Summary
Evnen til at præcist afsløre udskrifter eller proteiner i Drosophila væv er kritisk for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen. Her er beskrivelsen af en ligetil procedure at dissekere puppe vinger. Disse vinger kan bruges som prøver i flere teknikker (immunhistokemi, PCR assay, osv.).
Abstract
Wing udvikling i Drosophila melanogaster er en ideel model for at studere morfogenese på væv plan. Disse vedhæng udvikle sig fra en gruppe af celler opkaldt wing fantasiens diske dannet under fosterudviklingen. Larve faser vokse af fantasiens diske, øge antallet af celler og danner monolayered epitelial strukturer. Inde i puppe sagen, de imaginære diske bud ud og fold i dobbeltlag langs en linje, der bliver den fremtidige margin af vingen. Under denne proces stammer de langsgående primodia vener vene celler på de potentielle dorsal og ventral overflader af vingen. Den puppe på stadiet kommunikere striber af vene celler af hver overflade for at generere stramme rør; på samme tid begynde cross-vener deres dannelse.
Ved hjælp af passende molekylære markører er det muligt at identificere de vigtigste elementer, komponere fløjen under dets udvikling. Af denne grund er evne til præcist afsløre udskrifter eller proteiner i denne struktur afgørende for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen af vingen.
Proceduren beskrevet her fokuserer på manipulere puppe vinger, giver detaljerede instruktioner om hvordan man kan dissekere fløjen under den puppe stadie. Dissektion af puppe væv er mere vanskeligt at udføre end deres kolleger i tredje instar larver. Dette er grunden til, at denne tilgang blev udviklet, for at få hurtig og effektiv høj kvalitet prøver. Informationer til immunostain og mount disse fløj prøverne, tillade visualisering af proteiner eller celle komponenter, er fastsat i protokollen. Med lidt ekspertise er det muligt at indsamle 8-10 høj kvalitet puppe vinger i en kort tid.
Introduction
Drosophila vinger er udviklet fra wing fantasiens diske. Primordial af disse fløj diske er sat til side under fosterudviklingen som små grupper af 20-30 fantasiens celler, der invaginate fra embryonale epitel. Mens larver vokser til tredje instar fase, forekommer mitose i de imaginære celler på bestemte karakteristiske tidspunkter at hæve sine tal (ca 50000 celler) og danner fløjen disc1,2,3, 4. Da cellerne formere sig, mode de en rørformet epitel, hvilket resulterer i en selvstændig folde kompakte spiral. Under pupation, disc epitel teleskoper ud til form to-lags fløj og de langsgående vener starte som lakuner mellem dem, der forekommer to gange i løbet af wing udviklingsmæssige5,6.
Arrangement af årer altid har en identisk mønster; evne til nemt at identificere hver ændring i venerne dannelse gør mutationer meget synligt (f.eks. manglende eller ekstra årer, ændringer i vene holdninger osv.). Interessant, er fænotype variationer normalt beviser af mutationer i kendte eller nye komponenter af signalering veje, der er relevante for wing udvikling. En af de veje, der spiller en rolle i positioneringen og vedligeholde vene og intervein områder er pindsvin (Hh) vej6,7,8.
Betragtning af betydningen af den puppe fløj som en modelsystem, vil det være vigtigt at få god kvalitet prøver at arbejde med. I fortiden, har forskere, der har publiceret protokoller for at dissekere Drosophila vinger ikke givet en passende vejledning til at opnå brugbare prøver. Uden vejledning af en forsker visualisere ikke et klart processen. I disse alternative dissekere tilgange er puppe delt i to, adskille fløjen fra omkringliggende væv og gentagne gange vaskes for at fjerne snavs. Denne form for tilgang hævder at forlade den fløj gratis forurener, men på grund af tidligere erfaringer processen er langsommere, og der er en højere chance for at gå på kompromis struktur af skrøbelige vinger9.
