Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la raccolta e l'elaborazione di campioni chirurgici umani per molteplici applicazioni a valle nello schwannoma vestibolare e nella ricerca delle cellule di Schwann.
Abstract
Gli schwannomi vestibolari sono le neoplasie più comuni dell'angolo cerebellopotintico, che costituiscono il 6-8% per cento di tutte le crescite intracraniche. Sebbene questi tumori causino perdita uditiva sensa-neurale fino al 95% degli individui affetti, i meccanismi molecolari che sottendono questa perdita dell'udito rimangono inaspettati. Questo articolo delinea i passi stabiliti nel nostro laboratorio per facilitare la raccolta e l'elaborazione di vari campioni di tessuto umano primario per applicazioni di ricerca a valle integrate nello studio degli schwannomi vestibolari. In particolare, questo lavoro descrive un quadro metodologico unificato per la raccolta, l'elaborazione e la coltura di Schwann e schwannoma da campioni chirurgici. Questo è integrato con processi di elaborazione parallela ora considerati essenziali per la ricerca attuale: la raccolta di secrezioni tumorali e nervose, la conservazione dell'RNA e l'estrazione di proteine dai tessuti raccolti, la fissazione del tessuto per la preparazione di sezioni,D l'esposizione delle cellule umane primarie ai virus adeno-associati per l'applicazione alla terapia genica. Inoltre, questo lavoro mette in evidenza l'approccio chirurgico traslabellinoso per raccogliere questo tumore come un'occasione unica per ottenere l'epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia. Sono forniti suggerimenti per migliorare la qualità sperimentale e mettere in evidenza metodi comuni.
Introduction
Gli schwannomi vestibolari (VSs) sono le neoplasie più comuni dell'angolo del cerebellopotina, diagnosticate in 1 ogni 100.000 individui. Anche se non metastatici, questi tumori influenzano gravemente la qualità della vita di un paziente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Gli individui affetti abitualmente vivono con perdita dell'udito, tinnito e una sensazione di pienezza ascoltale. I sintomi diventano sempre più debilitanti quando il tumore cresce, causando problemi di equilibrio, paralisi facciale e alterazioni delle altre funzioni del nervo cranico. Anche le complicazioni pericolose per la vita a causa della compressione del tronco cerebrale possono avere luogo 7 .
Le opzioni di gestione per VS sono essenzialmente limitate all'attesa vigile di tumori statici e terapia radioterapica stereotattica o resezione chirurgica per tumori in crescita Poiché VS provengono da un nervo sensoriale periferico ( vale a dire il nervo vestibolare), è importante confrontare le osservazioni associate a VS con quelle derivate da un appropriato nervo di controllo, come il grande nervo auricolare umano (GAN). GANs sani vengono sacrificati regolarmente durante le parotidectomie o le dissezioni del collo e possono essere utilizzate come modelli robusti per una fisiologia sana di Schwann 9 . Poiché non esistono farmaci approvati dalla FDA per il trattamento o la prevenzione di VS sporadiche, è indispensabile che i ricercatori illustrano la mecha molecolare sottostanteGli effetti della malattia per identificare i bersagli terapeutici. Le proteine che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi della VS includono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), la cicloossigenasi 2 (COX-2), il fattore nucleare kappa B (NF-κB), il fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa) , Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le relative molecole di segnalazione 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . I progressi recenti hanno ampliato e migliorato i protocolli per la raccolta, l'elaborazione, la cultura e l'analisi a valle degli schwannomi vestibolari umani primari e dei tessuti nervosi sani 18 , 19 . Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti sono progettati per ospitare la preparazioneZione di tali tessuti per un'unica applicazione di ricerca a valle ( vale a dire, solo la coltura cellulare). Questo articolo presenta un quadro metodologico unificato per l'elaborazione simultanea di un singolo campione primario umano VS o GAN per più applicazioni a valle: cultura specifica di tipo cellulare, estrazione proteica, conservazione RNA, raccolta della secrezione tumorale e fissazione tissutale. Questo lavoro illustra anche la raccolta chirurgica e l'elaborazione del fluido cerebrospinale umano (CSF) e della periliazione durante la resezione transcirculinata VS, in quanto questi tessuti strettamente correlati possono servire come fonti importanti di biomarcatori per VS. Infine, questo protocollo presenta passi per la trasduzione virale delle cellule VS umane primarie nella coltura come nuova applicazione di questo tessuto per l'uso nella terapia genica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il consenso informato scritto per la raccolta di tutti i campioni è stato ottenuto prima dell'intervento e gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale (Dichiarazione di Helsinki). Tutte le sezioni del protocollo di studio sono state approvate dal consiglio di revisione istituzionale del Massachusetts Eye e Ear e Massachusetts General Hospital.
