Summary
Den nåværende metoden brukes til å identifisere isoformen-spesifikke hemmere av histone deacetylases (HDAC) i HeLa celler av UHPLC-MS analyse av flere underlag. Dette er et antistoff-fri metode utviklet for å gjenspeile HDAC1 og HDAC6 aktivitet i levende celle miljø, i motsetning til én-isoformen celle-fri analyser.
Abstract
Søk etter nye histone deacetylase (HDAC) hemmere er økende interesse i stoffet funnet. Isoformen selektivitet har vært i søkelyset siden godkjenning av romidepsin, en klasse jeg HDAC inhibitor for kreft terapi og kliniske undersøkelsen av HDAC6-spesifikke hemmere for myelom. Den nåværende metoden brukes til å bestemme hemmende aktiviteten til test forbindelser på HDAC1 og HDAC6 i cellene. Isoformen aktiviteten måles med ekstremt høy ytelse flytende kromatografi-massespektrometri (UHPLC-MS) analyse av bestemte underlag inkubert med behandlet og ubehandlet HeLa celler. Metoden har fordelen av reflekterer endogene HDAC aktiviteten i cellen miljøet, i motsetning til celle-fri biokjemiske analyser utført på isolerte isoformene. Videre, fordi den er basert på kvantifisering av syntetiske underlag, krever ikke metoden antistoff anerkjennelse av endogene acetylated proteiner. Det er lett tilpasses til flere linjer og en automatisert prosess. Metoden har allerede vist seg nyttig i å finne HDAC6-selektiv forbindelser i neuroblasts. Representant resultater er vist her med den standard HDAC hemmere trichostatin en (uspesifisert), MS275 (HDAC1-spesifikk), og tubastatin en (HDAC6-spesifikk) bruker HeLa celler.
Introduction
HDACs tilhører en familie av enzymer kunne deacetylate histones innen chromatin strukturen. De har andre protein underlag i stoffer og er plassert i ulike celle avdelinger. Totalt 18 HDAC isoformene funnet så langt og har vært knyttet til flere celle mekanismer, inkludert regulering av transkripsjonsfaktorer og genuttrykk, samt celle signalisering og transportere1,2,,3,,4,,5,,6,,7. HDAC katalytisk hemmere har dukket opp som potensielle terapeutiske narkotika for kreft terapi. De fleste HDAC hemmere godkjent av FDA er for behandling av T-celle lymfom og myelom, og ikke-spesifikk HDAC hemmere, som vorinostat (SAHA), belinostat og panobinostat8,9. Men en rekke bivirkninger er forbundet med pan-hemmere, og søk etter isoformen-spesifikke små molekyler er et hett tema i medisinsk kjemi og narkotika funnet. Følgelig klassen jeg (HDAC1-3 og HDAC8) selektiv hemmer romidepsin er en allerede godkjent narkotika10, mens HDAC6-spesifikke hemmere er for tiden under kliniske forsøk, med økt terapeutiske potensial i myelom11,12,13,14,15.
Screening analyser betegner HDAC er hemmere basert på inkubasjonstiden for en HDAC underlaget med en enzymatisk (enkelt isoformen, kjernefysiske ekstrakt eller celle lysate). Underlaget er vanligvis en liten peptid sekvens som inneholder en acetyl lysin rester koplet til en cleavable fluorophore (f.eks kumarin), som N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Skille mellom isoformen-spesifikke aktiviteter, separat celle-fri analyser med hver isoformen er nødvendig og kan ikke gjenspeiler den virkelige isoformen aktiviteten i levende celler. Isoformen-spesifikke substratene er kommersielt tilgjengelige, for eksempel benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 bestemt substrat) og (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic acid tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 bestemt substrat) (figur 1B). Men vil en multi substrat blanding som inneholder MAL, MOCPAC og BATCP gitt til levende celler ikke tillate påvisning av de enkelte deacetylated produktene av fluorometric måling, gitt at de bærer den samme cleavable fluorophore.