Proceduren beskrevet her blev udviklet af kravet om at finde en hurtig og effektiv metode til at få puppe wing prøver egnet til at påvise bestemte proteiner eller udskrifter ved hjælp af immunodetection protokoller eller polymerase kædereaktion (PCR) assays. For at illustrere dette, udtryk og lokalisering af Patched (Ptc eller den kanoniske receptor af Hh pathway) er fundet i puppe wing prøver, giver en protokol, der indeholder relevante oplysninger til at gennemføre den komplette procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. indsamling og dyrkning pupper.
- Fjerne 0 h efter puparium dannelse (APF) eller prepupae ved hjælp af en våd pensel fra kulturperler hætteglas og placere dem i nye hætteglas til næsten komplet udvikling periode (Se 2.1 og 2.2).
Bemærk: En sund befolkning af fluer bør opretholdes ved hjælp af standard dyrkningsbaserede protokoller. Efter tre eller fire dage, hvor æggene er lagt, kan voksne fjernes fra hætteglas til at give mulighed for en optimal udvikling af personerne. De bevares ved en konstant temperatur, indtil de tredje instar larver indlede pupation. Larver/puppe overgangen er kendetegnet ved dannelsen af prepupa betragtes som 0 h APF. Prepupa er en immobile hvide larver, der har en aflang, runde form med udstående forreste Spirakler.
Dag 2
2. overførsel, dissektion og fiksering.
- Overføre pupper (2 h før udviklingstiden er komplet) med en pensel til objektglas med dobbeltklæbende tape overholdt den. Placer pupper til at danne en række med dorsal sider op og cephalic ender vender i samme retning.
- Tilbage til objektglas til konstant temperatur og tillade pupper til at fuldføre den relevante udviklingsmæssige tid (dvs. 24-30 h APF).
Bemærk: Objektglas med dobbeltklæbende tape vil være en forbigående dissektion platform til at fjerne den puppe sag (se nedenfor). Tid bortfalder på objektglas (udenfor hætteglas) hjælper med at tørre puppe sagen gør det let knuses med pincet. - Fjern laag fra puppe tilfældet med pincet.
- Bryde tilfældet med pincet (som vist i videoen) gør en linje langs siden af puppe til caudale slutningen af det. Med de passende belysning er det muligt at opdage den indre form af puppe gør tydeligt en plads lige over hængslet den puppe fløj. Dette rum fungerer som en guide til at udføre åbningen uden at beskadige puppe.
- Fjerne dele af sagen, afhente dem ved grænsen åbnet og transporterer dem til den modsatte side, hvor den dobbeltklæbende tape vil holde dem. I slutningen af dissektion bliver af pupper næsten "nøgen", kun et lille stykke af sagen vil være der dækker den bageste spids.
Bemærk: Formålet med forlader en lille mængde af tilfælde i den øvre caudale ende er at sikre en glat overgang fra tilfældet i diaset med dobbeltklæbende tape. Ræsonnementet bag dette tiltag er fordi hvis du fjerner for meget af sagen du høj grad risikere at ødelægge puppe. På den anden side hvis du fjerner alt for lidt, kommer puppe nemt ikke fri for sagen. - Skubbe (med pincet) resten af sagen. Denne bevægelse vil hæve den forreste ende af puppe, giver mulighed for både hoved og thorax at bo i en fortrinsstilling til at overholde og overføres i de efterfølgende trin.
- Tage et nyt dias med dobbeltklæbende tape og vend det på den puppe eller pupper række. Vi anbefaler, udfører denne tilgang ved at observere bevægelser ved hjælp af stereomikroskopet at forhindre brud på pupper.
- Tryk på lidt for at gøre pupper stick på båndet og forsigtigt glide diaset for at fjerne pupper fra resten af sagerne. Vend objektglas: pupper vil blive hængende på den dorsale side på niveau med deres hoved / thorax område.