NOTA: Le sezioni 1-7 qui di seguito sono progettate per essere eseguite in sequenza sulla ricezione di un campione primario umano VS o GAN dalla sala operatoria. L'elaborazione dovrebbe iniziare sempre con la sezione 1. Quindi, in linea di principio, l'RNA deve essere conservata prima (sezione 2), seguita dalla preparazione del tessuto per la raccolta delle secrezioni (sezione 3) e l'estrazione delle proteine (sezione 4). Il tessuto da coltivare (sezione 5 per VS, sezione 6 per GAN) può essere posizionato in mezzo di coltura integrato, mentre le sezioni 2, 3 e 4 vengono eseguite. La fissazione del tessuto per la sezione (sezione 7) è molto breve e cSia eseguito durante qualsiasi fase di centrifugazione. La sezione 8 (elaborazione di periferia) e la sezione 9 (elaborazione del CSF) possono essere eseguiti al momento della ricezione di perilymph o CSF dalla sala operatoria durante una resezione VS translabellina. La sezione 10 (trasduzione virale) può essere eseguita sulle cellule VS o Schwann in crescita nella cultura.
1. Preparazione e ricezione di un campione chirurgico
NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile, ad esempio un cappuccio per la cultura tissutale o un cappuccio di flusso laminare. Si prevede la conoscenza della tecnica base sterile.
- Preparazione del mezzo per la coltura cellulare primaria umana VS o Schwann
- Sciogliere una aliquota di 50 ml di sangue fetale congelato secco (FBS) in un bagno d'acqua di 37 ° C.
- Aggiungere 5 ml di miscela di penicillina / streptomicina a una bottiglia da 500 mL di DMEM / F-12, con una diluizione finale di 1: 100.
- Aggiungere i 50 mL di FBS scongelati alla bottiglia da 500 mL di DMEM / F-12,Con conseguente diluizione finale di 1:10.
- Scrivere sulla bottiglia la data, le iniziali del ricercatore e le informazioni supplementari ( ad esempio, 1% P / S, 10% FBS).
- Inserire il nuovo mezzo di coltura in frigorifero (4 ° C).
- Ricezione e pulizia del campione VS o GAN
- Nella sala operatoria, posizionare il campione VS o GAN appena raccolto in salina sterile in un contenitore di campioni. Trasportare il campione sul ghiaccio dalla sala operatoria ad un cappuccio flusso laminare in laboratorio.
NOTA: Le dimensioni e i pesi dei campioni variano in modo significativo tra i pazienti in base alla dimensione del tumore rilevante o alla quantità di nervo esaurito. - Togliere le aliquote della soluzione stock-solution di ialuronidasi (25.000 U / mL) e collagenasi (3200 U / mL) dal congelatore e lasciare che gli enzimi scongelano a temperatura ambiente (necessaria per il passaggio 5.1.4 o 6.1.6, a seconda che il campione sia Un VS o un GAN).
NOTA: la resuspensione degli enzimi liofilizzati iS descritta in dettaglio sulle schede informative sul prodotto. La collagenasi può essere risospesa in qualsiasi soluzione salina equilibrata libera da calcio e in ialuronidasi in una soluzione di 0,02 M tampone fosfato (pH 7,0), 77 mM NaCl e allo 0,01% di 1 mg / ml di albumina di siero bovino. L'attività specifica per ciascun enzima liofilizzato varia con il lotto e deve essere verificata prima della resuspensione. - Usando una serie di tre tubi da 1,5 ml riempiti di 1,4 ml di 1x PBS sterile, lavare il campione VS o GAN tre volte. Trasferire con cautela il campione da tubo al tubo con pinze sterili. Chiudere ogni tubo una volta che contiene il campione e agitare dolcemente per lavare.
NOTA: Per evitare l'inondazione dei tubi da 1,5 ml, è possibile utilizzare meno di 1,4 ml di PBS per tubo se il pezzo del tumore è grande. - Mettere il campione in un piatto a secco 60 mm di Petri e utilizzare pinze per rimuovere tutti i tessuti morti ( cioè porzioni cauterizzate, di solito bianche o opache a colori) e aree con vasi sanguigni prominenti.
- Usare fOrceps o una lama di bisturi per dividere il campione in pezzi separati per la conservazione dell'RNA, l'estrazione di proteine, la raccolta delle secrezioni, la fissazione e la coltura cellulare (vedere paragrafi 2 - 6).
- Trasferire il pezzo del campione indicato per la coltura delle cellule (sezione 5/6) in un nuovo piatto di coltura da 60 mm contenente 5-8 ml di mezzo freddo DMEM / F-12 integrato (in alternativa, il coperchio del primo piatto di coltura può essere Utilizzato per questo passaggio).
NOTA: La quantità di mezzo DMEM / F-12 necessario (a partire dal punto 1.1) dipenderà dalla dimensione del tumore o dal nervo, ma dovrebbe diminuire tra 5 e 8 ml. Questo pezzo può sedere nel mezzo di coltura mentre vengono eseguiti i passaggi successivi.