Metoden beskrevet her kan av relativ kvantifisering av hver substrat og deacetylated produktet i HeLa celler ved hjelp av en multi substrat analysen etterfulgt av UHPLC-ESI--MS-/ MS analyse17. HDAC analysen er gjennomført på HeLa cellene direkte identifikasjonen av HDAC hemmende aktivitet og spesifisitet av testen forbindelser på endogene HDACs. Det er et fokus på HDAC1 og HDAC6, som vurderes samtidig. For å oppnå disse enzymatisk målingene i en enkelt inkubasjon analysen, lagt en blanding av ikke-spesifikk og spesifikke HDAC underlag til behandlet og ubehandlet HeLa celler belagt på en 96-brønns plate. Etter en inkubasjon trinn, er celler lysed for å løslate substrater og deres respektive reaksjon produkter, som er atskilt og oppdaget med en UHPLC-MULTIPLE Sclerosis metode (figur 1 c). Deacetylated produktene av underlagene. MAL, MOCPAC og BATCP er deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) og deacetylated BATCP (dBATCP), henholdsvis. Dose-respons kurver kan bygges med aktive forbindelser.
Figur 1: generelle ordningen for cellen-basert HDAC analysen identifisere HDAC1 - og HDAC6-spesifikk hemmere av UHPLC-MS analyse av flere underlag. (A) ordningen med en typisk 96-brønns platen inneholder behandlet (test forbindelser) og ubehandlet (kontroll) HeLa celler, samt celle-ledig mellomrom. (B) kjemisk struktur av underlag lagt som en blanding (21 µM hver) til å være deacetylated av endogene HDACs. (C) typiske UHPLC-MS chromatogram viser fjelltoppene lagt substrater (MAL, MOCPAC og BATCP) og deres deacetylated produkter (dMAL, dMOCPAC, og dBACTP, henholdsvis). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur
Merk: Følgende er utført i en standard vev kultur hette. Fortrolighet med steril teknikk er forventet.
- Kultur HeLa celler til 80% confluency i en MT75 celle kultur kolbe i MEM supplert med 10% fosterets bovin serum, penicillin G (100 U/mL), og streptomycin (100 mg/mL).
Merk: Celle kultur, behandling og lyse trinnene utføres under laminær strømning, med cellen inkubasjon trinn på 37 ° C utført i et fuktet 5% CO2 under sterile forhold. - Vask cellene to ganger med 5 mL av DPBS, Sug opp DPBS og legge 1 mL av cellen dissosiasjon reagens. Inkuber ved 37 ° C i 5 min koble cellene.
- Legge 9 mL MEM kultur medium, grundig resuspend celle suspensjon og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Justere tettheten av cellen suspensjon til 6 x 104 celler/mL i MEM.
- Legge til 100 µL av cellen suspensjon kontroll og teste brønnene av en steril, flat bunn, vev kultur-behandlet 96-brønns plate (figur 1A).
- Legg 100 µL av MEM kultur medium tom brønner i 96-brønnen platen (figur 1A).
- Inkuber 96-brønns platen ved 37 ° C i 24 timer.
Merk: En 24-timers inkubasjon er en passende tid å teste endogene HDAC aktivitet i HeLa celler. Ulike celletyper med ukjent HDAC aktivitet må en timecourse evaluering av kontroll celler.
2. cellen behandling med Test stoffer og HDAC underlag
- Sug opp mediet fra brønnene av 96-brønns plate.
- Legge til 25 µL av 2 x test forbindelser (f.eks trichostatin A, MS275 og tubastatin A) i MEM teste brønner. Legg til 25 µL av MEM kontroll og tom brønner.
Merk: Konsentrasjonen av testen forbindelser er kan tilpasses en rekke minst 5 siste test konsentrasjoner (en konsentrasjon per brønn). DMSO siste konsentrasjonen i testen sammensatte bør ikke overstige 0,5% og bør være den samme i hver brønn, inkludert mellomrom og kontroller. Siste inkubasjon volumet er 50 µL per brønn. Trichostatin A er testet på 5 konsentrasjoner oppstiller fra 500 å 1,95 nM (1:4 fortynning). MS275 og tubastatin A er testet på 5 konsentrasjoner mellom 8000 6.17 nM (1:6 fortynning). Ønsket endelige testen konsentrasjonen for hver test sammensatte bør fastsettes av hver enkelt bruker ved å opprette en dose-respons kurve. - Legg til 25 µL av underlaget blandingen (42 µM MAL, 42 µM av MOCPAC og 42 µM av BATCP i MEM) kontroll og test. Legg til 25 µL av MEM tom brønner.
