Summary
De huidige methode dient ter identificatie van isovorm-specifieke remmers van Histon deacetylases (HDAC) in HeLa cellen door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. Dit is een antilichaam-vrije methode ontwikkeld om te reflecteren van HDAC1 en HDAC6 activiteit in de levende cel omgeving, in tegenstelling tot één-isovorm cel-gratis testen.
Abstract
De zoektocht naar nieuwe histone deacetylase (HDAC) remmers wordt steeds belangstelling voor drugontdekking. Isovorm selectiviteit is in de spotlight sinds de goedkeuring van romidepsin, een klasse ik HDAC remmer voor kankertherapie, en het klinisch onderzoek van HDAC6-specifieke remmers voor multiple myeloma. De huidige methode wordt gebruikt om te bepalen van de inhiberende activiteit van de verbindingen van de test op HDAC1 en HDAC6 in cellen. De isovorm activiteit wordt gemeten met behulp van de ultra-high-performance vloeibare chromatografie-Spectrometrie van de massa (UHPLC-MS) analyse van specifieke substraten geïncubeerd met behandeld en onbehandeld HeLa cellen. De methode heeft het voordeel van de endogene activiteit van het HDAC binnen de cel-omgeving, in tegenstelling tot cel-vrije biochemische tests uitgevoerd op geïsoleerde isoforms weerspiegelt. Bovendien, omdat het is gebaseerd op het kwantificeren van synthetische substraten, de methode hoeft niet de erkenning van het antilichaam van endogene geacetyleerd eiwitten. Het is gemakkelijk aan te passen aan verschillende cellijnen en een geautomatiseerd proces. De methode is al nuttig zijn bij het vinden van HDAC6-selectieve verbindingen in neuroblasten gebleken. Representatieve resultaten worden hier weergegeven met het standaard HDAC remmers trichostatin een (niet-specifieke), MS275 (HDAC1-specifiek), en tubastatin een (HDAC6-specifiek) met behulp van HeLa cellen.
Introduction
HDACs behoren tot een familie van enzymen kunnen deacetylate van histones binnen de structuur van de chromatine. Ook zij hebben andere substraten eiwit in het cytosol en bevinden zich in verschillende compartimenten van de cel. Een totaal van 18 HDAC isoforms tot nu toe hebben geïdentificeerd en verband met verschillende cel mechanismen, met inbegrip van de verordening van transcriptiefactoren genexpressie, alsmede cel signalering en vervoer van1,2,3,4,5,6,7. HDAC katalytische remmers opgedoken als potentiële therapeutische geneesmiddelen voor kankertherapie. Meeste HDAC remmers momenteel goedgekeurd door de FDA zijn voor de behandeling van T-cel lymfoom en multiple myeloma en zijn niet-specifieke HDAC remmers, zoals vorinostat (SAHA), belinostat en panobinostat8,9. Echter een aantal bijwerkingen zijn geassocieerd met pan-remmers, en het zoeken naar isovorm-specifieke kleine moleculen is een hot topic in medicinale chemie en drug discovery. Dienovereenkomstig, de klasse ik (HDAC1-3 en HDAC8) selectieve remmer romidepsin is een reeds goedgekeurde drug10, terwijl HDAC6-specifieke remmers momenteel onder klinische proeven, met verhoogde therapeutisch potentieel in multiple myeloma11,12,13,14,15 zijn.
Screening tests karakteriseren HDAC zijn remmers gebaseerd op de incubatie van een HDAC substraat met een enzymatische bron (één isovorm, nucleaire extract of cel lysate). Het substraat is meestal een kleine peptide-reeks met een acetyl lysine residu gekoppeld aan een cleavable fluorophore (bijvoorbeeld coumarine), zoals N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Om deze te onderscheiden isovorm-specifieke activiteiten, afzonderlijke cel-gratis testen waarbij elke isovorm zijn noodzakelijk en mogelijk niet overeen met de echte isovorm activiteit in levende cellen. Isovorm-specifieke substraten zijn commercieel verkrijgbaar, zoals benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 specifieke substraat) en (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic zuur tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 specifieke substraat) (figuur 1B). Echter toestaat een meer-substraat-mengsel dat MAL bevat, MOCPAC en BATCP gegeven aan levende cellen niet de detectie van de afzonderlijke deacetylated producten door fluorimetrische meting, gezien het feit dat zij de zelfde cleavable fluorophore dragen.