- Nella sala operatoria, posizionare il campione VS o GAN appena raccolto in salina sterile in un contenitore di campioni. Trasportare il campione sul ghiaccio dalla sala operatoria ad un cappuccio flusso laminare in laboratorio.
2. RNA Conservazione del tessuto VS e GAN (valido anche per l'epitelio sensoriale umano)
- Sotto la cappa a flusso laminare, trasferire 1-1,2 ml di soluzione di stabilizzazione RNA a un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), infilare brevemente la piccola tortaCe di tessuto designato per la conservazione dell'RNA (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) nella soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nella soluzione.
- Preparare ed etichettare un nuovo tubo da 1,5 ml. Recuperare il campione dalla soluzione di stabilizzazione RNA, trasferirlo al nuovo tubo e memorizzarlo in un congelatore -80 ° C.
3. Raccolta delle segrezioni VS e GAN
- Giorno 1
- Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), posizionare il pezzo di VS o GAN designato per la raccolta delle secrezioni in un tubo vuoto da 1,5 ml.
- Preparare due ulteriori tubi da 1,5 ml e pipettare 500 μl di DMEM (non integrato con FBS) in ogni tubo.
NOTA: Il primo tubo di DMEM verrà utilizzato per raccogliere le secrezioni tumorali e il secondo tubo di DMEM servirà come un controllo accoppiato. Le secrezioni possono essere raccolte in DMEM, qualsiasi altro mezzo di coltura tipico nonIntegrato con siero o PBS. - Mettere uno dei tubi contenenti DMEM su una scala digitale calibrata. Tare la bilancia, in modo tale che quando il tubo si siede in cima alla scala, legge 0 mg.
- Rimuovere il tubo di DMEM dalla scala, posizionare il pezzo di campione indicato per la raccolta delle secrezioni nel tubo e pesarlo. Si noti il risultato, che rappresenterà il peso del tessuto da solo.
- Sotto un cappuccio di flusso laminare, regolare il volume di DMEM nel tubo a 100 μL per 10 mg di campione.
- Posizionare il tubo contenente il campione di tessuto e il suo controllo corrispondente (solo DMEM) nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 ) per un periodo coerente con i piani per questo esperimento. Incubare il tessuto per almeno 72 h per raccogliere quantità biologicamente utili di secrezioni tumorali o nervose 15 .
- Giorno 4
- Dopo l'incubazione per 72 h, rimuovere il mezzo contenente la secrezione dalCampione ( vale a dire, media mediamente tessuto) usando una pipetta da 1 ml. Per evitare cicli di congelamento e disgelo ripetuti, aliquotare il mezzo in nuovi tubi secondo le analisi a valle pianificate (per esempio, per eseguire un ELISA con 4 pozzetti che richiedono 50 μL ciascuno, possono essere preparate aliquote di 210 μL).
- Se necessario, congelare il pezzo di tessuto rimasto nel tubo originale (già etichettato il giorno 1) a -80 ° C per ulteriori analisi, come l'estrazione del DNA, in una data successiva.
- Conservare il tessuto, le secrezioni e il controllo DMEM in un congelatore da -80 ° C fino a quando le applicazioni a valle non vengono avviate ( es. ELISA, LC-MS / MS, matrici di citochine, ecc .).
4. Estrazione di proteine da tessuto VS o GAN
- Preparazione del tampone RIPA fortificato
- Aggiungere una compressa di inibitore della fosfatasi e una compressa di inibitori della proteasi a 10 mL di tampone RIPA in un tubo da 15 mL; Questo è fortificatoBuffer RIPA.
NOTA: conservare il tampone RIPA a 4 ° C e aggiungere le compresse appena prima dell'uso.
- Aggiungere una compressa di inibitore della fosfatasi e una compressa di inibitori della proteasi a 10 mL di tampone RIPA in un tubo da 15 mL; Questo è fortificatoBuffer RIPA.
- Estrazione della proteina
- Trasferire 210 μL di tampone RIPA fortificato (punto 4.1.1) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
- Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), trasferire il piccolo pezzo di tessuto designato per l'estrazione proteica (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) al tubo contenente tampone RIPA e metterlo su ghiaccio Per almeno 10 min. Se studiando forme fosforilate di proteine, aggiungere il tampone RIPA con inibitori della proteasi e della fosfatasi 14 . Nel frattempo, i passi per altri componenti della lavorazione del tessuto, come la fissazione (sezione 7), possono essere eseguiti.
- Pre-raffreddare la centrifuga a 4 ° C.
- Utilizzando un pestello di plastica, omogeneizzare il tessuto nel tubo contenente tampone RIPA. Sonicare il tessuto per 10-15 s con ampiezza del 20%. Assicurarsi che il campioneRimane sul ghiaccio, anche durante la sonicazione.
- Centrifugare per 10 minuti a 15.000 xg e 4 ° C.