Merk: Den siste konsentrasjonen av hver underlaget er 21 µM. MOCPAC og BATCP skille mellom HDAC1 og HDAC6 aktivitet, henholdsvis (figur 1B). Når ingen aktivitet er observert med disse underlag, kan bruk av MAL føre til identifikasjon av aktivitet mot en annen HDAC isoformen. - Inkuber 96-brønns platen ved 37 ° C i 8 timer i en fuktet 5% CO2 inkubator.
Merk: Inkubasjon nå er egnet for HeLa celler og lar den endogene HDAC å samhandle med syntetisk substrater. Forskjellige linjer kan kreve justeringer i inkubasjon tid og/eller substrat konsentrasjon.
3. celle Lysis og prøve forberedelse til UHPLC-ESI--MS-/ MS
Advarsel: Forberedelsene prøve Bruk organiske kjemikalier, som er svært brannfarlig og giftig ved svelging eller innånding. Bruke riktig personlig verneutstyr, som vernehansker og vernebriller.
- Legge til 10 µL av 6 x RIPA buffer (utvannet av 10 x RIPA buffer) med protease hemmer hver brønn av 96-brønns plate.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 160 µL av kald acetonitrile i hver brønn og bland av pipettering opp og ned.
Merk: Holde acetonitrile på 20 ° C før dette trinnet. - Plass platen i en-80 ° C fryseren i 10 min.
- Fjern platen fra fryseren og overføre 220 µL av innholdet i hver brønn til en ikke-steril, koniske bunn (V-nederst) 96-brønns plate. Sentrifuge platen på 5000 x g og 4 ° C i 10 min.
Merk: Dette trinnet tar sikte på å fjerne proteiner og salter. Om nødvendig kan løsninger overført til individuelle konisk sentrifuge rør før sentrifugering eller filtrert gjennom et sett med 96-brønnen, 0,65 µm PVDF filter plater. Vellykket fjerning av bunnfall kreves før UHPLC analyse. - Overføre 200 µL av nedbryting (eller filtratet) til en 96-brønns plate kompatibel med UHPLC systemet og forsegle den med skrellbart, varme-forsegling folie bruker en plate sealer.
Merk: Unngå pipettering pellets når du fjerner supernatants. Hvis UHPLC analysen ikke kan utføres umiddelbart, kan platen lagres ved 4 ° C i opptil 24 timer før analyse.
4. UHPLC/MS-MS analyse
- Forbered UHPLC systemet ved å fylle med mobile fase system (95% A:5% B):
A: H2O, HPLC-klasse, som inneholder 0,1% maursyre (forberede 1 L)
B: Acetonitrile, HPLC-grade, som inneholder 0,1% maursyre (forberede 1 L).
Advarsel: Den mobile fasen inneholder organiske kjemikalier, som er svært brannfarlig og giftig ved svelging eller innånding. Bruke riktig personlig verneutstyr, som vernehansker og vernebriller. - Plass 96-brønns platen inn utvalg som inneholder en plate holder. Kjør prøvene i henhold til UHPLC-ESI--MS-/ MS vilkårene i tabell 1.
Merk: Hver kolonne av analytiske 96-brønns platen bør ha én kontroll godt og en tom brønn (som vist i plate ordningen figur 1A). Kontrollene er representant for 100% enzymatiske aktiviteten i testet celle linjen, mens tomme er der for å sjekke om MS kilden gir konsekvent bakgrunn. Uvanlig MS topper i en gitt tomt bør undersøkes for å hindre MS følsomhet endringer.
5. analyse
- Integrere topp hver substrat og deacetylated produktet med en passende UHPLC integrasjon programvare.
