包露出心脏和主动脉。
注意：使用转移移液管，定期用三卡因溶液冲洗胸腔和鳃，以保持区域清洁并保持腋窝麻醉。
灌注Axolotl
- 将装载的蝴蝶针放置在聚苯乙烯泡沫框架旁边的夹具架上，使得夹具的臂能够容易地被操纵以将针头插入到轴突主动脉中。在插入过程中将针的尖端朝向动物的头部方向，并将针保持平行于主动脉，以避免穿刺通过手术正面
- 打开蠕动泵。 0.7x PBS应继续流经管路。
- 将针插入主动脉。
- 将主动脉弓下方的镊子滑动，稍微拉起以便于进入。
- 操纵针夹组合，使得针沿着主动脉的长度延伸，向上朝向头部。使用镊子插入针头，以支持主动脉后面。
注意：针头应插入主动脉足够深，以确保灌注期间不会滑出。对于15厘米的轴突，这可能是约5毫米。确保针与主动脉完全一致，以避免完全穿刺血管。穿透穿刺可引起大量出血并降低灌注成功率。成功插入可以通过心脏心房的可见扩大来确认。
- 用sci快速撕开一个中庭游标，让血液流失。
- 与三卡因溶液冲洗，以防止胸腔内血液积聚和血块形成。
- 用约20-30 mL PBS灌注腋窝。 成功灌注后，动物应从浅粉红色变为白色。
- 暂停蠕动泵，将管道的自由端移至15 mL DiI溶液管中。重新启动泵，注意避免在管道中产生任何气泡。
- 将斧头与DiI的整个工作库存完全一样。
注意：在成功的灌注中，痣样变化为DiI的明亮粉红色。这在鳃中最为显着。 - 用DiI灌注完成后暂停泵，将管子的自由端放入4％的多聚甲醛（PFA）溶液中以固定组织。重新启动泵并灌注至少10 mL的PFA。
注意：PFA有毒，应处理和排除适当地。应穿戴手套和安全眼镜，并应在通风橱内进行解决。用PFA灌注腋窝与固定组织导致动物死亡。
4.结束灌注和可视化准备
- 停止蠕动泵，并从腋窝主动脉取出针头。
- 将腋窝放在塑料板上。
注意：使用一个大的培养皿的一半效果很好，并允许将少量的三聚氰胺或PBS倾倒在腋窝上，以保持皮肤湿润并提高可视化质量。 - 将所有使用的材料处理在适当的废物箱中。使用70％乙醇清洁外科手术工具，使用动物之间的玻璃珠灭菌器消毒，并按照程序通过高压灭菌灭菌。用PBS溶液冲洗管道，然后排干，充分干燥，并存放以供进一步使用。
Perfused Axolotl可视化
注意：要获得高质量的图像，可以使用以下参数：曝光1.1秒，增益1倍，饱和度1.0，放大倍数2倍。
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Representative Results
通过DiI染色，可以容易地观察到axolotl的脉管系统。在荧光共焦显微镜下立即可见用亲脂性染料灌注的动物血管。 图 1.1-1.5是灌注方案的示意图。灌满明亮的粉红色染料后，成功灌注的腋窝会出现粉红色。在共焦显微镜上使用绿色荧光滤光片会出现血管网络的红色发射。灌注成功时，所有身体组织都会发生DiI染色，包括尾巴，四肢，鳃和眼睛（ 图2A ， 图2B ， 图2C ， 图2D ）。不成功的灌注导致缺乏红色染色的脉管系统或血管斑块染色。
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图1：灌注方案示意图。成功灌注亲脂性染料DiI的Axolotls在成像时显示脉管系统的全部染色。灌注实验前全仰卧斧2：打开腋窝的胸部。 2：腋窝开胸腔。 3：将27 G蝴蝶针插入腋窝主动脉。 4：管道应首先含有0.7x PBS，然后是DiI工作溶液，最后含有4％PFA。 5：完全灌注的腋窝出现粉红色。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：完全灌注Axolo的图像TL。使用DiI染色成功灌注后，使用荧光共焦显微镜拍摄腋窝脉管系统的图像。 2A：尾。 2B：脚。 2C：鳃。 2D：眼睛。使用具有绿色荧光发射过滤器立方体的共焦显微镜进行成像。图像A，B，C和D的放大倍数分别为1.74X，2.16X，1.18X和5.69X。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