De hier beschreven methode zorgt voor de detectie en kwantificering van de relatieve van elk substraat en haar deacetylated product in HeLa cellen met behulp van een meer-substraat assay gevolgd door UHPLC-ESI-MS/MS analyse17. Een HDAC-test is uitgevoerd op HeLa cellen om de directe identificatie van HDAC inhiberende activiteit en van de specificiteit van de test verbindingen op endogene HDACs. Er is een focus op HDAC1 en HDAC6, die gelijktijdig worden geëvalueerd. Om te bereiken deze enzymatische metingen in een enkele incubatie assay, wordt een mengsel van niet-specifieke en specifieke HDAC substraten toegevoegd aan behandeld en onbehandeld HeLa cellen verguld op een 96-wells-plaat. Na een incubatie stap, zijn cellen lysed de substraten en hun respectieve reactieproducten, die worden gescheiden en ontdekt een UHPLC-MS methode (Figuur 1 c) vrij te laten. De deacetylated producten van de MAL, MOCPAC en BATCP substraten zijn de deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) en deacetylated BATCP (dBATCP), respectievelijk. Dosis / respons-curven kunnen worden gebouwd met actieve verbindingen.
Figuur 1: algemene regeling voor de cel-gebaseerde HDAC assay te identificeren van HDAC1 - en HDAC6-specifieke remmers door de UHPLC-MS-analyse van meerdere substraten. (A) schema van een typische 96-wells-plaat met behandeld (test verbindingen) onbehandeld (control) HeLa cellen, alsmede cel-vrij leeg. (B) chemische structuur van substraten toegevoegd als een mengsel (elke 21 µM) door endogene HDACs worden deacetylated. (C) UHPLC-MS (normaal) chromatografische tonen de pieken van de toegevoegde substraten (MAL, MOCPAC en BATCP) en hun deacetylated producten (dMAL, dMOCPAC, en dBACTP, respectievelijk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de celkweek
Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd in een standaard weefselkweek kap. Vertrouwdheid met steriele techniek wordt verwacht.
- Cultuur van HeLa cellen naar 80% confluentie in een maatkolf van T75 cel cultuur in MEM aangevuld met 10% foetale runderserum, penicilline G (100 U/mL), en streptomycine (100 mg/mL).
Opmerking: Cultuur, behandeling en stappen van lysis van de cel worden uitgevoerd onder laminaire flow, met stappen van cel incubatie bij 37 ° C uitgevoerd in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 onder steriele omstandigheden. - Wassen van de cellen tweemaal met 5 mL van de DPBS, de DPBS gecombineerd en voeg 1 mL cel dissociatie reagens. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen los te maken.
- Voeg 9 mL MEM kweekmedium grondig resuspendeer de celsuspensie en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie tot 6 x 104 cellen/mL in MEM.
- Voeg 100 µL celsuspensie aan controle en test van de putten van een steriele flat-bodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat (figuur 1A).
- Breng 100 µL cultuurmedium MEM in lege putjes van de 96-wells-plaat (figuur 1A).
- Incubeer de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur.
Opmerking: Een 24u incubatie is een geschikte tijd om te testen voor de endogene activiteit van HDAC in HeLa cellen. Verschillende soorten cellen met onbekende HDAC activiteit wellicht een evaluatie van de timecourse van cellen.
2. cel behandeling met Test verbindingen en HDAC substraten
- Het medium van de putjes van de 96-wells-plaat gecombineerd.
- Voeg 25 µL van 2 x test verbindingen (bijvoorbeeld, trichostatin A, MS275, en tubastatin A) in MEM voor het testen van putten. Voeg toe 25 µL van MEM aan controle en lege wells.