Merk: Bruk automatiske integrasjonen parametere med utjevning metode (betyr størrelsen 3 og antall glatt 2, for eksempel). Bruker brukt kromatografiske vilkår i tabell 1, er elueringsrør rekkefølgen dMAL (5,8 min), dBATCP (6.0 min), dMOCPAC (6.2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8.9 min) og BATCP (9,8 min), som vist i figur 1 c. - For hver underlaget, beregne peak området forholdet (deacetylated/acetylated) i hver chromatogram (test og kontroll eksempler).
- Beregne prosent HDAC hemming av hver testprøven:
Merk: HDAC1 hemming beregnes ved hjelp av peak området forholdet mellom dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 hemming beregnes med dBATCP/BATCP. Forholdet dMAL/MAL kan brukes til å uttrykke generelt HDAC hemming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å demonstrere bruk av metoden å identifisere ikke-selektive og selektiv hemmere for HDAC1 (klasse I) og HDAC6 (klasse IIb), HeLa celler ble behandlet med kjente standard forbindelser: trichostatin A (ikke-selektive mellom HDAC1 og HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiv hemmer)19og tubastatin en (HDAC6-selektiv hemmer)20. Ved hjelp av metoden finnes (figur 1), IC50 verdier kan direkte fastsette i levende celler for HDAC1 (ved å se på MOCPAC deacetylation) og HDAC6 (ved å se på BATCP deacetylation) (figur 2). Trichostatin A var en potent men ikke-selektive hemmer mot HDAC1 og HDAC6. På den annen side, var MS275 selektive for HDAC1, mens tubastatin A var åpenbart selektive for HDAC6.
Figur 2: IC50 Dose-respons kurver samtidig oppnådd for HDAC1 og HDAC6 av tre standard HDAC hemmere: den ikke-selektive trichostatin A HDAC1-selektiv MS275 og den HDAC6-selektiv tubastatin A. IC50 verdier i den tilstøtende tabellen er gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Injeksjon volum | 5 ΜL |
| Kolonne | C18 (2,6 μm, 100 mm x 3 mm-ID) |
| Kolonnen temperatur | 40 ° C |
| Elueringsrør strømningshastighet | 0,8 mL/min (typisk for området: 400-600 barer) |
| Elueringsrør gradering | 5-45% B i 10 min |
| 45-98% B i 2 min | |
| Wash trinn | 98% B i 2 minutter |
| Equilibrating trinn | 5% B i 4 min |
| ESI--MS-/ MS | kjegle spenning, 30 V; kapillær source spenning, 3.0 kV; kapillær temperatur, 350 ° c. kilde temperatur, 120 ° c. skjede gass - nitrogen (600 L/h); kollisjon gasstrykket, argon satt til 3 x 10-3 mbar |
| Kollisjon parametere og reaksjon kanaler optimalisert med en holdetiden 0,1 s, 0,01 s interscan forsinkelser og kollisjon energi satt på 20 eV. | |
| MAL oppdagelsen med masse overganger 446 → 346 (MAL) og 404 → 304 (dMAL). | |
| MOCPAC oppdagelsen med masse overganger 494 → 449 (MOCPAC) og 439 → 394 (dMOCPAC). | |
| BATCP oppdagelsen med masse overganger 500 → 400 (BATCP) og 476 → 376 (dBATCP). |
Tabell 1: UHPLC-ESI-MS/MS forholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HDAC hemming er et hett tema i stoffet funnet, med gjeldende fokus på HDAC6-selektiv hemmere for kreft terapi21. HDAC selektivitet vurderes vanligvis av en rekke høy gjennomstrømning og celle-fri analyser, som akter å bestemme hemmende styrken mot individuelle HDAC isoformene21. Imidlertid selektivitet av en hemmer i tillegg bekreftes i levende celler ved å evaluere acetylation status endogene protein underlag, som histones (for klasse I HDACs) og tubulin (for HDAC6). Derfor celle analyser som involverer antistoff anerkjennelse (f.eks immunostai-, western blot, flowcytometri og ELISA) er vanligvis nødvendig for å oppnå en kvantitativ eller semi kvantitativ vurdering av isoformen styrken av et gitt sammensatt i levende celler21. Det er ikke sjeldne at et stoff som var selektiv i en celle uten enzymatisk analysen viser seg for å være ikke-selektive i eller vev17,22, og vice versa19. Dette kan forklares av forskjeller i ikke standardiserte enzymatisk kilder og fravær av co-faktorer eller protein partnere i biokjemiske analyser21.