- Dække alle de nøgne pupper med 4% PARAFORMALDEHYD og vente 10 min. Vores erfaring hjælper denne bortfalder tid med fiksativ ændre konsistens af neglebånd gør det faste, mindre klæbrig og nem at håndtere.
Bemærk: For at udføre ribonukleinsyre (RNA) udvinding, stedfortræder PARAFORMALDEHYD for fosfatbufferet saltopløsning (PBS) lavet med RNase gratis vand og fjerne de puppe vinger at gøre et snit (med hjælp af saks) nær hængsel punkt af hver vedhæng. Brug af pincet, overføre den puppe fløj til et microcentrifuge rør med 1 mL guanidinium kaliumthiocyanat og phenol reagens. Efter indsamling ialt 50-80 vinger, skal du gemme microcentrifuge rør ved-80 ° C indtil udfører RNA udvinding10,11. - Gør et lille snit på hængslet regionen af fløjen eller i nærheden af den. Tillad fiksativ at nå wing epitel. Ved hjælp af en pipette (p200) flugter Fikseringsvæske over vingen. Når rødmen Erstat fiksere den forurenede med nye. Efter skylning, holde fløj i fiksativ i 5 min.
Bemærk: Selv om denne manøvre hjælper med at rydde væk fleste af kontaminerende væv, nogle hemocytes og fedt dråber kan blive fanget mellem fløjen dorsal og ventral epitel lag (Se figur 1A). - Rive med pincet fra neglebånd grænser (som vist i videoen) udvide hullet og muliggør frigivelse af wing epitel fra neglebånd sac. Når fløj væv er frigivet, forlade det i PARAFORMALDEHYD løsning til komplet 30 min af fiksering.
- Overføre de faste vinger til en 4-vældede plastik fad fyldt med PBST (Triton X-100 0,05%). Butik natten over ved 4 ° C.
Dag 3
3. primære antistof inkubation.
- Permeabilize vævet inkubere puppe vingerne i PBST (Triton X-100 0,2%) i 15 min. ved hjælp af et rockende platform til at lette en blid flydende medium bevægelse.
Bemærk: Før montering af prøverne, skal trin udføres ved hjælp af et rockende platform. - Blokere prøver ved hjælp af PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) i 1 time.
- Brug den samme buffer til at fortynde det primære antistof (musen anti-Ptc, 1: 100) og Inkuber de puppe vinger natten over ved 4 ° C.
Dag 4
4. sekundær antistof inkubation.
- Vask prøver 4 x 10 min hver med PBST (Triton X-100 0,05%)
- Inkuber med sekundær antistof (f.eks.anti-mus konjugeret med fluorokrom) fortyndes til passende koncentration i PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) ved stuetemperatur i mørke, i 2 timer.
Bemærk: Hvis det er hensigtsmæssigt, bruge 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og/eller phalloidin til at counterstain væv. Tilføje disse sonder med sekundær antistof under hensyntagen til emission bølgelængden af fluorokromer til at forhindre overlapning af signaler. - Vask prøver 4 x 10 min hver med PBST (Triton X-100 0,05%)
5. montering
- Forberede et eksempeldias ved at placere 4 prikker af gennemsigtigt neglelak på objektglas, som om de var vertices i en firkant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen tilbyder en enkel metode til at indhente puppe wing prøver at bevarer den velkendte morfologi af vingen. Fra disse præparater er det muligt at opnå stakkevis af billeder, der kunne blive projekteret som 2D- eller 3D, at undersøge distribution og/eller tilsætning af proteiner under differentiering af vingen. En lignende protokol kan (se note i 2.9) bruges til at indsamle store puppe wing prøven (der involverer 50-80 puppe vinger) nødvendigt at syntetisere supplerende deoxyribonukleinsyre (cDNA), den skabelon, der anvendes i PCR-reaktionerne.