Opmerking: De concentratie aan test verbindingen is worden aangepast om te zorgen voor een scala van ten minste 5 laatste testconcentraties (één concentratie per putje). De uiteindelijke concentratie van DMSO in de teststof mag niet hoger zijn dan 0,5% en moet hetzelfde zijn in elk putje, met inbegrip van spaties en besturingselementen. De definitieve incubatie volumewaarde bedraagt 50 µL per putje. Trichostatin A is getest bij 5 concentraties variërend van 500 tot 1.95 nM (in de verdunning 1:4). MS275 en tubastatin A worden getest bij 5 concentraties variërend van 8.000 tot 6.17 nM (in de verdunning 1:6). De gewenste uiteindelijke testconcentratie voor elke teststof moet worden bepaald door elke individuele gebruiker door het creëren van een dosis-responscurve. - Voeg toe 25 µL van het mengsel van substraat (42 µM van MAL, 42 µM van MOCPAC en 42 µM van BATCP in MEM) aan controle en test putjes. Voeg toe 25 µL van MEM aan lege putjes.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elk substraat is 21 µM. MOCPAC en BATCP onderscheid maken tussen HDAC1 en HDAC6 activiteit, respectievelijk (figuur 1B). Wanneer geen activiteit wordt waargenomen met deze substraten, kan het gebruik van de MAL leiden tot de identificatie van activiteit tegen een ander HDAC isovorm. - Incubeer de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 8 uur in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
Opmerking: Deze incubatietijd is geschikt voor HeLa cellen en laat de endogene HDAC om te interageren met de synthetische substraten. Verschillende cellijnen kunnen aanpassingen in incubatie tijd en/of substraat concentratie vereisen.
3. cel Lysis en bereiding van de monsters voor UHPLC-ESI-MS/MS
Let op: Gebruik de sample voorbereiding stappen organische chemische stoffen, die zeer brandbaar en giftig bij inslikken of inhalatie zijn. Draag passende persoonlijke bescherming, zoals handschoenen en veiligheidsbril.
- Voeg 10 µL van 6 x RIPA buffer (verdund uit 10 x RIPA buffer) aangevuld met proteaseinhibitor aan elk putje van de 96-wells-plaat.
- Zet de reactie stop door 160 µL van koude acetonitril toe te voegen aan elk putje en meng door pipetteren omhoog en omlaag.
Opmerking: Houd de acetonitril bij-20 ° C vóór deze stap. - Plaats de plaat in een vriezer-80 ° C gedurende 10 minuten.
- Verwijderen de plaat uit de vriezer en 220 µL van de inhoud van elk putje overbrengen in een niet-steriele, conische bodem (V-bodem) 96-wells-plaat. Centrifugeer de plaat duikt met 5.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten.
Opmerking: Deze stap is gericht op het wegnemen van eiwitten en zouten. Indien nodig, kunnen de oplossingen worden overgebracht naar afzonderlijke conische centrifuge buizen vóór centrifugeren of gefilterd door middel van een set van 96-Wells, 0.65 µm PVDF filter platen. Het succesvol verwijderen van de neerslag is vereist vóór de UHPLC analyse. - Breng 200 µL van supernatant (of filtraat) in een compatibel met de UHPLC-systeem 96-wells-plaat en verzegel het met gelamineerde, heat-sealing folie, met behulp van een plaat sealer.
Opmerking: Vermijd de pellets pipetteren bij het verwijderen van het supernatant. Als de UHPLC-analyse kan niet onmiddellijk worden uitgevoerd, kan de plaat bij 4 ° C voor een maximum van 24 uur tot analyse worden opgeslagen.
4. UHPLC/MS-MS-analyse
- Bereid de UHPLC-systeem door het te vullen met het systeem van de mobiele fase (95% A:5% B):
A: H2O, HPLC-kwaliteit, met 0,1% mierenzuur (bereiden 1 L)
B: acetonitril, HPLC-kwaliteit, met 0,1% mierenzuur (bereiden 1 L).
Let op: De mobiele fase bevat organische chemische stoffen, die zeer brandbaar en giftig bij inslikken of inhalatie zijn. Draag passende persoonlijke bescherming, zoals handschoenen en veiligheidsbril. - De 96-wells-plaat in de manager van de steekproef met een plaat houder plaatsen. Voer de monsters volgens de voorwaarden van de UHPLC-ESI-MS/MS in tabel 1gegeven.
Opmerking: Voor elke kolom van de analytische 96-wells-plaat moet één besturingselement goed en één lege goed (zoals afgebeeld in het schema van de plaat van de figuur 1A). Besturingselementen zijn representatief voor 100% enzymatische activiteit in de geteste cellijn, terwijl blanks er zijn om te controleren of de bron van MS is het verstrekken van consistente achtergrond. Ongewone MS pieken gedetecteerd in een bepaalde leeg moeten worden onderzocht om MS gevoeligheid wijzigingen te voorkomen.
5. de gegevensanalyse
- Integreer de piekoppervlakte van elk substraat en haar deacetylated product met een juiste UHPLC integratie software.