- Aliquota il supernatante in incrementi di 50 μL in nuovi tubi da 0.5 mL (a seconda delle applicazioni a valle desiderate, è possibile scegliere qualsiasi dimensione di incremento).
- Conservare le aliquote di proteina lisata in un congelatore da -80 ° C fino a quando le applicazioni a valle non vengono avviate ( es. ELISA o blots occidentali) 20 , 21 .
5. Cultura primaria di VS umana
- Giorno 1
- Separare il tessuto VS indicato per la coltura cellulare (che è stato seduto nel supporto di coltura, come descritto al punto 1.2.6) in circa 1 mm 3 pezzi utilizzando una coppia di pinze in ogni mano.
- Aspirare il mezzo contenente il tumore con una pipetta da 10 ml di siero e trasferire tutto il contenuto in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare per 3 minuti a1.000 xg e 25 ° C.
- Preparare il terreno di disintegrazione in un nuovo piatto di coltura da 60 mm combinando 4,7 ml di supposto DMEM / F-12 con 250 μl di collagenasi (concentrazione finale: 160 U / ml) e 50 μL di ialuronidasi (concentrazione finale: 250 U / ml) , Per un volume finale di 5 ml.
NOTA: Entrambi gli enzimi devono essere conservati in un congelatore da -20 ° C ma scongelati prima della preparazione di questo supporto (punto 1.2.2). - Dopo la centrifugazione, i pezzi del tumore formano un pellet nella parte inferiore del tubo conico. Pipettare con attenzione e scartare il surnatante.
- Aggiungere 2 ml del mezzo di disintegrazione contenente enzimi freschi (fase 5.1.4) al pellet tumorale. Pipette su e giù diverse volte per mobilitare il tessuto e trasferire il tumore contenente il mezzo al piatto di coltura da 60 mm.
- Posizionare il piatto di coltura nell'incubatore (37 ° C, 5% CO 2 ) per 18 h.
- Giorno 2
- Caldo DMEM / F-12, integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina (preparato al punto 1.1) in un bagno d'acqua di 37 ° C.
- Rimuovere il piatto di Petri contenente la coltura VS dall'incubatrice (passo 5.1.7). Usando un ago da 22 G attaccato ad una siringa da 6 ml, aspirare il mezzo contenente la coltura e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare per 5 min a 1.000 xg e 37 ° C.
- Nel frattempo, utilizzare pinze sterili per inserire il numero di copertine di vetro in poli-D-lisina e lamina rivestiti in una piastra di coltura da 24 pozzetti.
NOTA: il numero di pozzetti da coltivare dipende dalla dimensione del campione; Circa 24-32 pozzetti possono essere coltivati da un tumore di 1 cm 3 , quindi per la maggior parte dei tumori più piccoli, è opportuno progettare 8-16 pozzetti di cellule colte. - Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante ( cioè il mezzo arricchito di enzima) e risospendere il pellet di cellule residui in mezzo fresco e complemento di DMEM / F-12, pre-caldoNel punto 5.2.1.
NOTA: Il volume in cui risospendere il pellet è determinato dal numero di pozzetti previsti nella fase 5.2.4, stimando 1 ml di mezzo per pozzetto previsto. - Aspirare 2 ml del mezzo di cellule risospese (fase 5.2.5) usando una pipetta da 5 ml. Depositare 1 ml del mezzo contenente la cellula tumorale in ogni pozzetto preparato della piastra a 24 pozzetti.
- Continuare l'aspirazione e il deposito di terreno contenente cellule tumorali (aspirazione in incrementi di 2 mL, da cui 1 mL viene depositato in ogni pozzetto previsto) fino a quando la sospensione della cellula tumorale è equamente suddivisa tra tutti i pozzetti preparati.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 ° C durante la notte.
- Giorno 3
- Se sul fondo dei pozzetti sono notati detriti significativi, cambiare attentamente il mezzo in ciascun pozzetto nel nuovo supporto di coltura DMEM / F-12 integrato, facendo attenzione a non dispiegare le cellule aderenti. In caso contrario, riportare la piastra all'incubatore e cambiare la tE per la prima volta il 5 ° giorno.
- Giorni 5-7 e successivamente
- Cambiare il supporto ogni 3 giorni.
NOTA: Le cellule VS e GAN umane primarie sono generalmente mantenute in coltura fino al loro utilizzo nelle applicazioni a valle, a circa 14 giorni di età. La purezza della cultura diminuisce dopo questo 19 .
- Cambiare il supporto ogni 3 giorni.
6. Cultura primaria di GAN umana
- Giorno 1
- Sotto un microscopio di dissezione, isolare i fascicoli dal tessuto designato per la cultura GAN (che è stata seduta in terreno di coltura, come descritto nel punto 1.2.6).
- Isolare i fascicoli dall'epineurium e dalla guaina fibrosa tirando sul perineuro usando no. 5 pinze mentre si aggrappa l'epineurium con no. 3 pinze.