Metoden beskrevet her er en rask, antistoff-gratis alternativ slik at for direkte måling av klasse I (HDAC1) og klasse IIb (HDAC6) hemmende styrken i levende celle miljø17. En annen fordel med metoden er at det kan lett tilpasses ulike cellelinjer, for eksempel neuroblasts23, med mulighet for miniatyrisering og automatisering, som beskrevet tidligere andre cellebasert analyser24. Gjenkjenning av bestemte underlag av massespektrometri bidrar til nøyaktig måling av deacetylated produkter, gir kvantitative resultater tilsvarende. Dette er den første metoden for å bestemme IC50 verdier mot bestemte HDAC isoformene i levende celler. Som en sammenligning, ikke-kvantitative selektiv profilen HDAC hemmere observert ved western blot har vist å være i tråd med selektivitet profilen innhentet med metoden beskrevet her17. Selv om denne metoden har blitt utviklet for oppdagelsen av nye klasse-selektiv HDAC hemmere, kan den også brukes for å måle HDAC aktivitet innen celle modeller i løpet av en sykdom. Dette kan bidra til utviklingen av epigenetic og molekylære mekanismer i relevante sykdommer kan potensielt identifisere narkotika kandidater. Lys ekstrapolere denne metoden mot HDAC isoformene enn HDAC1 og HDAC6, er utvikling av nye selektive HDAC underlag sterkt oppmuntret. Videre skal substrat spesifisitet av MOCPAC og BATCP være fullt preget i målretting enkelt isoformene. Faktisk, mens MOCPAC er klassifisert som en HDAC1-spesifikke substrat (klasse I over klasse II), er det mer sannsynlig at det er en generisk klasse I underlaget (inkludert HDAC3 isoformen), som tidligere viste25. Følgelig BATCP er et velkjent HDAC6-selektiv substrat (klasse II over klasse I HDACs), men dens spesifisiteten mot andre klasse II HDACs, som HDAC4, fortjener videre karakterisering25.
Enzymatisk aktivitet kan variere avhengig av den celle linjen, celle tall, confluency og inkubasjon. Når en celle linje brukes for første gang i analysen, er det viktig å teste en rekke substrat konsentrasjoner i kontroll celler, på forskjellige tidspunkt, analysere enzym kinetics av UHPLC-MS (f.eks gjennom en Michaelis-Menten tomt). Dette vil tillate forskere å velge den mest passende inkubasjon tid og underlaget konsentrasjonen. Dette valget er avhengig av to viktige parametere: 1) den enzym kinetics og 2) oppdagelsen av substrater og deres deacetylated produkter. Når analysere enzym kinetikk, er det viktig å vurdere første hastighet verdiene (dvs. når produktet dannelsen er innenfor de lineære) å etablere enzym kinetics. Ifølge kinetikk, bør substrat konsentrasjoner under Km velges å gi en nøyaktig prosentandel av hemming, spesielt i tilfellet konkurransedyktig og utkonkurrert hemmere26. På den annen side, bør valgte substrat konsentrasjonen gi synlig og kvantifiserbare MS signaler for både underlaget og deacetylated produkt (signal-to-noise ratio ≥20)17. Når du bruker flere underlag, sikrer metoden brukt kromatografiske separasjon av alle topper som skal analyseres. Alternative brukt kromatografiske systemer kan kreve endringer i separasjon gradient og kolonnen type.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter pris handling CM1406 (Epigenetic kjemiske biologi). Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av stiftelsen Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
- Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
- Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
- Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
- Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
- Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
- Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
- U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
- Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
- Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
- Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
- Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
- Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
- Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
- Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
- Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
- Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
- Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
- Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).