Opmerking: Automatische integratie parameters gebruiken met een vloeiend methode (gemiddelde venstergrootte 3 en aantal glad 2, bijvoorbeeld). Met behulp van de in tabel 1vastgestelde chromatografische voorwaarden, is de volgorde van de elutie dMAL (5.8 min), dBATCP (6.0 min), dMOCPAC (6.2 min), MAL (7.6 min), MOCPAC (8.9 min) en BATCP (9,8 min), zoals afgebeeld in Figuur 1 c. - Voor elke ondergrond, berekenen de piek gebied ratio (deacetylated/geacetyleerd) in elke chromatografische (test- en monsters).
- Bereken het percentage HDAC remming van elk monster:
Opmerking: Inhibitie van de HDAC1 wordt berekend met behulp van de piek gebied verhouding van dMOCPAC/MOCPAC; Inhibitie van de HDAC6 wordt berekend met dBATCP/BATCP. De verhouding dMAL/MAL kan worden gebruikt om algemene HDAC inhibition express.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen van de toepassing van de methode voor het identificeren van niet-selectieve en selectieve remmers voor HDAC1 (klasse I) en HDAC6 (klasse IIb), HeLa cellen werden behandeld met bekende standaard verbindingen: trichostatin A (niet-selectieve tussen HDAC1 en HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selectieve remmer)19en tubastatin een (HDAC6-selectieve remmer)20. Met de huidige methode (Figuur 1), IC50 waarden kon worden direct vastgesteld in levende cellen voor HDAC1 (door te kijken naar MOCPAC deacetylation) en HDAC6 (door te kijken naar BATCP deacetylation) (Figuur 2). Trichostatin A was een krachtige maar niet-selectieve inhibitor naar HDAC1 en HDAC6. Aan de andere kant, was MS275 selectieve voor HDAC1, terwijl tubastatin A duidelijk selectief voor HDAC6 was.
Figuur 2: IC50 dosis / respons-curven gelijktijdig verkregen voor HDAC1 en HDAC6 van drie standaard HDAC remmers: de niet-selectieve trichostatin A, de HDAC1-selectieve MS275 en de HDAC6-selectieve tubastatin A. IC50 waarden in de aangrenzende tabel gepresenteerd zijn de gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke metingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Geïnjecteerd volume | 5 ΜL |
| Kolom | C18 (2.6 μm, 100 x 3 mm ID) |
| Kolomtemperatuur | 40 ° C |
| Elutie debiet | 0,8 mL/min (typisch drukbereik: 400-600 bars) |
| Elutie verloop | 5-45% B in 10 min |
| 45-98% B in 2 min | |
| Wassen van stap | 98% B gedurende 2 minuten |
| Zo stap | 5% B voor 4 min |
| ESI-MS/MS | kegel spanning, 30 V; capillaire voedingsspanning, 3.0 kV; capillaire temperatuur, 350 ° C; de temperatuur van de bron, 120 ° C; schede gas - stikstof (600 L/h); botsing gasdruk, argon ingesteld op 3 x 10-3 mbar |
| Botsing parameters en reactie kanalen geoptimaliseerd met een Nadruktijd van 0,1 s, 0,01 s van interscan vertragingen en botsing energie vastgesteldop 20 eV. | |
| MAL detectie met massale overgangen 446 → 346 (MAL) en 404 → 304 (dMAL). | |
| MOCPAC detectie met massale overgangen 494 → 449 (MOCPAC) en 439 → 394 (dMOCPAC). | |
| BATCP detectie met massa overgangen 500 → 400 (BATCP) en 476 → 376 (dBATCP). |
Tabel 1: UHPLC-ESI-MS/MS voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HDAC inhibition is een hot topic in de Geneesmiddelenontwikkeling, met een huidige focus op HDAC6-selectieve remmers voor kanker therapie21. HDAC selectiviteit wordt meestal beoordeeld door een reeks van high-throughput, cel-gratis tests, die voornemens zijn te bepalen van de remmende potentie naar individuele HDAC isoforms21. Echter de selectiviteit van een remmer moet bovendien bevestigd worden in levende cellen door de beoordeling van de status van de acetylation van endogene eiwit substraten, zoals histones (voor klasse I HDACs) en tubuline (voor HDAC6). Daarom, cel testen antilichaam erkenning (bijvoorbeeld immunokleuring, westelijke vlek stroom cytometry en ELISA) waarbij meestal nodig zijn om een kwantitatieve of semi-kwantitatieve evaluatie van de isovorm potentie van een bepaalde stof in levende cellen21. Het is niet ongewoon dat een stof die selectief in een cel-vrije enzymatische assay was blijkt te zijn niet-selectieve in cellen of weefsels17,22, en vice versa19. Dit kan worden verklaard door verschillen in niet-gestandaardiseerde enzymatische bronnen en het ontbreken van cofactoren of eiwit partners in biochemische tests21.