- Una volta che i fascicoli sono sufficientemente isolati dall'epineurio circostante, trasferirli in un nuovo piatto di coltura contenente 2 ml di supMedio.
- Tagliare i fascicoli in segmenti da 1 a 2 mm utilizzando la lama del bisturi.
- Pipettate i piccoli pezzi di fascia e il mezzo circostante in un tubo da 15 ml contenente 3 ml di terreno di coltura fresco supplementare, in modo tale che il volume totale nel tubo da 15 ml diventa 5 ml.
- Centrifugare il campione per 3 minuti a 1.000 xg e 25 ° C.
- Nel frattempo, creare un mezzo di coltura di cellule Schwann in un nuovo piatto da 60 mm di Petri combinando 4,7 ml di supposto DMEM / F-12, 250 μl di collagenasi e 50 μL di ialuronidasi, per un volume finale di 5 ml.
NOTA: conservare entrambi gli enzimi a -20 ° C; Scongelarli a temperatura ambiente prima di preparare questo mezzo (punto 1.2.2). - Dopo la centrifugazione del campione, i fascicoli si condenseranno in un piccolo pallone nel tubo conico. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 2 ml del mezzo di disintegrazione contenente enzimi freschi (fase 6.1.6) al pellet nervoso. Pipetta e dPossiedono diverse volte per mobilitare il tessuto e trasferirlo in un nuovo piatto di coltura da 60 mm.
- Portare il piatto nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 ) per 20-22 h.
NOTA: questa è un'incubazione più lunga di quella necessaria per i campioni VS (passo 5.1.7).
- Sotto un microscopio di dissezione, isolare i fascicoli dal tessuto designato per la cultura GAN (che è stata seduta in terreno di coltura, come descritto nel punto 1.2.6).
- Giorno 2
- Supporto caldo DMEM / F-12 in un bagno d'acqua di 37 ° C.
- Usando un ago da 22 G attaccato ad una siringa da 6 ml, aspirare il mezzo contenente la coltura cellulare e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare per 5 min a 1.000 xg e 37 ° C.
- Scartare il surnatante e risospendere il campione in un nuovo mezzo di coltura DMEM / F-12 integrato, pre-riscaldato.
- Utilizzare pinze sterili per inserire il numero di copertine rivestite nel pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti.
NOTA: il calcolo di due pozzetti di cellule colte per un campione di nervo da 1 cm promuove una crescita culturale robusta. - Aggiungere 1 ml del mezzo contenente la coltura a ciascunoBen indicato nella piastra a 24 pozzetti.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 .
- Giorno 3
- Se i pozzetti sono rilevati nei pozzetti, sostituire attentamente il mezzo con un nuovo supporto di coltura DMEM / F-12, facendo attenzione a non dispiegare le cellule aderenti. In caso contrario, riportare la piastra all'incubatore e cambiare il mezzo per la prima volta il giorno 5.
- Giorni 5-7 e successivamente
- Cambiare il supporto ogni 3 giorni.
7. Fissazione del tessuto VS & GAN
- Pipettare 1-1,2 ml di 4% di paraformaldeide (PFA, ATTENZIONE) in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Dopo aver lavato il tumore o il nervo con PBS (punto 1.2.3), trasferire un piccolo pezzo di tessuto (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) in 4% PFA e mettere il tubo su un agitatore a 4 ° C. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso in tLui soluzione.
- Dopo almeno 2 ore di fissazione, prelevare il tubo dallo scuotitore e procedere con ulteriore lavorazione ( ad es. Incorporazione in paraffina o composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) per la successiva immunohistochemistry o immunofluorescenza) 22 , 23 , 24 . In alternativa, il tessuto può essere congelato, come descritto in precedenza 25 , 26 .
8. Raccolta e conservazione della perilemia umana durante la resezione VS Translabyrinthine
- Collocare tre tubi sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
NOTA: Un tubo sarà conservato come sostegno in caso di contaminazione. - Riempire un tubo da 1,5 ml con circa 1,2 ml di soluzione PBS che è stato filtrato due volte utilizzando un filtro da 0,22 μm.
NOTA: per raccogliere perilymph durante una resezione VS translabellina, il chirurgo deve prima assicurare che il surgiIl campo di calcio è privo di polvere ossea, sangue o salina. Il chirurgo può utilizzare un tubo di aspirazione Schuknecht 21 o 24 G nella mano non dominante per questo scopo.
Un luogo tipico da cui estrarre perilymph è il canale semicircolare laterale (tuttavia, è possibile accedere anche al canale semicircolare posteriore oa una finestra rotonda, a seconda della preferenza del chirurgo). Il chirurgo deve rimuovere accuratamente l'osso labirintico con un burbero diamantato (utilizzando l'irrigazione continua di aspirazione) per identificare la linea blu ( cioè il labirinto membrano) del canale semicircolare. Il canale semicircolare viene penetrato attraverso la linea blu usando un ago lungo 27 G attaccato ad una siringa tubercolina da 1 ml. - Chiedere al chirurgo di aspirare delicatamente una piccola quantità di perilymph e poi passare la siringa e l'ago allegato all'infermiera chirurgica.