Figur 1 : Pindsvin pathway gen i Drosophila puppe vinger
(A) lappet, de kanoniske receptor af pindsvin pathway, blev visualiseret på 24-30 h APF ved hjælp af musen anti - Ptc. kerner var counterstained med DAPI boer actin filamenter er visualiseret ved hjælp af en grøn-fluorescerende phalloidin. Aktin distribution hjælper med at lokalisere wing vener og dets relation med lappet udtryk. På samme tid afslører phalloidin plet tilstedeværelsen af nogle hemocytes og fedt dråber (store cirkler) som forurener væv. 20 x forstørrelse, forreste er op. Skalere bar, 100 µm (B) amplikoner til aktin (lane 1, 280 bp) og ptc (lane 2, 236 bp) blev opnået ved hjælp af cDNA synthetized fra messenger RNA (mRNA) fløj prøve genereret af en lignende dissektion protokol. MW, Molekylær vægt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for dissektion beskrevet i denne video kan bruges til at forberede høj kvalitet prøver af Drosophila puppe vinger fra forskellige udviklingsfaser for mange typer af teknikker (fx immunofluorescens, cDNA syntese til PCR assays, in vitro- fløj udvikling). Med hensyn til denne metode har videnskabsmand involveret bruges 24-30 h APF. Dog bør der ingen hindring i de afgørende skridt i dissektion af yngre eller ældre puppe. Ændringer kan have til at rumme mindre fase puppe.
Protokollen kunne udføres for at dissekere en puppe eller flere pupper på samme tid. Dette medvirker til at fremskynde proceduren, hvilket gør det nemmere at nå et stort antal vinger dissekeret. I dette tilfælde er der mulighed for at fjerne en række med 4-5 pupper på samme tid. Du kan fjerne pupper sammen eller hvis det ikke er muligt, fortsætte med at fjerne individuelt i samme diaset (Se afsnit III i videoen: "Flere pupper dissektion"). For at fjerne den nøgne puppe fra de anlagde sag, er det vigtigt, at den bageste spids er lille nok. Det er muligt at fjerne sagen helt; selv om det ville gøre overførslen hurtigere, fjernelse af hele sagen udfordrende og der er en større risiko for at beskadige puppe.
Erfaring dikterer, at en vigtig manøvre at overveje at forlade (de sidste 2 h for at fuldføre den udvikling tidspunkt) puppe knyttet til objektglas i rugemaskinen men uden for hætteglasset. Denne bortfalder tid hjælper tørre sagen gør det lettere at bryde. En anden kritisk trin under dissektion for immunhistokemi, er at skalle af neglebånd, der dækker fløj epitel, dermed indrømme adgang af antistof mod hele wing overflade. Dette skridt bør ske efter fastsættelse i flere minutter (mindst 5 min efter at gøre indsnit på hængsel punkt) fordi fiksativ stabiliserer væv og ændrer neglebånd konsistens, gør det lettere at skrælle.
Mens de udfører alle Immunhistokemi trin, være sikker på at vingerne er i konstant bevægelse (rokkende platform). Bevægelsen hjælper med at forbedre udveksling og udbredelse af løsninger under vasker og inkubationer. Det er dog vigtigt at udføre dem forsigtigt undgå forekomsten af uønskede forvridninger i morfologi af denne skrøbelige struktur (dvs. det er tilstrækkeligt, at svingninger i platformen lidt flytte den flydende medium indeholdende prøver).
Denne procedure giver en alternativ og komplementær tilgang til de allerede offentliggjorte metoder til puppe wing dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke CSIC for den finansielle støtte til dette projekt, at Mariana Di Doménico for hendes teknisk bistand med konfokalmikroskopi; til José Leonardo Báez for hans manuskript korrektioner; at Luciano Correa for hans dedikation til oprettelse af video; til Natalia Rosano for udlån hendes stemme til videoen og Bloomington Drosophila Stock Center for at give bestandene anvendes i denne undersøgelse. Apa1 monoklonalt anti-Ptc udviklet af Isabel Guerrero var indhentet fra udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB) under ledelse af NICHD og vedligeholdes af The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