De hier beschreven methode is een alternatief van het snelle, antilichaam-vrij waardoor de rechtstreekse meting van klasse I (HDAC1) en klasse IIb (HDAC6) remmende potentie in de levende cel milieu17. Een ander voordeel van de methode is dat het gemakkelijk aangepast aan verschillende cellijnen, zoals neuroblasten23, met de mogelijkheid voor miniaturisatie en automatisering, zoals eerder is beschreven voor andere cel-gebaseerde testen24 worden kan. Het opsporen van specifieke substraten door massaspectrometrie draagt bij aan de nauwkeurige meting van de deacetylated producten, bieden vergelijkbare kwantitatieve resultaten. Dit is de eerste methode beschikbaar voor het vaststellen van IC50 waarden naar specifieke HDAC isoforms in levende cellen. Als een kwestie van vergelijking, de niet-kwantitatieve selectieve Profiel van HDAC remmers waargenomen door westelijke vlek zijn aangetoond om in overeenstemming met het profiel van de selectiviteit verkregen met de methode hier17beschreven. Zelfs als deze methode is ontwikkeld voor de ontdekking van de nieuwe klasse-selectieve remmers van de HDAC, kan het ook worden toegepast voor het meten van HDAC activiteit binnen de cel modellen in de loop van een ziekte. Dit kan bijdragen aan de opheldering van de epigenetische en moleculaire mechanismen in relevante ziekten en potentieel drugkandidaten kon identificeren. Met het oog op de extrapolatie van deze methode naar HDAC isoforms dan HDAC1 en HDAC6, wordt de ontwikkeling van nieuwe selectieve HDAC substraten sterk aangemoedigd. Bovendien, de specificiteit van de substraat van MOCPAC en BATCP moet volledig worden gekarakteriseerd in termen van één isoforms targeting. Inderdaad, terwijl MOCPAC is geclassificeerd als een HDAC1-specifieke substraat (klasse I over klasse II), het is waarschijnlijker dat er een algemene klasse I substraat (met inbegrip van HDAC3 isovorm), als eerder bewezen25. Dienovereenkomstig, BATCP is een bekende HDAC6-selectieve substraat (klasse II meer dan klasse I HDACs), maar zijn specificiteit naar andere klasse II HDACs, zoals HDAC4, verdient nadere karakterisering25.
Enzymatische activiteit kan verschillen afhankelijk van de cellijn, cel nummer, confluentie en incubatie tijd. Wanneer een cellijn wordt gebruikt voor de eerste keer in de analyse, is het belangrijk voor het testen van een aantal uiteenlopende concentraties van het substraat in cellen, op verschillende tijdstippen, voor het analyseren van de enzymkinetiek door UHPLC-MS (bijvoorbeeld via een Michaelis-Menten kavel). Hierdoor kunnen onderzoekers om te kiezen van de meest geschikte incubatie tijd en substraat concentratie. Deze keuze is gebaseerd op twee belangrijke parameters: 1) de enzymkinetiek en 2) het opsporen van de substraten en hun deacetylated producten. Wanneer het analyseren van Enzymkinetiek, is het essentieel om te evalueren van de beginsnelheid waarden (dat wil zeggen, wanneer de productvorming binnen het lineaire bereik) om vast te stellen van de enzymkinetiek. Volgens de kinetiek, moeten substraat concentraties onder de Km worden gekozen om een accuraat percentage van inhibitie, vooral in het geval van concurrerende en niet-concurrerende remmers26. Aan de andere kant, de concentratie van de gekozen substraat moet aantoonbaar en kwantificeerbare MS signalen geven voor zowel het substraat en het deacetylated product (signal-to-noise verhouding ≥20)17. Wanneer u meerdere substraten, moet de chromatografische methode de scheiding van alle pieken te analyseren. Alternatieve chromatografiesystemen mogelijk wijzigingen in de scheiding verloop en kolom type vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen kosten actie CM1406 (epigenetische chemische biologie). Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de Stichting Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
- Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
- Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
- Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
- Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
- Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
- Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
- U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
- Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
- Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
- Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
- Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
- Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
- Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
- Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
- Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
- Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
- Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
- Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).