NOTA: In genere, viene raccolta una goccia di perilymph o meno. Se il volume osservato è maggiore, il campione è probabilmente contaminato con altri fLUID. - Aprire il tubo di 1,5 ml preparato e il tubo riempito con PBS direttamente prima dell'uso. Fare attenzione a non toccare l'interno dei coperchi del tubo durante l'apertura.
- Ricevere la siringa e l'ago collegato dall'infermiera chirurgica e spazzare completamente il fluido nel tubo vuoto, facendo attenzione a non toccare il tubo stesso con l'ago.
- Staccare con cura l'ago dalla siringa. Non contaminare la punta dell'ago e continuare a tenerla in una sola mano.
NOTA: È stato raccolto un piccolo volume di perilemia, per cui alcuni liquidi possono rimanere nella punta lunga dell'ago. - Con l'altro, utilizzare la siringa stessa (senza ago) per succhiare 0,2 mL di soluzione filtrata PBS dal tubo preparato nel corpo della siringa.
- Ricollegare l'ago alla siringa. Completa l'evacuazione della siringa nel tubo contenente perilymph, utilizzando il PBS sterile per sciacquare la punta dell'ago.
- Chiudere il tubo contenente perilymph e PBS Su ghiaccio.
- Smaltire l'ago in un contenitore di scalpelli.
- Posizionare il tubo contenente perilymph nel congelatore -80 ° C il più presto possibile.
9. Raccolta e conservazione del CSF umano
- Posizionare tre (o più) tubi sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
NOTA: Un tubo sarà un backup in caso di contaminazione o un volume di campione che è più grande del previsto. - Dopo aver aperto il duro mater, chiedere al chirurgo di raccogliere CSF con una siringa da 3 ml (senza ago attaccato).
NOTA: Per evitare la contaminazione, la raccolta CSF dovrebbe avvenire immediatamente dopo l'apertura del dura mater. - Chiedere al chirurgo di consegnare la siringa all'infermiera chirurgica.
- Ricevere la siringa dall'infermiera chirurgica e completamente evacuare il volume richiesto di CSF nel tubo.
- Chiudere i tubi e posizionarli sul ghiaccio.
- Posizionare il tubo (i) nel congelatore -80 ° C il più presto possibile.
- Utilizzando la concentrazione delle concentrazioni virali come riferimento, calcolare il numero di conteggio del genoma desiderato (gc) e la molteplicità di infezione (MOI) necessari per l'esperimento proposto di trasduzione; Lo stock di virus può essere diluito direttamente nel mezzo di coltura integrato.
NOTA: può essere utilizzato qualsiasi vettore virale adatto alla trasduzione cellulare primaria; Vedere Landegger et al. (2017) per un confronto dettagliato di sei diversi serotipi virus adeno-associati 27 . Inoltre, quando si coltivano le cellule umane primarie, i conteggi di cellule non vengono tipicamente determinati prima di plasmare su copertine. Le cellule VS primarie non rispondono bene alla tripsinizzazione e al passaggio, quindi per un calcolo affidabile MOI, il numero di cellule aderenti per pozzo può essere stimato utilizzando un microscopio a contrasto di fase. In alternativa, se le cellule sono vicine alla confluenza, i loro numeri possono essere stimati in modo affidabile utilizzando i valori standard di densità delle cellule perUna piastra a 24 pozzetti ( ad esempio, 5 x 10 4 cellule per pozzetto). - Sotto un cappuccio di flusso laminare, preparare il supporto integrato contenente la quantità desiderata di virus in un tubo di laboratorio conico da 15 ml, in modo tale che 1 ml di mezzo contenente virus venga preparato per ciascun pozzetto delle cellule da trasduzione. Pipettare il mezzo contenente virus in su e in basso per mescolare delicatamente ma completamente.
- Utilizzando pinze sterili, trasferire le copertine contenenti le cellule VS primarie (passo 5.2.8) dalla piastra originale a 24 pozzetti a una nuova piastra a 24 pozzetti. Dopo il trasferimento di ciascuna copertina individuale, aggiungere 1 ml di mezzo contenente virus. Girare la piastra ogni volta che si aggiunge un mezzo per assicurare che le cellule siano uniformemente rivestite con il virus.
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per la durata dell'esperimento previsto.
NOTA: le incubazioni che vanno da 48 a 120 h hanno mostrato risultati promettenti di trasduzione 27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le cellule VS umane primarie nella cultura, come stabilito nella sezione 5, possono essere trattate come modelli informativi per i processi associati alle malattie in molte applicazioni di ricerca a valle ( Figura 1 ). Le cellule Schwann sane coltivate nella sezione 6 forniscono un punto di confronto diretto e istruttivo. Come descritto di seguito, i dati estesi dei VS e dei GAN elaborati in base a questo quadro metodologico unificato sono disponibili in più articoli precedentemente pubblicati 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .
Il successo della trasduzione di cellule VS primarie con virus adeno-associati per la terapia genica è qui presentato per la prima volta ( Figura 2 ). Le cellule VS primarie sono state trasdurate nella cultura w Ith G80 che esprime Anc80, un antenato predetto dei virus adeno-associati 28 . Anc80 è stato dimostrato di essere un vettore ottimale per il trasferimento di gene nei tessuti cochleari murini in vitro e in vivo 27 . L'efficace trasduzione di cellule umane primarie con questo vettore porta importanti implicazioni per futuri tentativi di terapia genica per VS.
Figura 1: Immagini in campo luminoso delle colture primarie di Schwannoma Vestibolare umana.
È possibile identificare modelli tipici nell'organizzazione delle cellule VS nella cultura. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
Figura 2: Immagine rappresentativa immunofluorescenti delle colture primarie di Schwannoma Vestibulare umana dopo esposizione a GHF-esprimendo Anc80 per 48 h ad una molteplicità di infezione (MOI) di 250.000.
Verde = GFP; Rosso = phalloidin / F-actin (macchie il citoscheletro); Blu = DAPI (macchia il nucleo). Barre di scala = 50 μm (A) e 100 μm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo manoscritto descrive un quadro metodologico unificato per la ricerca VS, che descrive la lavorazione simultanea di esemplari di VS e GAN umani per applicazioni di ricerca a valle. Poiché la ricerca VS entra nell'epoca della medicina di precisione, preparando lo stesso campione in forme in grado di rispondere a numerose domande di ricerca, consentirà la scoperta di visioni molecolari, cellulari, genetiche e proteomiche specifiche per singoli pazienti.
La purezza della cellula umana di Schwann e delle colture VS sono state accuratamente valutate nel tempo attraverso l'immunocitochimica, utilizzando il rapporto tra le cellule positive per il marker S100 a quelle positive per la macchia nucleare DAPI 19 . Di conseguenza, si raccomanda di eseguire esperimenti sulle colture primarie di cellule Schwann umane entro le prime due settimane dopo la placcatura delle cellule, in quanto la purezza di queste cellule è la più alta durante questo periodo; In seguito, le cellule fibroblastiche iniziano a dominare. TuLe colture di cellule VS a VS sono inoltre massime pura a due settimane in coltura, le cellule VS non hanno inibizione di contatto e continueranno a proliferare nelle fasi successive. Inoltre, un confronto diretto di microarray di espressione di proteine dal tessuto VS (sezione 4) e cellule VS in coltura dagli stessi tumori (sezione 5) ha dimostrato con successo che le colture VS dimostrano un livello soddisfacente e elevato di somiglianza biologica con i rispettivi tumori genitori 19 . La quantificazione di successo delle proteine di interesse può essere effettuata mediante Western blot di lisati proteici generati nella sezione 4 e la quantificazione di trascrizioni RNA tramite qRT-PCR di RNA estratta da tessuti conservati con soluzione di stabilizzazione RNA (sezione 2) 12 , 13 , 14 .
Le cellule VS e GAN in coltura possono essere esposte a sostanze chimicamente attive, come ad esempio farmaci antiinfiammatori non steroidei,L RNA interferenti (siRNA) o composti organici naturali per chiarire meccanismi molecolari specifici della malattia o per testare un bersaglio terapeutico 13 , 14 , 29 . I composti di interesse possono essere aggiunti direttamente alle cellule in coltura dopo adeguate diluizioni in un normale mezzo di coltura supplementare. Per valutare l'effetto di tali sostanze su aspetti importanti della fisiologia cellulare, l'etichettatura di bromodeossiridina (BrdU) per la proliferazione, l'etichettatura terminale di nick-terminazione del deoxynucleotidil transferasi terminale (TUNEL) per l'apoptosi e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) La riduzione di 2,5-difeniltetrazolium bromuro (MTT) per la vitalità metabolica sono analisi affidabili che possono essere utilizzate con sicurezza su queste cellule 19 . Il mezzo di coltura da cellule trattate può anche essere aspirato con cura, conservato a -20 ° C e testato per quantificare i livelli relativi di sostanze secrete, come la prostaglandina E2, la cui secrezione cUn essere influenzato dal trattamento farmacologico 13 . Inoltre, la fissazione dei tessuti (sezione 7) e successiva incorporazione in OCT o paraffina fornisce un substrato robusto per i test di immunofluorescenza 13 , 14 .