可以通过用亲脂性碳菁染料DiI灌注成功地实现腋窝的脉管系统的可视化。在本研究中，我们用蠕动泵描述了用DiI灌注腋窝的新方案。我们还使用荧光共焦显微镜显示了axolotl脉管系统的随后的可视化。该方案是Li 等人所述的啮齿动物DiI灌注方案的改编。 7 ，然而啮齿动物和腋窝之间的主要差异需要修改协议以适应axolotl模型。
本研究讨论了一种Dio灌注方法，以便成功地观察脉管系统。蝾螈和啮齿动物之间的解剖学和生理学差异在灌注的主要方面需要改变，包括针插入位置，灌注方法和所用的试剂。为了ach即成功灌注，我们限制了对腋窝脉管系统造成的伤害。在打开胸腔时，要注意充分暴露心脏和主动脉，同时避免对主要血管造成任何损伤或撕裂。限制手术剪刀的使用可防止主要血管的意外夹紧，而小切口可以控制心脏和主动脉的暴露。当DiI针穿过主动脉而不是直接插入心脏的腔室时，灌注成功率也增加。与小鼠不同的是，axolotl有一个三腔心脏，只含有一个比鼠标显着更小肌肉的心室。由于这些差异，针插入的位置必须移动到更稳定的主动脉。主动脉被确定为用于插入灌注针的最佳位置，因为其足够大以用于27G针刺穿并且运动受限。运动最小以避免灌注针的意外移除或滑动或主动脉穿刺穿刺。使用心室作为插入点的心脏灌注被证明具有比具有主动脉插入点的成功率低得多的成功率。脉管系统的错误穿刺常常导致栓塞的形成或阻止灌注，导致血管标记成功率很低。灌注过程中使用夹具支撑蝶针，我们减少了运动，从而提高了灌注成功率。另外，由于腋窝组织的细腻，当与小鼠相比时，与以前使用的手动灌注相反，需要蠕动灌注泵。这种泵的使用允许对腋窝灌注的免提方法以最小化薄组织的错误穿刺。由于许多其他原因，包括穿透和穿透点，灌注不成功ure，凝血和栓塞。在将针插入主动脉并通过后壁产生第二次穿刺的情况下，DiI溶液将直接流入胸腔而不是通过全身循环。此外，一旦血液离开脉管系统，其迅速形成可能阻碍灌注的血块。脉管系统也可能形成栓塞和气泡，导致阻塞成功灌注的栓塞。最后，该方案结合了调整以适应腋窝渗透压的试剂，其显着不同于哺乳动物。该方案的适应性以及适合axolotl模型的重大变化将有助于理解再生期间组织再血管化过程。
DiI，粉红色，将灌注动物，并给它一个明亮的粉红色调。成功灌注的腋窝变得明亮的粉红色到肉眼，高度血管化区域出现更强烈的染色。使用绿色滤光片的荧光共焦显微镜观察的灌注动物可以在红橙色发射光谱中显现。脉管系统最好在更薄的组织中可视化，以最小化非血管组织的意外DiI染色。在DiI灌注后立即用4％多聚甲醛（PFA）灌注组织以固定组织。
DiI灌注是axolotl的终点实验。在手术过程中，所有动物的血液都被有效排出并用0.7x PBS替代，然后立即用DiI溶液，最后4％的PFA。这样会破坏斧头从事气体交换的重要行为的能力，并且失去了对其身体组织进行充氧的能力。由于这种终点性质，每次灌注仅捕获血管生长的单个时间点，并且动物在以后不能进一步灌注。由于这个时间限制必须使用多种动物来描述血管发育的时间过程。
该DiI协议以及用于改进DiI协议的修改可用于成功地标记和可视化axolotl的脉管系统。由于axolotl是研究再生的必需模型生物，成功的灌注开放了在再生过程中询问血管生成过程的机会。 axolotl是一种用于研究再生的模型生物，因为它是一种新生物，因此在整个成年期间保留了显着的再生能力。然而，再生组织的血运重建过程尚不清楚，因此DiI灌注对腋窝系统的适应提供了理解哺乳动物模型不可用的再生的机会。使用DiI灌注axolotl是研究revas的一种新型技术因此，该方案可以进一步用于了解疾病发育过程中的器官发生过程以及在再生过程中作为重要的工具。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项研究得到了Brigham妇女医院和三月份的支持。作者要感谢Whited Lab的所有成员的支持和建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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