Il terreno tumorale o nervo-condizionato generato nella sezione 3 fornisce un modo semplice ed efficace per valutare le molecole solubili secreto da VS e per estrarre le vescicole extracellulare. Le sequenze di citochine o ELISA possono essere eseguite su queste secrezioni, come indicato nei protocolli dei produttori, descritti in due studi pubblicati 9 , 12 . Le vescicole extracellulari possono essere purificate da queste secrezioni usando ultracentrifugazione, come descritto in una precedente pubblicazione 30 . In alternativa, le sezioni possono essere utilizzate come reattivi specifici per pazienti per applicazioni di ricerca a valle. Ad esempio, in un esperimento che si manifestaSono state raccolte le secrezioni dal tessuto VS di pazienti con malattie uditive e pazienti affetti da VS con buona udienza dopo l'incubazione in DMEM per 72 ore (sezione 3). Queste secrezioni tumorali sono state quindi applicate a esplorazioni cochleari murine e si è rivelato che le secrezioni tumorali provenienti da pazienti con insufficienza cardiaca causavano un maggior danno agli esplosivi cochleari rispetto alle secrezioni dei pazienti VS con buona udienza 15 . Importante, le secrezioni raccolte in punti di tempo prima di 72 h non hanno provocato danni sostanziali.
La perilemia umana raccolta da pazienti sottoposti a resezione translabellinale VS (sezione 8) rappresenta un nuovo avvincente percorso per la scoperta di biomarcatori VS. I campioni raccolti secondo la sezione 8 sono stati analizzati mediante spettrometria di massa cromatografica-tandema (LC-MS / MS) per mappare il proteome della perilemia umana e 15 biomarker candidati di VS sono statiDentificato 31 . Un'analisi simile potrebbe essere possibile utilizzando CSF umani raccolti da pazienti con VS (sezione 9).
Una considerazione significativa nella ricerca VS è la selezione di un appropriato tessuto di controllo. Precedenti studi hanno utilizzato il nervo cocleare, il nervo vestibolare e nervi periferici non correlati (come il nervo sciatico), all'effetto variabile 22 , 32 . Tuttavia, diverse ragioni portano al sostegno dell'utilizzo dei GAN come controlli pertinenti pertinenti 15 . Simile al nervo vestibolare, il GAN è un nervo periferico e sensoriale con assoni protetti dalle cellule Schwann. Importante, una ricerca di letteratura rivela che gli schwannomi non sono mai stati trovati a svilupparsi dal GAN, rendendo improbabili i cambiamenti neoplastici in questo tessuto. Inoltre, i GAN vengono sacrificati regolarmente quando si accede a strutture del collo più profondo, consentendo ai ricercatori ospedalieri di accedere facilmente alla saluteY esemplari durante le dissezioni del collo e le parotidectomie. Sebbene il nervo cocleare sia spesso sacrificato durante la chirurgia della VS e può essere facilmente disponibile, la sua prossimità ai nervi vestibolari rischia di condividere lo stesso microambiente, che può dimostrare cambiamenti molecolari pre-tumorali 33 . Altri laboratori hanno anche utilizzato con successo i GAN come un controllo adeguato per la ricerca VS e si raccomanda di continuare questa pratica 20 , 21 , 22 , 34 .
Un punto critico, ma spesso trascurato nei protocolli di coltura specifici di tipo cellulare (sezioni 5 e 6) è la corretta rimozione di tessuti e vasi sanguigni non vitali. La rimozione di questi tessuti non tumorali è fondamentale per generare colture robuste di massima purezza. Inoltre, quando piastra il mezzo di coltura contenente cellule sui coperchi, è importantePrestare molta attenzione alla quantità di tessuto trasferito ad ogni pozzo. Il raggiungimento di una distribuzione uniforme e leggermente densa di cellule contenenti alcuni "pezzi" di tessuto più densa in ciascun pozzetto è particolarmente importante per le cellule Schwann, che richiedono un numero sufficiente di cellule aderenti per prosperare. Il rivestimento delle copertine con poli-D-lisina e laminina consente anche l'efficiente crescita delle cellule. Le cellule si proliferano più robuste quando le copertine sono rivestite in laboratorio rispetto ai prodotti pre-rivestiti in commercio.
Per garantire una proteina di alta qualità e l'estrazione di RNA, verificare che il tessuto rimanga a temperature inferiori a 4 ° C nelle sezioni 2 e 4. Inoltre, poiché la letteratura relativa all'analisi delle secrezioni VS è scarsa (sezione 3), potrebbero richiedere nuovi progetti Ulteriori innovazioni e diverse lunghezze di incubazione.
Poiché i metodi per affrontare la pathobiologia VS continuano ad avanzare, l'uso di questo strUna combinazione di tecniche fondamentali che consentirà di raccogliere la quantità massima di informazioni da un singolo campione umano. L'elaborazione simultanea informata dei tessuti VS e GAN si dimostrerà integrale alla generazione di terapie farmacologiche e genetiche efficaci contro questo tumore debilitante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (sostenendo JES e SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) , La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS), il Centro di ricerca del tinnito di Lauer (KMS) e la Fondazione Barnes (KMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S.
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P.
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L.
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al.
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al.
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
